用于促进细胞功能、遗传稳定性和再生应用的核苷补充的制作方法

用于促进细胞功能、遗传稳定性和再生应用的核苷补充的制作方法
【专利摘要】在各种实施方案中，提供一种用于培养具有提高的遗传稳定性、细胞功能和再生能力的干细胞的细胞培养基或核苷混合物传递(NCT)介质。说明性培养基包括用于干细胞的基础培养基，其中所述培养基补充有一种或多种三磷酸核苷(例如，dNTP和/或NP)或其一种或多种前体。说明性NCT介质包括递送媒介物(例如，皮肤乳剂或其他媒介物)，所述递送媒介物含有一种或多种三磷酸核苷(例如，dNTP和/或NP)或其一种或多种前体。所述NCT介质尤其提供核苷混合物进入人组织(如皮肤)中的直接递送以达再生、化妆和/或治疗目的。
【专利说明】用于促进细胞功能、遗传稳定性和再生应用的核苷补充
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2013年10月16日提交的USSN 61/891,846的权益和优先权，其以全文 引用的方式并入本文以达所有目的。
[0003] 政府资助声明
[0004] [不适用]
[0005] 背景
[0006] 尽管诱导型多能干细胞（iPSC)与胚胎干细胞(ESC)共有较大相似性，但是用于 iPSC衍生的体细胞重编程方法已经引起关于新细胞类型的科学兴趣和关注。在iPSC以及 ESC的衍生和延长培养期间，除了关于在亚最佳补充环境条件中的亚标准/亚生理细胞功能 (如亚最佳增殖和分化）的明显关注之外，存在关于所述iPSC以及ESC的基因组完整性和稳 定性的重要的生物安全性关注。人诱导型多能干细胞(或其他干细胞或体细胞)在研究、化 妆品和治疗/再生应用中的有用性高度地依赖于多能干细胞的基因组完整性、稳定性和功 能性。某些基因组或表观基因组异常可能不仅有损分化潜力，而且在基于iPSC的疗法的受 体中引起肿瘤发生。已经观察到基因组异常，如核型畸变，如染色体数目和结构的改变;拷 贝数变化(CNV)，如亚核型或亚染色体扩增和缺失；由于获得性单亲二倍体的杂合性损失 (L0H);和外来DNA进入宿主基因组中的随机或位点特异性整合。
[0007] 研究表明：使用当前方法衍生的各种体细胞和干细胞以及基本上所有IPSC克隆在 重编程和体外培养诱导的应力期间除了拥有亚标准生理学（如，受损细胞增殖)之外，还获 得基因组不稳定性(Martins-Taylor和Xu(2012)Stem Cells 30: 22-27;Lund等人（2012) Nat. Rev .Genet .，13:732-744)。在给定基因组不稳定性与增加的恶性转变风险之间的已建 立联系的情况下，hiPSC基因组不稳定性的问题是在将基于个体化iPSC的再生疗法推进到 诊所方面最重要的瓶颈之一(Martins-Taylor和Xu(2012)Stem Cells 30:22-27;Lund等人 (2012)Nat.Rev.Genet13:732-744；Byrne(2013)Gene Therapy and Regulation 7: 1230002)。
[0008] 在hiPSC重编程和培养期间并且实际上针对其他多能干细胞(如人胚胎干细胞)和 成体干细胞（如神经干细胞、间充质干细胞和真皮干细胞)来说，基因组不稳定性和受损细 胞生理学的原因是不明的，并且仍有待开发出用于减少并最终消除这种高度有害现象的发 生的方法。
[0009] 概述
[0010] 已经发现:干细胞和体细胞的基因组完整性、稳定性和功能性可通过核苷（例如， 脱氧核糖核苷）的外源性补充而加强。这种核苷补充物(称为核苷混合物(NC)，或在某些实 施方案中称为脱氧核糖核苷混合物(DC)可用于加强细胞培养基或可与递送媒介物组合以 产生核苷混合物传递（NCT)介质，或在某些实施方案中产生脱氧核糖核苷传递混合物 (DCT)。除了提高基因组稳定性之外，这种补充还可增强细胞功能（例如，通过加速细胞增 殖、促进分化成目标治疗细胞类型（如肝细胞），和/或促进人组织再生（如刺激人皮肤细胞 在体内分裂以达再生目的)来增强。
[0011] 此外，观察到：人皮肤成纤维细胞暴露于核苷混合物可以显著加强的速率刺激增 殖，并且当与如皮肤乳剂的核苷传递介质组合时，这种现象可证明在直接再生/焕新人皮肤 或其他组织方面是极为有用的。
[0012] 核苷混合物不仅提高基因组稳定性，它还显著地加强多种体细胞和干细胞的增殖 速率，另外还加强多能干细胞向目标细胞类型(如用于肝疾病的治疗的肝细胞)的分化。
[0013] 因此，一些实施方案提供用于体细胞和干细胞的基础培养基，其中所述培养基补 充有一种或多种三磷酸核苷（例如，dNTP和/或NTP)或其一种或多种前体。其他实施方案将 一种或多种三磷酸核苷(例如，dNTP和/或NTP)或其一种或多种前体与体内使用的局部和/ 或递送机制组合，所述局部和/或递送机制包括但不限于：1)皮肤乳剂、2)局部化妆品和/或 3)外在递送机制(EDM)，如可注射剂、摄取、吸入或其他。
[0014] 因此，在各种方面中，本文中涵盖的本发明可包括但无需限于以下实施方案中的 任何一个或多个：
[0015] 在各种方面中，本文中涵盖的本发明可包括但无需限于以下实施方案中的任何一 个或多个：
[0016] 实施方案1: 一种用于培养具有提高的遗传稳定性的干细胞的细胞培养基，所述培 养基包括:用于干细胞的基础培养基，其中所述培养基补充有一种或多种三磷酸核苷或其 一种或多种前体。
[0017] 实施方案2:-种用于提高体细胞或干细胞遗传稳定性的核苷混合物传递(NCT)介 质，所述介质包括:化妆品或药物媒介物;和一种或多种三磷酸核苷或其前体。
[0018] 实施方案3:如实施方案1的细胞培养基或如实施方案2的核苷混合物传递介质，其 中所述一种或多种三磷酸核苷独立地选自由以下各项组成的组:三磷酸脱氧腺苷(dATP)、 三磷酸脱氧鸟苷（dGTP)、三磷酸脱氧胞苷(NCTP)、三磷酸脱氧胸苷(dTTP)、三磷酸脱氧尿 苷、三磷酸腺苷(ATP)、三磷酸鸟苷(GTP)、三磷酸胞苷（CTP)、三磷酸5-甲基尿苷(m5UTP)和 三磷酸尿苷(UTP)。
[0019] 实施方案4:如实施方案1的细胞培养基或如实施方案2的核苷混合物传递介质，其 中所述一种或多种三磷酸核苷独立地选自由以下各项组成的组:三磷酸脱氧腺苷(dATP)、 三磷酸脱氧鸟苷(dGTP)、三磷酸脱氧胞苷(NCTP)、三磷酸脱氧胸苷(dTTP)和三磷酸脱氧尿 苷。
[0020] 实施方案5:如实施方案1的细胞培养基或如实施方案2的核苷混合物传递介质，其 中所述一种或多种三磷酸核苷独立地选自由以下各项组成的组:三磷酸腺苷(ATP)、三磷酸 鸟苷(GTP)、三磷酸胞苷(CTP)、三磷酸5-甲基尿苷(m5UTP)和三磷酸尿苷(UTP)。
[0021] 实施方案6:根据实施方案1和3-5中任一实施方案的细胞培养基或根据实施方案 2-5中任一实施方案的核苷混合物传递介质，其中所述培养基补充有或所述NCT介质包括独 立地选自由以下各项组成的组的三磷酸核苷的一种或多种前体:三磷酸脱氧腺苷(dATP)、 三磷酸脱氧鸟苷（dGTP)、三磷酸脱氧胞苷(NCTP)、三磷酸脱氧胸苷(dTTP)、三磷酸脱氧尿 苷、三磷酸腺苷(ATP)、三磷酸鸟苷(GTP)、三磷酸胞苷（CTP)、三磷酸5-甲基尿苷(m5UTP)和 三磷酸尿苷(UTP)。
[0022] 实施方案7:如实施方案6的细胞培养基或NCT介质，其中三磷酸核苷的所述一种或 多种前体独立地选自由以下各项组成的组：三磷酸脱氧腺苷（dATP)、三磷酸脱氧鸟苷 (dGTP)、三磷酸脱氧胞苷(NCTP)、三磷酸脱氧胸苷(dTTP)和三磷酸脱氧尿苷。
[0023] 实施方案8:如实施方案6的细胞培养基或NCT介质，其中三磷酸核苷的所述一种或 多种前体独立地选自由以下各项组成的组:三磷酸腺苷(ATP)、三磷酸鸟苷(GTP)、三磷酸胞 苷(CTP)、三磷酸5-甲基尿苷(m5UTP)和三磷酸尿苷(UTP)。
[0024] 实施方案9:根据实施方案1和3-8中任一实施方案的细胞培养基或根据实施方案 3-8中任一实施方案的NCT介质，其中所述培养基补充有或所述NCT介质包括三磷酸脱氧腺 苷(dATP)或其前体。
[0025] 实施方案10:如实施方案9的细胞培养基或NCT介质，所述培养基补充有或所述NCT 介质包括三磷酸脱氧腺苷。
[0026] 实施方案11:如实施方案9的细胞培养基或NCT介质，所述培养基补充有或所述NCT 介质包括三磷酸脱氧腺苷的前体。
[0027]实施方案12:如实施方案11的细胞培养基或NCT介质，其中三磷酸脱氧腺苷的所述 前体选自由以下各项组成的组:二磷酸脱氧腺苷、单磷酸脱氧腺苷、脱氧腺苷和腺嘌呤。
[0028] 实施方案13:根据实施方案1和3-12中任一实施方案的细胞培养基或根据实施方 案2-12中任一实施方案的NCT介质，其中所述培养基补充有或所述NCT介质包括三磷酸脱氧 鸟苷(dGTP)或其前体。
[0029] 实施方案14:根据实施方案13的细胞培养基或NCT介质，其中所述细胞培养基补充 有或所述NCT介质包括三磷酸脱氧鸟苷。
[0030] 实施方案15:根据实施方案13的细胞培养基或NCT介质，其中所述细胞培养基补充 有或所述NCT介质包括三磷酸脱氧鸟苷的前体。
[0031] 实施方案16:如实施方案15的细胞培养基或NCT介质，其中三磷酸脱氧鸟苷的所述 前体选自由以下各项组成的组:二磷酸脱氧鸟苷、单磷酸脱氧鸟苷、脱氧鸟苷和鸟嘌呤。
[0032] 实施方案17:根据实施方案1和3-16中任一实施方案的细胞培养基或根据实施方 案2-16中任一实施方案的NCT介质，其中所述培养基补充有或所述NCT介质包括三磷酸脱氧 胞苷(NCTP)或其前体。
[0033] 实施方案18:如实施方案17的细胞培养基或NCT介质，其中所述细胞培养基补充有 或所述NCT介质包括三磷酸脱氧胞苷。
[0034] 实施方案19:如实施方案17的细胞培养基或NCT介质，其中所述细胞培养基补充有 或所述NCT介质包括三磷酸脱氧胞苷的前体。
[0035]实施方案20:如实施方案19的细胞培养基或NCT介质，其中脱氧胞苷的前体选自由 以下各项组成的组:二磷酸脱氧胞苷、单磷酸脱氧胞苷、脱氧胞苷和胞嘧啶。
[0036] 实施方案21:根据实施方案1和3-20中任一实施方案的细胞培养基或根据实施方 案2-20中任一实施方案的NCT介质，其中所述培养基补充有或所述NCT包括三磷酸脱氧胸苷 (dTTP)或其前体。
[0037] 实施方案22:如实施方案20的细胞培养基或NCT介质，其中所述培养基补充有或所 述NCT介质包括三磷酸脱氧胸苷。
[0038]实施方案23:如实施方案20的细胞培养基或NCT介质，其中所述培养基补充有或所 述NCT介质包括三磷酸脱氧胸苷的前体。
[0039]实施方案24:如实施方案23的细胞培养基或NCT介质，其中三磷酸脱氧胸苷的所述 前体选自由以下各项组成的组:二磷酸脱氧胸苷、单磷酸脱氧胸苷、脱氧胸苷和胸腺嘧啶。 [0040]实施方案25:根据实施方案1和3-24中任一实施方案的细胞培养基或根据实施方 案2-24中任一实施方案的NCT介质，其中所述培养基或NCT介质补充有三磷酸脱氧尿苷或其 前体。
[0041 ]实施方案26:如实施方案25的细胞培养基或NCT介质，其中所述培养基补充有或所 述NCT介质包括三磷酸脱氧尿苷。
[0042]实施方案27:如实施方案25的细胞培养基或NCT介质，其中所述培养基补充有或所 述NCT介质包括三磷酸脱氧尿苷的前体。
[0043]实施方案28:如实施方案27的细胞培养基或NCT介质，其中三磷酸脱氧尿苷的所述 前体选自由以下各项组成的组:二磷酸脱氧尿苷、单磷酸脱氧尿苷、脱氧尿苷和尿嘧啶。
[0044] 实施方案29:根据实施方案1和3-28中任一实施方案的细胞培养基或根据实施方 案2-28中任一实施方案的NCT介质，其中所述培养基或NCT介质补充有三磷酸腺苷(ATP)或 其前体。
[0045] 实施方案30:如实施方案29的细胞培养基或NCT介质，其中所述培养基补充有或所 述NCT介质包括三磷酸腺苷(ATP)。
[0046] 实施方案31:如实施方案29的细胞培养基或NCT介质，其中所述培养基补充有或所 述NCT介质包括三磷酸腺苷的前体。
[0047]实施方案32:如实施方案31的细胞培养基或NCT介质，其中三磷酸腺苷(ATP)的所 述前体选自由以下各项组成的组:二磷酸腺苷、单磷酸腺苷、腺苷和腺嘌呤。
[0048]实施方案33:根据实施方案1和3-32中任一实施方案的细胞培养基或根据实施方 案2-32中任一实施方案的NCT介质，其中所述培养基补充有或所述NCT介质包括三磷酸鸟苷 (GTP)或其前体。
[0049] 实施方案34:如实施方案33的细胞培养基或NCT介质，其中所述培养基补充有或所 述NCT介质包括三磷酸鸟苷(GTP)。
[0050] 实施方案35:如实施方案33的细胞培养基或NCT介质，其中所述培养基补充有或所 述NCT介质包括三磷酸鸟苷的前体。
[0051] 实施方案36:如实施方案35的细胞培养基或NCT介质，其中三磷酸鸟苷的所述前体 选自由以下各项组成的组:二磷酸鸟苷、单磷酸鸟苷、鸟苷和鸟嘌呤。
[0052]实施方案37:根据实施方案1和3-36中任一实施方案的细胞培养基或根据实施方 案2-36中任一实施方案的NCT介质，其中所述细胞培养基补充有或所述NCT介质包括三磷酸 胞苷(CTP)或其前体。
[0053]实施方案38:如实施方案37的细胞培养基或NCT介质，其中所述培养基补充有或所 述NCT介质包括三磷酸胞苷。
[0054]实施方案39:如实施方案37的细胞培养基或NCT介质，其中所述培养基补充有或所 述NCT介质包括三磷酸胞苷的前体。
[0055]实施方案40:如实施方案39的细胞培养基或NCT介质，其中三磷酸胞苷的所述前体 选自由以下各项组成的组:二磷酸胞苷、单磷酸胞苷、胞苷和胞嘧啶。
[0056]实施方案41:根据实施方案1和3-40中任一实施方案的细胞培养基或根据实施方 案2-40中任一实施方案的NCT介质，其中所述培养基或NCT介质补充有三磷酸5-甲基尿苷 (m5UTP)或其前体。
[0057]实施方案42:如实施方案41的细胞培养基或NCT介质，其中所述培养基补充有或所 述NCT介质包括三磷酸5-甲基尿苷。
[0058]实施方案43:如实施方案41的细胞培养基或NCT介质，其中所述培养基补充有或所 述NCT介质包括三磷酸5-甲基尿苷的前体。
[0059]实施方案44:如实施方案43的细胞培养基或NCT介质，其中三磷酸5-甲基尿苷的所 述前体选自由以下各项组成的组:二磷酸5-甲基尿苷、单磷酸5-甲基尿苷、5-甲基尿苷和胸 腺嘧啶。
[0060]实施方案45:根据实施方案1和3-44中任一实施方案的细胞培养基或根据实施方 案2-44中任一实施方案的NCT介质，其中所述培养基补充有或所述NCT介质包括三磷酸尿苷 (UTP)或其前体。
[00611实施方案46:如实施方案45的细胞培养基或NCT介质，其中所述培养基补充有或所 述NCT介质包括三磷酸尿苷。
[0062]实施方案47:如实施方案45的细胞培养基或NCT介质，其中所述培养基补充有或所 述NCT介质包括三磷酸尿苷的前体。
[0063]实施方案48:如实施方案47的细胞培养基或NCT介质，其中三磷酸尿苷的前体选自 由以下各项组成的组:二磷酸尿苷、单磷酸尿苷、尿苷和尿嘧啶。
[0064]实施方案49:根据实施方案2-48中任一实施方案的核苷混合物传递(NCT)介质，其 中所述NCT介质包括媒介物，所述媒介物被配制用于通过选自由以下各项组成的组的路线 进行施用：皮下施用、肠胃外施用、表皮施用（topical administration)、口服施用、鼻部或 吸入施用、如通过涂料、气溶胶或以透皮方式的局部施用。
[0065]实施方案50:根据实施方案2-48中任一实施方案的核苷混合物传递(NCT)介质，其 中所述NCT介质包括媒介物，所述媒介物被配制用于表皮施用、皮下施用或皮内施用。
[0066]实施方案51:如实施方案50的核苷混合物传递(NCT)介质，其中所述介质被配制在 选自由以下各项组成的组的媒介物中：泥剂、草药混合物、脂肪、乳液、洗剂、乳剂、凝胶、生 物剂、溶液、喷剂、膏剂、泡沫、摩丝、液体、混悬液、分散液、气溶胶、皂、香波和调理剂。
[0067]实施方案52:如实施方案50的核苷混合物传递(NCT)介质，其中所述介质被配制为 乳剂(例如，面部乳剂）。
[0068]实施方案53:根据实施方案56-58中任一实施方案的核苷混合物传递(NCT)介质， 其中所述介质包括选自由以下各项组成的组的制剂:皱纹去除乳剂、真皮填充剂、祛疤乳剂 和痤疮治疗物。
[0069]实施方案54:根据实施方案1和3-48中任一实施方案的细胞培养基或根据实施方 案2-53中任一实施方案的核苷混合物传递(NCT)介质，其中补充所述培养基或包括所述NCT 介质的所述三磷酸核苷或其前体是以足以提高干细胞的短期和/或长期遗传稳定性的浓度 存在，所述提高是与没有通过三磷酸核苷或其前体补充的相同培养基中培养的相同细胞相 比较而言。
[0070]实施方案55:如实施方案54的细胞培养基或核苷混合物传递(NCT)介质，其中所述 干细胞是选自由以下各项组成的组的干细胞:体细胞(例如，成纤维细胞)或干细胞(例如， 神经干细胞、间充质干细胞、造血干细胞、脂肪干细胞、胚胎干细胞、脐带干细胞和诱导型多 能干细胞）。
[0071]实施方案56:根据实施方案1、3-48和54-55中任一实施方案的细胞培养基或根据 实施方案2-55中任一实施方案的NCT介质，其中补充所述培养基或包括所述NCT介质的每一 种三磷酸核苷或其前体是以在以下范围变化的浓度(例如，在传递介质中的浓度和/或在体 内在目标细胞上产生这种浓度，如使用皮肤乳剂作为NCT介质将核苷混合物外在递送到人 皮肤中的情况)存在：约lyM直至约50處，或约lyM至约40處，或约1處直至约35處，或约1處直 至约30yM。
[0072]实施方案57:根据实施方案1、3-48和54-55中任一实施方案的细胞培养基或根据 实施方案2-55中任一实施方案的NCT介质，其中补充所述培养基或包括在所述NCT介质中的 每一种三磷酸核苷或其前体是处于开始(储备)为或最终(外在递送)为以下各项的浓度:约 50yM或更低，或约40yM或更低，或约30yM或更低，或约25yM或更低，或约20yM或更低，或约15 yM或更低，或约1 OyM或更低，或约5yM或更低。
[0073] 实施方案58:如实施方案57的细胞培养基或NCT介质，其中补充所述培养基或包括 在所述NCT介质中的每一种三磷酸核苷或其前体是以在约5yM至约30yM范围变化的开始(储 备)或最终(外在递送)浓度存在。
[0074] 实施方案59:如实施方案57的细胞培养基或NCT介质，其中补充所述培养物所述培 养基或包括在所述NCT介质中的每一种三磷酸核苷或其前体是以约30yM的开始(储备)或最 终(外在递送)浓度存在。
[0075] 实施方案60:如实施方案57的细胞培养基或NCT介质，其中补充所述培养基或包括 在所述NCT介质中的每一种三磷酸核苷或其前体是以约5yM的开始（储备）或最终（外在递 送)浓度存在。
[0076]实施方案61:根据实施方案1、3_48和54-60中任一实施方案的细胞培养基或根据 实施方案2-60中任一实施方案的NCT介质，其中所述细胞培养基或所述NCT介质是无异种病 原体的。
[0077]实施方案62:根据实施方案1、3_48和54-61中任一实施方案的细胞培养基或根据 实施方案2-61中任一实施方案的NCT介质，其中所述细胞培养基或所述NCT介质不具有动物 或人来源的血清白蛋白。
[0078]实施方案63:根据实施方案1、3-48和54-62中任一实施方案的细胞培养基，其中所 述补充培养基选自由以下各项组成的组:DMEM(Dulbecco改良Eagle培养基）、MEM(最低必需 培养基）、BME(Eagle 基础培养基）、RPMI 1640、DMEM/F-12(Dulbecco 改良 Eagle 培养基：营养 物混合物F-12)、DMEM/F_10(Dulbecco改良Eagle培养基：营养物混合物F-10)、a-MEM(a-最 低必需培养基）、G_MEM(Glasgow最低必需培养基）、頂DM(Isocove改良Dulbecco培养基）、必 需8(E8)培养基和KnockOut DMEM。
[0079]实施方案64:如实施方案63的细胞培养基，其中所述基础培养基是DMEM/F12。
[0080]实施方案65:如实施方案2的核苷混合物传递(NCT)介质，其中所述NCT介质包含所 述媒介物和根据实施方案1、3_48和55-64中任一实施方案的细胞培养基。
[0081 ]实施方案66:-种体细胞或干细胞培养物或核苷混合物传递(NCT)培养物，所述细 胞培养物包括在根据实施方案1、3-48和55-64中任一实施方案的细胞培养基中的细胞，或 包括在根据实施方案2-62和65中任一实施方案的NCT介质中的细胞。
[0082] 实施方案67:如实施方案66的细胞培养物或NCT培养物，其中所述体细胞或干细胞 是选自由以下各项组成的组的细胞:体细胞(例如，成纤维细胞)或干细胞(例如，神经干细 胞、间充质干细胞、造血干细胞、脂肪干细胞、胚胎干细胞、脐带干细胞和诱导型多能干细胞 等等)。
[0083] 实施方案68:如实施方案66的细胞培养物或NCT培养物，其中所述细胞包括干细 胞。
[0084]实施方案69:如实施方案68的细胞培养物或NCT培养物，其中所述干细胞选自由以 下各项组成的组:胚胎干细胞和成体干细胞，包括但不限于神经干细胞、肝干细胞、造血干 细胞、脐带血干细胞、表皮干细胞、胃肠干细胞、内皮干细胞、肌肉干细胞、间充质干细胞和 胰腺干细胞。
[0085]实施方案70:如实施方案68的细胞培养物或NCT培养物，其中所述细胞是诱导型多 能干细胞(IPSC)(例如，如来源于患者的自体hIPSC)。
[0086]实施方案71:如实施方案70的细胞培养物或NCT培养物，其中所述IPSC从选自由以 下各项组成的组的细胞重编程:成纤维细胞、神经干细胞、胃细胞、肝细胞、角质细胞、黑素 细胞、羊膜细胞、血液细胞、0细胞和脂肪细胞。
[0087]实施方案72:如实施方案70或71的细胞培养物或NCT培养物，其中所述IPSC包括重 编程选自由以下各项组成的组的两个或更多个因子的细胞:KLF4(K)、LIN28(L)、c-MYC(M)、 NANOG(N) ;0CT4(0)、S0X2(S)和丙戊酸(VPA)。
[0088]实施方案73:如实施方案72的细胞培养物或NCT培养物，其中所述ISPC包括使用四 个经典Yamanaka因子KLF4(K)、c-MYC(M)、0CT4(0)和S0X2(S)重编程的细胞。
[0089]实施方案74:如实施方案73的细胞培养物或NCT培养物，其中所述重编程因子还包 括LIN28。
[0090]实施方案75:根据实施方案70-74中任一实施方案的细胞培养物或NCT培养物，其 中所述IPSC是使用选自由以下各项组成的组的载体来重编程:整合载体、非整合载体、可切 除载体和无 DNA载体。
[0091 ]实施方案76: -种减少干细胞的遗传不稳定性的方法，所述方法包括:在根据实施 方案1、3-48和55-64中任一实施方案的培养基根据实施方案的实施方案中任一实施方案的 细胞培养基中培养所述细胞。
[0092] 实施方案77: -种进行自体干细胞转移的方法，所述方法包括:从受试者分离干细 胞或从所述受试者产生IPSC，和在根据实施方案1、3-48和55-64中任一实施方案的细胞培 养基中或在根据实施方案2-62和65中任一实施方案的NCT介质中扩增和/或培养所述干细 胞或IPSC。
[0093] 实施方案78: -种促进组织的再生和/或维持的方法，所述方法包括：向受试者施 用根据实施方案2-62和65中任一实施方案的NCT介质。
[0094] 实施方案79:如实施方案78的方法，其中所述NCT介质包括媒介物，所述媒介物被 配制用于通过选自由以下各项组成的组的路线进行施用：皮下施用、肠胃外施用、表皮施 用、口服施用、鼻部或吸入施用、如通过涂料、气溶胶或以透皮方式的局部施用。
[0095]实施方案80:如实施方案78的方法，其中，其中所述NCT介质包括媒介物，所述媒介 物被配制用于表皮施用、皮下施用或皮内施用。
[0096]实施方案81:如实施方案80的方法，其中所述NCT介质被配制在选自由以下各项组 成的组的媒介物中：泥剂、草药混合物、脂肪、乳液、洗剂、乳剂、凝胶、生物剂、溶液、喷剂、膏 剂、泡沫、摩丝、液体、混悬液、分散液、气溶胶、皂、香波和调理剂。
[0097]实施方案82:如实施方案80的方法，其中所述NCT介质被配制为乳剂(例如，面部乳 剂)。
[0098]实施方案83:如实施方案80的方法，其中所述NCT介质包括选自由以下各项组成的 组的制剂:皱纹去除乳剂、真皮填充剂、祛疤乳剂和痤疮治疗物。
[0099]实施方案84:如实施方案78-83中任一实施方案的方法，其中所述NCT被涂覆于人 的皮肤。
[0100]实施方案85:如实施方案84的方法，其中所述NCT被涂覆来减少结疤。
[0101 ]实施方案86:如实施方案84的方法，其中所述NCT被涂覆来减少皱纹。
[0102] 实施方案87:如实施方案78-83中任一实施方案的方法，其中所述NCT被皮内或皮 下涂覆来增加组织体积。
【附图说明】
[0103] 图1:人诱导型多能干细胞(h IPSC)的表征。(a)干细胞标志物(插入物是DAP I)的形 态学和免疫细胞化学检测；（b)在无转基因的hIPSC衍生畸胎瘤中观察到的三种胚层的H与E 染色后的组织学表征，（c)在基于CC的应力之前和之后的无转基因 iPSC的核型分析。红色箭 头突显额外的染色体12。比例尺等于100微米。
[0104]图2:在hIPSC重编程后，dNTP池的显著减少。*dNTP池的大小相对于原始真皮成纤 维细胞中观察到的水平标准化。
[0105] 图3A和3B: YH2A.X阳性灶的可视化（图3A)和量化（图3B)。绿色染色突显yH2A. X灶， 蓝色染色突显DAPI染色核。HDF被重编程到hIPSC中，并随后在具有和不具有脱氧核糖核苷 (dN)补充的情况下培养四天。
[0106] 图4:在基于"临床级转换"（CC)的应力后，基于单一核苷酸多态性(SNP)的杂合性 损失(L0H)分析。
[0107] 图5:补充30yM的dN显著增加 hIPSC增殖速率。第一实验用0yM、30yM、100yM、200yM dN历经5天周期来处理细胞。观察到200yM将是毒性的（数据未示出）。第二实验：用0yM、30y M、50yM、75yM、100yM dN历经5天周期来处理细胞
[0108] 图6示出在利用脱氧核糖核苷(dN)培养基补充的hIPSC重编程和dNTP救援后dNTP 池的显著减少。dNTP池的大小相对于原始皮肤细胞中观察到的水平标准化。
[0109]图7示出yH2A.X阳性灶(表明双链断裂)的可视化和量化。
[0110] 图8示出：脱氧核糖核苷混合物(DC)的使用可刺激皮肤成纤维细胞和人诱导型多 能干细胞更快速地分裂。在接种后〇小时和48小时获取在具有和不具有补充物的情况下成 纤维细胞和干细胞的细胞计数。对AD1干细胞来说，已利用培养补充物重编程的一个亚克隆 被暂时除去补充物以便进行倍增速率实验。用于计算接种后48小时的群体倍增时间(PDT) 的方程是48/(Log(T48)-Log (To))。计算每24小时的倍增速率:24/PDT。
[0111] 图9示出：核苷混合物(NC)可显著救援hIPSC中的dNTP池。
[0112] 图10示出在核苷混合物存在下减少的y H2A. X阳性灶(表明双链断裂)的可视化和 量化。DNA破坏(通过y H2AX表达）的发生在利用培养补充物的情况下减少。DNA破坏程度是 通过y H2AX表达(绿色）来测量，所述y H2AX表达表明双链断裂。进行盲法计数以确定所破 坏的核的百分比。补充物在两个单独干细胞系中引起破坏的减少。
[0113]图11示出多能干细胞向治疗目标细胞类型（在这种情况下是类肝细胞的细胞，据 此都称为肝细胞)的分化。
[0114]图12示出：当使用DC补充物时，表达肝细胞的甲胎蛋白（alpha-fetoprotein)可在 两周内衍生，但不使用DC时则不会。
[0115] 详述
[0116] 在各种实施方案中，本文所述的方法和组合物涉及以下发现:脱氧核糖核苷(dN) 和/或核苷(核糖核苷)补充可增加培养物中包括诱导型多能干细胞(IPSC)的干细胞的遗传 稳定性。
[0117]如本文中所证明，确定的是:快速分裂的hIPSC中的三磷酸脱氧核糖核苷酸(dNTP) 池的大小比衍生出hIPSC的细胞(例如，真皮成纤维细胞的dNTP池显著更小(参见，例如，图2 和6)。还确定的是，hIPSC表现出比起源的成纤维细胞显著更多的双链断裂(DSB)(参见，例 如，图3A和3B)。
[0118] 本文中呈现的数据表明：l)hIPSC可利用添加至hIPSC培养物或DCT介质的呈脱氧 核糖核苷(dN)的混合物形式的外源性NTP前体，并且2)利用脱氧核糖核苷(dN)和/或核苷或 其前体的培养基补充可改善hIPSC dNTP池缺乏并显著减少由这些细胞经历的基因组不稳 定性(参见，例如，图4)。
[0119] 还发现:外源性NTP前体可被并入递送媒介物(例如，药物递送媒介物、化妆品递送 媒介物、化妆品等）中以形成核苷混合物传递(NCT)介质，所述核苷混合物传递(NCT)介质可 显著刺激增殖刺激人皮肤细胞和人诱导型多能干细胞的细胞增殖(参见，例如，图8)。如本 文所使用，术语核苷混合物传递(NCT)或核苷混合物递送(NCD)介质指的是包含媒介物的制 剂，所述媒介物补充有被配制用于向受试者(例如，人类、非人类哺乳动物等)体内施用的核 苷或其前体或脱氧核苷或其前体。脱氧核苷混合物传递(DCT)介质或脱氧核苷混合物递送 (DCD)介质指的是包含媒介物的制剂，所述媒介物补充有被配制用于向受试者(例如，人类、 非人类哺乳动物等)体内施用的脱氧核苷或其前体。
[0120] 据信，核苷混合物也可体外刺激其他细胞的细胞增殖以及体内刺激细胞增殖和/ 或组织焕新/再生(如在呈例如皮肤乳剂形式的NCT的直接表皮涂覆后体内刺激）。
[0121]本文中呈现的数据表明：核苷补充可显著救援人诱导型多能干细胞中的dNTP池 (参见，例如，图9)，并且据信，核苷补充也可扩大宽范围的其他人类和非人类细胞类型中的 dNTP池大小。
[0122] 本文中呈现的数据表明：核苷补充可显著减少人诱导型多能干细胞中遗传破坏的 发生，例如，如通过y H2A.X免疫细胞化学所测量(参见，例如，图10)，并且据信，核苷补充也 可减少宽范围的其他人类和非人类细胞类型中遗传破坏的发生。
[0123] 本文中呈现的数据表明：核苷补充可显著加强hIPSC向类肝细胞的细胞的分化(参 见，例如，图11和12)，并且据信，核苷DC补充也可加强向宽范围的其他人类和非人类细胞类 型的分化。
[0124] 哺乳动物细胞通过两条途径合成dNTP:使用葡萄糖和氨基酸的从头合成途径 (DNP)，和使用来自细胞外环境的预形成dN的补救合成途径(NSP)。在不需要受特定理论约 束的情况下，据信：1)通过DNP的dNTP池生产不足是快速分裂的hIPSC(或培养物中的其他干 细胞）中复制应力、DNA破坏和基因组不稳定性的重要原因，并且2)通过将培养基补充一种 或多种脱氧核糖核苷酸底物或其前体来允许由hIPSC细胞(或其他干细胞)利用NSP将增加 dNTP池，并且将减轻培养物中的干细胞(包括iPSC)中的复制应力、DNA破坏和基因组不稳定 性。
[0125] 类似地，据信，包含如本文所述的一种或多种脱氧核苷或其前体的核苷混合物传 递介质(NCT)(例如，药物或化妆品制剂）的施用将体内减轻干细胞和体细胞(例如，成纤维 细胞)中的复制应力、DNA破坏和基因组不稳定性。
[0126] 据发现，在无核苷条件下培养的hIPSC证明了当置于基于"临床转换"（CC)的应力 下时（图1)的dNTP缺乏（图2和6)和高水平的基因组不稳定性。然而，当标准hIPSC培养基补 充有不同浓度的dN时，据发现30yM的每一种dN可历经4-5天增加 hIPSC增殖速率和遗传稳定 性(参见，实施例1)。还证明的是:较低剂量的dN(例如，5yM)将确保hIPSC(或其他干细胞)历 经较长时间段的遗传稳定性，同时也仍显著减少基因组破坏的发生，如通过双链断裂的Y H2A.X染色所测定。
[0127] 本文中呈现的数据证实:可容易由干细胞生物学和再生医学领域的人员实现的简 单和有成本效益的培养基补充方法可增加基于个体化hIPSC的细胞治疗剂的临床潜力。
[0128] 本文中呈现的数据证实:可容易地由化妆品、再生和治疗领域的人员实现的简单 和有成本效益的核苷补充方法直接刺激人类组织(如皮肤）的再生。明确来说，核苷混合物 (和/或其他体内递送机制）的直接表皮涂覆将通过对皮肤中的皮肤成纤维细胞(图8)、间充 质干细胞和/或其他细胞的增殖刺激而诱导再生。
[0129] 据信，核苷(例如，dN)所补充的细胞比使用现有技术(无核苷(例如，无 dN)培养基） 衍生、培养和分化的干细胞具有提高的遗传稳定性，并在基于个体化干细胞（例如，基于 hIPSC)的治疗后带来显著更少的赘生物形成风险。
[0130]因此，在各种实施方案中，提供培养基，所述培养基增强在该培养基中培养的干细 胞(例如，胚胎干细胞、成体干细胞、诱导型多能干细胞等）的短期或长期遗传稳定性。所述 培养基包括用于干细胞(或其他细胞)的培养的基本上任何培养基，其中所述培养基是补充 有一种或多种脱氧核苷或核苷(三磷酸脱氧核苷或三磷酸核苷)和/或其前体的培养基。
[0131] 类似地，核苷混合物传递(NCT)介质包含药物或化妆品制剂(例如，如本文所述的 药物或化妆品制剂），所述药物或化妆品制剂含有一种或多种脱氧核苷或核苷(三磷酸脱氧 核苷或三磷酸核苷)和/或其前体。
[0132] 培养基。
[0133] 在各种实施方案中，培养基包含用于干细胞的培养的基本上任何培养基，其中所 述培养基补充有一种或多种脱氧核苷或核苷(三磷酸脱氧核苷或三磷酸核苷）和/或其前 体。在某些实施方案中，培养基补充有两种不同的脱氧核苷和/或核苷(三磷酸脱氧核苷和/ 或三磷酸核苷)和/或其前体。在某些实施方案中，培养基补充有三种不同的脱氧核苷和/或 核苷(三磷酸脱氧核苷和/或三磷酸核苷)和/或其前体。在某些实施方案中，培养基补充有 四种不同的脱氧核苷和/或核苷(三磷酸脱氧核苷和/或三磷酸核苷)和/或其前体。在某些 实施方案中，培养基补充有甚至更多种不同的脱氧核苷和/或核苷(三磷酸脱氧核苷和/或 三磷酸核苷)和/或其前体。
[0134] 如上文所指示，在各种实施方案中，基础培养基可为能够扩增、维持或分化包括 IPSC的干细胞的任何培养基。在某些实施方案中，基础培养基可根据常规方法手动制备。在 某些实施方案中，基础培养基可为可商购的培养基或其混合物。例如，基础培养基可选自由 以下各项组成的组：DMEM(Dulbecco改良Eagle培养基；GIBC0)、MEM(最低必需培养基； GIBCO)、BME(Eagle 基础培养基；GIB⑶）、RPMI 1640(GIBC0)、DMEM/F-12(Dulbecco 改良 Eagle培养基：营养物混合物F-12 ;GIB⑶）、DMEM/F_10(Dulbecco改良Eagle培养基：营养物 混合物?-10;6180))、€[-|^11(€[-最低必需培养基 ;618邙）、6-1^11(61&880￥最低必需培养基； GIBC0)、頂DM(Isocove改良Dulbecco培养基；GIBC0)和KnockOut DMEM(GIB⑶）、必需8(E8) 培养基等等。
[0135] 在各种实施方案中，基础培养基可含有一种或多种补充物，包括但不限于 KnockOut血清替换物（GIBC0)、Knock0ut SR XenoFree(GIBCO)、KnockOut SR XenoFree生 长因子混合物(GIBC0)、N2补充物(GIB⑶）、B27补充物(GIB⑶)等等。在某些实施方案中，基 础培养基是无异种病原体培养基（即，无异种培养基），以便避免由于来源于动物源的物质 的任何安全性问题。典型地，这种无异种培养基不包括异种病原体，如牛血清白蛋白和从动 物细胞纯化的重组蛋白。
[0136] 如上文所指示，这种培养基可例行地在实验室中制备，或可为商业上供应的。借助 于非限制性说明，表1示出了DMEM/F12的组成。
[0137] 表1.DMEM/F12基础培养基的组成。

[0140] 前述基础培养基意图是说明性和非限制性的。技术人员将容易认识到，本文所述 的补充物可与实际上任何培养基一起使用，或并入药物或化妆品中以形成任何多种NCT介 质。
[0141] 核苷混合物传递(递送)介质。
[0142] 在某些实施方案中，核苷混合物传递(NCT)介质包含递送媒介物(例如，化妆品制 剂），所述递送媒介物含有一种或多种脱氧核苷或核苷(三磷酸脱氧核苷或三磷酸核苷)和/ 或其前体。NCT介质被配制来将核苷或核苷前体递送至哺乳动物内或上的所需位置，并且提 供核苷或核苷前体的适当局部浓度。
[0143] "递送媒介物"指的是例如本文所述的核苷和/或核苷前体中的一种或多种与之一 起使用的稀释剂、佐剂、赋形剂、辅助剂或载体。
[0144] NCT可被配制用于皮下施用、肠胃外施用、表皮施用、口服施用、鼻部施用（或以其 他方式吸入施用），或被配制用于局部施用，如由气溶胶或以透皮方式局部施用，例如以便 体外刺激干细胞或其他细胞的细胞增殖以及体内刺激细胞增殖和/或组织焕新/再生，和/ 或在各种情形中改进所引入外源性细胞(例如，干细胞）、内源性干细胞、体细胞等等的细胞 维持。组合物可取决于施用方法而以各种剂量/浓度形式来施用。合适的单位剂型包括但不 限于粉剂、片剂、丸剂、胶囊、锭剂、栓剂、贴片、鼻部喷剂、可注射剂、可植入缓释制剂、脂质 复合物等。
[0145] 在某些实施方案中，NCT被配制用于表皮施用、皮下施用或皮内施用。在用于施用 至伤口部位(包括例如急性伤口部位、手术伤口、烧伤部位)的某些制剂中，涵盖促进愈合并 减少结疤。
[0146] 在某些实施方案中，NCT利用一种或多种药物剂来配制。说明性药物剂包括但不限 于用于处理伤口部位、烧伤部位、痤疮和其他表皮毁容物(例如，各种各样的真皮结疤)的药 剂。说明性药剂包括但不限于例如用于真皮结疤的表皮他莫昔芬、过氧化苯甲酰和用于痤 疮的抗生素等等。
[0147] 说明性NCT媒介物包括化妆泥剂、草药混合物、脂肪(例如，动物脂肪）、乳液、洗剂、 乳剂、凝胶、生物剂、溶液、喷剂、膏剂、泡沫、摩丝、液体、混悬液、分散液、气溶胶、阜、香波、 调理剂、清洁剂和一般化妆产品。在某些实施方案中，涵盖包括用于减少皱纹和/或皮肤褪 色的药剂和/或真皮填充剂的媒介物。
[0148] 可添加核苷和/或核苷前体的合适的媒介物包括但不限于泥剂、草药混合物、动物 脂肪、乳液、洗剂、乳剂、凝胶、生物剂、溶液、喷剂、膏剂、泡沫、摩丝、液体、混悬液、分散液、 气溶胶、皂、香波、调理剂、清洁剂和一般化妆产品。
[0149] 在某些实施方案中，合适的媒介物包括常用作用于乳剂、洗剂、喷剂、泡沫、凝胶、 乳液、洗剂或涂料的基底以供表皮施用的任何载体或媒介物。实例包括乳化剂、包括烃基底 的惰性载体、乳化基底、无毒溶剂或水溶性基底。特别合适的实例包括普朗尼克 (pl Ur〇nicS)、HPMC、CMC和其他纤维素基成分、羊毛脂、硬石蜡、液体石蜡、软黄石蜡或软白 石蜡、白色蜂蜡、黄色蜂蜡、十八十六醇、鲸蜡醇、聚二甲基硅氧烷、乳化蜡、肉豆蔻酸异丙 酯、微晶蜡、油醇和硬脂醇。还涵盖非离子聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物，也称为泊洛沙姆 (poloxamer)。一种说明性泊洛沙姆是泊洛沙姆407,也称为普朗尼克F-127(BASF)。另外的 载体包括但不限于海藻酸盐、聚乙烯醇、水凝胶，包括含有纤维素衍生物和/或聚丙烯酸的 水凝胶;纤维素基载体，包括羟乙基纤维素、羟甲基纤维素、羧甲基纤维素、羟丙基甲基纤维 素和其混合物。
[0150] 在某些实施方案中，媒介物包括洗剂。洗剂可含有精细粉末物质，所述精细粉末物 质通过使用悬浮剂和分散剂而不可溶于分散介质。替代地，洗剂可具有与媒介物不混溶并 且通常借助于乳化剂或其他合适的稳定剂分散的液体物质作为分散相。在一个实施方案 中，洗剂是呈乳液形式，所述乳液具有在100厘沲与1000厘沲之间的粘度。洗剂的流动性允 许在较宽表面积上快速和均匀地涂覆。洗剂典型地意图在皮肤上干燥，从而在皮肤的表面 上留下具有所述洗剂的医学组分的薄涂层。
[0151] 在某些实施方案中，媒介物包括表皮乳剂。乳剂可含有乳化剂和/或其他稳定剂。 在一个实施方案中，制剂是呈乳剂形式，所述乳剂具有大于1〇〇〇厘沲(典型地在20，000-50， 〇〇〇厘沲范围内）的粘度。乳剂时常比膏剂优选，这是因为它们通常较容易撒布并且较容易 去除。乳剂与洗剂之间的基本差异是粘度，这取决于各种油的量/使用和用于制备制剂的水 的百分比。取决于在皮肤上的所需效果，乳剂典型地比洗剂更稠，可具有各种用途并且常常 使用更多样的油/脂。在乳剂制剂中，水基百分比是总量的约60-75%并且油基百分比是总 量的约20-30%，其他百分比是乳化剂、防腐剂和添加剂，总共为100%。
[0152] 在各种实施方案中，媒介物包括膏剂。合适的膏剂基底的实例包括烃基底(例如， 凡士林、白色凡士林、黄色膏剂和矿物油）；吸附基底(亲水性凡士林、无水羊毛脂、羊毛脂和 冷乳剂）；水可去除基底(例如，亲水性膏剂），和水溶性基底(例如，聚乙二醇膏剂）。糊剂典 型地与膏剂的区别在于糊剂含有更大的固体百分比。糊剂典型地比用相同组分制备的膏剂 吸收性更好并且较不油腻。
[0153] 在某些实施方案中，媒介物包括凝胶。一些乳液可为凝胶或另外包括凝胶组分。然 而，一些凝胶不是乳液，因为它们不含不混溶组分的均质化共混物。合适的胶凝剂包括但不 限于改性纤维素，如羟丙基纤维素和羟乙基纤维素;卡波普均聚物和共聚物;和其组合。液 体媒介物中的合适的溶剂包括但不限于二甘醇单乙醚;烷二醇，如丙二醇；二甲基异山梨 醇;醇，如异丙醇和乙醇。典型地针对溶剂溶解药物的能力来选择溶剂。也可并入改进制剂 的皮肤感觉和/或润肤性的添加剂。这些添加剂的实例包括但不限于肉豆蔻酸异丙酯、乙酸 乙酯、苯甲酸C12-C15烷基酯、矿物油、角鲨烷、环甲基硅酮、癸酸/辛酸甘油三酯和其组合。
[0154] 在某些实施方案中，媒介物包括泡沫。泡沫由乳液与气态推进剂的组合组成。气态 推进剂主要由氢氟烷烃（HFA)组成。合适的推进剂包括HFA，如1，1，1，2-四氟乙烷（HFA 134a)和1，1，1，2，3，3，3-七氟丙烷(HFA 227)，但当前批准的或可成为被核准的用于医疗用 途的这些和其他HFA的混合物和掺加物是合适的。推进剂优选不是在喷雾期间可产生易燃 或爆炸性蒸气的烃推进剂气体。此外，组合物优选不含在使用期间可能产生易燃或爆炸性 蒸气的挥发性醇。
[0155] 将认识到，在各种实施方案中，媒介物可含有另外的成分，例如用于增强保存期， 减少生物污染，改进润湿，维持最佳PH、粘度，维持或改进颜色、气味、纹理等等。说明性、另 外的成分包括但不限于赋形剂、稀释剂、润肤剂、表面活性剂、乳化剂、缓冲剂、防腐剂、渗透 增强剂、香味剂、着色剂等等。
[0156] 适当的赋形剂是基于制剂类型来选择。标准的赋形剂包括明胶、酪蛋白、卵磷脂、 阿拉伯胶、胆固醇、黄芪胶、硬脂酸、苯扎氯铵、硬脂酸钙、单硬脂酸甘油酯、十八十六醇、西 土马哥（cetomacrogol)乳化錯、脱水山梨糖醇酯、聚氧乙稀烷基醚、聚氧乙稀蓖麻油衍生 物、聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯、聚乙二醇、聚氧乙烯硬脂酸酯、胶态二氧化硅、磷酸 盐、十二烷基硫酸钠、羧甲基纤维素钙、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙 基纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、非晶纤维素、硅酸镁铝、三乙醇胺、聚乙烯醇、 聚乙烯吡咯烷酮、糖和淀粉。
[0157] "稀释剂"可包括在制剂中以溶解、分散或以其他方式并入载体中。稀释剂的实例 包括但不限于水、缓冲水溶液、有机亲水性稀释剂，如单价醇和低分子量二醇和多元醇(例 如，丙二醇、聚丙二醇、甘油、丁二醇）。
[0158] "润肤剂"是外部涂覆剂，所述外部涂覆剂软化或抚慰皮肤并且在本领域中通常是 已知的，并列在汇编资料（compendia)中，如"Handbook of Pharmaceutical Excipients"， 第4版，Pharmaceutical Press,2003。这些润肤剂包括但不限于杏仁油、蓖麻油、长角豆提 取物、十八十六醇、鲸蜡醇、鲸蜡酯蜡、胆固醇、棉籽油、环甲基硅酮、乙二醇硬脂酸棕榈酸 酯、甘油、单硬脂酸甘油酯、单油酸甘油酯、肉豆蔻酸异丙酯、棕榈酸异丙酯、羊毛脂、卵磷 月旨、轻质矿物油、中链甘油三酯、矿物油和羊毛脂醇、凡士林、凡士林和羊毛脂醇、大豆油、淀 粉、硬脂醇、葵花油、木糖醇和其组合。在一个实施方案中，润肤剂是硬脂酸乙基己酯和棕榈 酸乙基己酯。
[0159] "表面活性剂"是表面活化剂，所述表面活化剂降低表面张力并从而增加产品的乳 化、发泡、分散、撒布和润湿性质。合适的非离子表面活性剂包括乳化蜡、单油酸甘油酯、聚 氧乙烯烷基醚、聚氧乙烯蓖麻油衍生物、聚山梨醇酯、脱水山梨糖醇酯、苄醇、苯甲酸苄酯、 环糊精、单硬脂酸甘油酯、泊洛沙姆、聚维酮和其组合。在一个实施方案中，非离子表面活性 剂是硬脂醇。
[0160] "乳化剂"是表面活性物质，所述表面活性物质促进一种液体在另一种液体中的混 悬，并且促进油和水的稳定混合物或乳液的形成。常见的乳化剂是:金属皂、某些动物油和 植物油和各种极性化合物。合适的乳化剂包括阿拉伯胶、阴离子乳化蜡、硬脂酸钙、卡波姆、 十八十六醇、鲸蜡醇、胆固醇、二乙醇胺、乙二醇硬脂酸棕榈酸酯、单硬脂酸甘油酯、单油酸 甘油酯、羟丙基纤维素、羟丙甲纤维素、羊毛脂、含水羊毛脂醇、卵磷脂、中链甘油三酯、甲基 纤维素、矿物油和羊毛脂醇、磷酸二氢钠、单乙醇胺、非离子乳化蜡、油酸、泊洛沙姆 (poloxamer)、泊洛沙姆(poloxamers)、聚氧乙稀烷基醚、聚氧乙稀蓖麻油衍生物、聚氧乙稀 脱水山梨糖醇脂肪酸酯、聚氧乙烯硬脂酸酯、海藻酸丙二醇酯、自乳化单硬脂酸甘油酯、脱 水柠檬酸钠、十二烷基硫酸钠、脱水山梨糖醇酯、硬脂酸、葵花油、黄芪胶、三乙醇胺、黄原胶 和其组合。在一个实施方案中，乳化剂是硬脂酸甘油酯。
[0161 ] "缓冲剂"用于控制组合物的pH。优选地，缓冲剂将组合物从约4的pH缓冲至约7.5 的pH，更优选从约4的pH缓冲至约7的pH，并且最优选从约5的pH缓冲至约7的pH。在优选实施 方案中，缓冲剂是二乙醇胺。
[0162] "防腐剂"可用于防止真菌和微生物的生长。合适的抗真菌剂和抗微生物剂包括但 不限于苯甲酸、对羟基苯甲酸丁酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸 丙酯、苯甲酸钠、丙酸钠、苯扎氯铵、苄索氯铵、苄醇、西吡氯铵、氯丁醇、苯酚、苯乙醇和硫柳 汞。
[0163] "渗透增强剂"被频繁地用于促进药物跨越皮肤，尤其跨越角质层的透皮递送。渗 透增强剂可被添加来允许活性剂能够跨过角质层的屏障。一些渗透增强剂引起皮肤刺激、 皮肤毒性和皮肤过敏。然而，较常用的渗透增强剂包括脲(羰基二酰胺）、咪唑烷基脲、N，N_ 二乙基甲酰胺、N-甲基-2-吡咯烷、1-十二烷基-氮杂环庚烷-2-酮、硫代乙醇酸钙、2-吡咯 烷、N，N-二乙基-间甲苯甲酰胺、油酸和其酯衍生物（如单油酸甲酯、单油酸乙酯、单油酸丙 酯、单油酸异丙酯、单油酸丁酯、单油酸乙烯酯和单油酸甘油酯）、脱水山梨糖醇酯（如脱水 山梨糖醇单月桂酸酯和脱水山梨糖醇单油酸酯）、其他脂肪酸酯（如月桂酸异丙酯、肉豆蔻 酸异丙酯、棕榈酸异丙酯、己二酸二异丙酯、丙二醇单月桂酸酯、丙二醇单油酸酯），和非离 子清洁剂，如BRI.⑶76(硬脂酰基聚（10)氧乙烯醚）、BRIJ?78(硬脂酰基聚(20)氧乙烯醚）、 BRIJ?96(油基聚（10)氧乙烯醚)和BRXKf 721 (硬脂酰基聚（21)氧乙烯醚）（ICI Americas Inc.Corp.)〇
[0164] 将认识到，递送媒介物的组合物将随施用模态、涂覆部位等等而改变。制备药物和 化妆品媒介物的方法是本领域的技术人员众所周知的（参见，例如，Remington ' s Pharmaceutical Sciences，第18版，Mack Printing Company,1990；Bare1,Handbook of Cosmetic Science and Technology,第3片反，CRC Press;和Rosen，Delivery System Handbook for Personal Care and Cosmetic Products:Technology，Applications and Formulations,Elsevier Science(2005))〇
[0165] 前述制剂和施用方法意图为说明性和非限制性的。应了解，使用本文中提供的教 导内容，可容易设计出其他合适的制剂和施用模式。
[0166] 核苷补充。
[0167] 在各种实施方案中，培养基补充有或NCT介质包含一种或多种脱氧核苷或核苷(三 磷酸脱氧核苷或三磷酸核苷)和/或其前体。说明性三磷酸脱氧核糖核苷包括但无需限于三 磷酸脱氧腺苷(dATP)、三磷酸脱氧鸟苷（dGTP)、三磷酸脱氧胞苷(dCTP)、三磷酸脱氧胸苷 (dTTP)和三磷酸脱氧尿苷(dUTP)。dNTP的说明性前体包括但不限于：
[0168] 对三磷酸脱氧腺苷(dATP)来说:二磷酸脱氧腺苷、单磷酸脱氧腺苷、脱氧腺苷、腺 嘌呤等等。在一些实施方案中，前体包括选自由二磷酸脱氧腺苷、单磷酸脱氧腺苷和脱氧腺 苷或其任何组合组成的组的一种或多种前体。
[0169] 对三磷酸脱氧鸟苷(dGTP)来说:二磷酸脱氧鸟苷、单磷酸脱氧鸟苷、脱氧鸟苷、鸟 嘌呤等等。在一些实施方案中，前体包括选自由二磷酸脱氧鸟苷、单磷酸脱氧鸟苷和脱氧鸟 苷或其任何组合组成的组的一种或多种前体。
[0170] 对三磷酸脱氧胞苷(dCTP)来说:二磷酸脱氧胞苷、单磷酸脱氧胞苷、脱氧胞苷、胞 嘧啶等等。在一些实施方案中，前体包括选自由二磷酸脱氧胞苷、单磷酸脱氧胞苷和脱氧胞 苷或其任何组合组成的组的一种或多种前体。
[0171 ]对三磷酸脱氧胸苷(dTTP)来说:二磷酸脱氧胸苷、单磷酸脱氧胸苷、脱氧胸苷、胸 腺嘧啶等等。在一些实施方案中，前体包括选自由二磷酸脱氧胸苷、单磷酸脱氧胸苷和脱氧 胸苷或其任何组合组成的组的一种或多种前体。
[0172] 对三磷酸脱氧尿苷来说，二磷酸脱氧尿苷、单磷酸脱氧尿苷、脱氧尿苷、尿嘧啶等 等。在一些实施方案中，前体包括选自由二磷酸脱氧尿苷、单磷酸脱氧尿苷和脱氧尿苷或其 任何组合组成的组的一种或多种前体。
[0173]在各种实施方案中，基础培养基另外或替代地补充有或NCT包含一种或多种三磷 酸核苷和/或其前体。说明性三磷酸核苷包括但无需限于三磷酸腺苷(ATP)、三磷酸鸟苷 (GTP)、三磷酸胞苷(CTP)、三磷酸5-甲基尿苷(m5UTP)、三磷酸尿苷(UTP)等等。在某些实施 方案中，当ATP存在时，至少一种其他三磷酸核苷和/或三磷酸脱氧核苷或其前体也作为补 充物存在。NTP的说明性前体包括但不限于：
[0174] 对三磷酸腺苷(ATP)来说:二磷酸腺苷、单磷酸腺苷、腺苷、腺嘌呤等等，或其任何 组合。在一些实施方案中，前体包括选自由二磷酸腺苷、单磷酸腺苷和腺苷组成的组的一种 或多种前体。
[0175] 对三磷酸鸟苷(GTP)来说:二磷酸鸟苷、单磷酸鸟苷、鸟苷、鸟嘌呤等等，或其任何 组合。在一些实施方案中，前体包括选自由二磷酸鸟苷、单磷酸鸟苷和鸟苷组成的组的一种 或多种前体。
[0176] 对三磷酸胞苷(CTP)来说:二磷酸胞苷、单磷酸胞苷、胞苷、胞嘧啶等等，或其任何 组合。在一些实施方案中，前体包括选自由二磷酸胞苷、单磷酸胞苷和胞苷组成的组的一种 或多种前体。
[0177] 对三磷酸5-甲基尿苷(m5UTP)来说:二磷酸5-甲基尿苷、单磷酸5-甲基尿苷、5-甲 基尿苷、胸腺嘧啶等等，或其任何组合。在一些实施方案中，前体包括选自由二磷酸5-甲基 尿苷、单磷酸5-甲基尿苷和5-甲基尿苷组成的组的一种或多种前体。
[0178] 对三磷酸尿苷(UTP)来说:二磷酸尿苷、单磷酸尿苷、尿苷、尿嘧啶等等，或其任何 组合。在一些实施方案中，前体包括选自由二磷酸尿苷、单磷酸尿苷和尿苷组成的组的一种 或多种前体。
[0179] 在某些实施方案中，前体不包括单独的基底。
[0180] 在某些实施方案中，培养基补充有或NCT介质包含两种不同的脱氧核苷或核苷(三 磷酸脱氧核苷或三磷酸核苷）和/或其前体，或三种不同的脱氧核苷或核苷(三磷酸脱氧核 苷或三磷酸核苷)和/或其前体，或四种（或更多种）不同的脱氧核苷或核苷(三磷酸脱氧核 苷或三磷酸核苷)和/或前体。在某些实施方案中，培养基补充有或DCT介质包含至少嘌呤和 嘧啶(或其前体）。在某些实施方案中，培养基补充有或DCT介质包含至少两种嘌呤(或其前 体）。在某些实施方案中，培养基补充有或NCT介质包含至少两种嘧啶(或其前体）。在某些实 施方案中，培养基补充有或NCT介质包含至少两种嘌呤(或其前体)和至少嘧啶(或其前体）。 在某些实施方案中，培养基补充有或NCT介质包含至少两种嘧啶(或其前体)和嘧啶(或其前 体）。在某些实施方案中，培养基补充有或NCT介质包含至少两种嘧啶(或其前体)和两种嘧 啶(或其前体）。
[0181] 借助于说明，在一些实施方案中，补充物(例如，并入培养基或包含NCT介质）包含 以下各项中的一种或多种或由以下各项中的一种或多种组成：
[0182] l)dATP(或其前体）；
[0183] 2)dGTP(或其前体）；
[0184] 3)dCTP(或其前体）；
[0185] 4)dTTP(或其前体）；
[0186] 5)dUTP(或其前体）；
[0187] 6)dATP(或其前体)和dGTP(或其前体）；
[0188] 7)dATP(或其前体）和dCTP(或其前体）；
[0189] 8)dATP(或其前体)和dTTP(或其前体）；
[0190] 9)dATP(或其前体)和dUTP(或其前体）；
[0191] 10)dGTP(或其前体)和dCTP(或其前体）；
[0192] ll)dGTP(或其前体）和dTTP(或其前体）；
[0193] 12)dGTP(或其前体)和dUTP(或其前体）；
[0194] 13)dCTP(或其前体)和dTTP(或其前体）；
[0195] 14)dCTP(或其前体)和dUTP(或其前体）；
[0196] 15)dTTP(或其前体)和dUTP(或其前体）；
[0197] 16)dATP(或其前体）、dGTP(或其前体)和dCTP(或其前体）；
[0198] 17)dATP(或其前体）、dGTP(或其前体)和dTTP(或其前体）；
[0199] 18)dATP(或其前体）、dCTP(或其前体)和dTTP(或其前体）；
[0200] 19)dGTP(或其前体）、dCTP(或其前体)和dTTP(或其前体）；
[0201] 20)dATP(或其前体）、dGTP(或其前体)和dCTP(或其前体）；
[0202] 21)dATP(或其前体）、dGTP(或其前体）和dUTP(或其前体）；
[0203] 22)dATP(或其前体）、dCTP(或其前体)和dUTP(或其前体）；
[0204] 23)dGTP(或其前体）、dCTP(或其前体)和dUTP(或其前体）；
[0205] 24)dATP(或其前体）、dGTP(或其前体）、dCTP(或其前体)和dTTP(或其前体）；
[0206] 25)dATP(或其前体）、dGTP(或其前体）、dCTP(或其前体)和dUTP(或其前体）；
[0207]将认识到，在前述补充物中的任何补充物中，脱氧核苷可为核苷或其前体。这些补 充物意图为说明性和非限制性的。
[0208] 典型地，dNTP和/或NTP以足以提高干细胞的短期和/或长期遗传稳定性和/或提高 增殖速率和/或提高活力的量存在于培养基或NCT介质中，所述提高是与在没有通过三磷酸 核苷或其前体补充的情况下在相同培养基中培养的相同细胞或暴露于NCT介质的相同细胞 相比较而言。
[0209]在某些实施方案中，补充培养基或DCT介质的NTP和/或dNTP或其前体各自独立地 以在以下范围变化的浓度而存在：约lyM直至约50yM，或约lyM直至约40yM，或约lyM直至约 35yM，约lyM直至约30yM。在某些实施方案中，补充培养基或DCT介质的NTP和/或dNTP或其前 体各自独立地以以下浓度存在：约50yM或更低，或约40yM或更低，或约35yM或更低，或约30y M或更低，或约25yM或更低，或约20yM或更低，或约15yM或更低，或约10yM或更低，或约5yM或 更低（要理解的是，存在至少O.lyM的至少一种三磷酸核苷或其前体，以使得"较低"不意图 解释为不存在每一种三磷酸核苷或其前体）。
[0210]在某些实施方案中，补充培养基或包含NCT介质的NTP和/或dNTP或其前体各自独 立地以在约5yM至约30yM范围变化的浓度存在。
[0211]在某些实施方案中，补充培养基或包含NCT介质的NTP和/或dNTP或其前体各自独 立地以以下浓度存在：约1 yM，或约2yM，或约3yM，或约4yM，或约5yM，或约6yM，或约7yM，或约 8yM，或约9yM，或约10yM，或约IlyM，或约12yM，或约13yM，或约14yM，或约15yM，或约16yM，或 约17yM，或约18yM，或约19yM，或约20yM，或约21yM，或约22yM，或约23yM，或约24yM，或约25y M，或约26yM，或约27yM，或约28yM，或约29yM，或约30yM，或约31yM，或约32yM，或约33yM，或 约34yM，或约35yM，或约36yM，或约37yM，或约38yM，或约39yM，或约40yM，或约41yM，或约42y M，或约43uM，或约44uM，或约45uM，或约46uM，或约47uM，或约48uM，或约49uM，或约50uM。 [0212]在某些实施方案中，补充培养基或包含NCT介质的NTP和/或dNTP或其前体各自以 在以下范围变化的浓度存在：约y 1 yM，或约2yM，或约3yM，或约4yM，或约5yM直至约5 OyM，或 直至约40yM，或直至约30yM，或直至约25yM，或直至约20yM，或直至约15yM。
[0213] 在某些实施方案中，补充培养基或包含NCT介质的总NTP和/或dNTP或其前体以在 以下范围变化的浓度存在：约lyM，或约2yM，或约3yM，或约4yM，或约5yM，或约6yM，或约7yM， 或约8yM，或约9yM，或约10yM，或约IlyM，或约12yM，或约13yM，或约14yM，或约15yM，或约16y M，或约17處，或约18yM，或约19處，或约20處直至约200處，或直至约180處，或直至约150處， 或直至约145虚，或直至约140處，或直至约135處，或直至约130虚，或直至约125虚，或直至 约120yM，或直至约115yM，或直至约110yM，或直至约105yM，或直至约100yM。
[0214] 在某些实施方案中，本文中还提供干细胞培养物，其中干细胞培养物包含在补充 有如本文所述的一种或多种dNTP和/或NTP的培养基中的干细胞。在某些实施方案中，干细 胞可在体内并暴露于如本文所述的NCT。在各种实施方案中，干细胞可为胚胎干细胞或成体 干细胞，包括但不限于神经干细胞、肝干细胞、造血干细胞、脐带血干细胞、表皮干细胞、胃 肠干细胞、内皮干细胞、肌肉干细胞、间充质干细胞、胰腺干细胞等等。在某些实施方案中， 干细胞包括诱导型多能干细胞，尤其是人IPSC。干细胞(包括IPSC)可为非人类动物干细胞 或人干细胞。
[0215] 在某些实施方案中，干细胞是诱导型多能干细胞，尤其是人IPSC。说明性干细胞包 括但不限于选自由以下各项组成的组的干细胞:胚胎干细胞和成体干细胞，包括但不限于 神经干细胞、肝干细胞、造血干细胞、脐带血干细胞、表皮干细胞、胃肠干细胞、内皮干细胞、 肌肉干细胞、间充质干细胞和胰腺干细胞。
[0216] 在某些实施方案中，在干细胞是IPSC的情况下，IPSC从选自由以下各项组成的组 的细胞重编程:成纤维细胞、神经干细胞、胃细胞、肝细胞、角质细胞、黑素细胞、羊膜细胞、 血液细胞、辟田胞和脂肪细胞。在某些实施方案中，IPSC包括重编程选自由以下各项组成的 组的两个或更多个因子的细胞:KLF4(K)、LIN28(L)、c-MYC(M)、NAN0G(N);0CT4(0)、S0X2(S) 和丙戊酸(VPA)。在某些实施方案中，ISPC包括使用四个经典Yamanaka因子重编程的细胞 KLF4(K)、c-MYC(M)、0CT4(0)和S0X2(S)。
[0217] 重编程细胞来产生IPSC的方法是本领域的技术人员众所周知的。在某些实施方案 中，重编程可使用例如整合载体(例如，慢病毒载体、可诱导慢病毒载体等等）、可切除载体 (例如，转座子载体、1 oxP-侧连慢病毒载体等等）、非整合载体(例如，腺病毒载体、质粒载体 等）、无 DNA载体(例如，仙台病毒、蛋白载体、修饰的mRNA载体、microRNA载体等等)来完成。 应注意，许多重编程试剂盒是可商购的（例如，（来自Life Technologies的Epi5?游离基因 iPSC重编程试剂盒和CytoTune?- iPS仙台重编程试剂盒，等等）。
[0218] 在各种实施方案中，提供减少诱导型干细胞(包括多能干细胞)的遗传不稳定性的 方法，其中所述方法包括在补充有如本文所述的NTP和/或dNTP和/或其前体的细胞培养基 中培养细胞，或使细胞与包括如本文所述的一种或多种NTP和/或dNTP和/或其前体的NCT介 质例如体内接触。
[0219] 在各种实施方案中，提供一种干细胞(例如，诱导型多能干细胞），所述干细胞存在 于补充有如本文所述的NTP和/或dNTP和/或其前体的细胞培养基中，或与包含如本文所述 的NTP和/或dNTP和/或其前体的NCT介质接触。
[0220] 还提供了提供自体干细胞转移的方法。所述方法典型地涉及提供从受试者分离的 干细胞或从受试者产生的IPSC，并且在补充有如本文所述的NTP和/或dNTP和/或其前体的 细胞培养基或NCT介质中扩增和/或培养所述干细胞或IPSC。
[0221] 在本文所述的每一实施方案中，主题（亦即，细胞培养物、DCT介质、细胞、方法等） 可不含已被放射标记的任何NTP和/或dNTP和/或其前体。因此，在一些实施方案中，用于这 些实施方案中的NTP和/或dNTP和/或其前体尚未或没有连接任何放射标记或并入有任何放 射标记(例如像， 3H、51Cr或32P等等）。因此，实施方案可不含例如3H-dTTP或 3H-TTP或其任何 前体。
[0222] 本文所述的实施方案意图为说明性和非限制性的。使用本文中提供的教导内容， 本领域的技术人员可获得本文所述的组合物和方法的众多变化。 实施例
[0223] 提供以下实施例来说明但不是限制所要求保护的发明。
[0224] 实施例1
[0225] 在hIPSC培养物中或在核苷混合物传递(NCT)介质中用于促进遗传稳定性，增强细 胞功能并增强再生的核苷补充
[0226] 显著性
[0227] 人诱导型多能干细胞（hIPSC)具有显著的治疗潜力（Byrne (2008 )Human Molecular Genetics 17:R37-41)。然而，我们的发现（图1，初步数据）和其他人的发现 (Martins-Taylor和Xu(2012)Stem Cells 30:22-27;Lund等人（2012)Nat .Rev.Genet ?，13: 732-744)都表明：基本上使用当前方法衍生的所有iPSC克隆在重编程和体外培养诱导应力 期间获得基因组不稳定性。在给定基因组不稳定性与增加的恶性转变风险之间的已建立联 系的情况下，hIPSC基因组不稳定性的问题是在将基于个体化iPSC的再生疗法推进到诊所 方面最重要的瓶颈之一（Martins-Taylor和Xu(2012)Stem Cells 30:22-27;Lund等人 (2012)Nat.Rev.Genet13:732-744；Byrne(2013)Gene Therapy and Regulation 7: 1230002)。
[0228] 在hIPSC重编程和培养期间的基因组不稳定性的原因尚未被知晓，并且仍有待开 发出用于减少并最终消除这种高度有害现象的发生的方法。在正在进行的实验中，我们发 现:快速分裂的hIPSC中的三磷酸脱氧核糖核苷酸(dNTP)池的大小比衍生出hIPSC的真皮成 纤维细胞的dNTP池显著更小（图2)。我们还发现:hIPSC表现出比起源的成纤维细胞显著更 多的双链断裂(DSB)(图3A和3B)。我们对hIPSC中减少的dNTP池和增加的DNA破坏的观察结 果可提供对hIPSC的基因组不稳定性的病原学的新致病机制见解，并且提出用于防止这种 现象的方法。因此，我们的数据表明：l)hIPSC可利用添加至hIPSC培养基的呈脱氧核糖核苷 (dN)的混合物形式的外源性dNTP前体，并且2)利用dN的培养基补充可改善hIPSC dNTP池缺 乏并显著减少由这些细胞经历的基因组不稳定性（图4)。
[0229] 假设和理论基础。
[0230]哺乳动物细胞通过两条途径合成dNTP:使用葡萄糖和氨基酸的从头合成途径 (DNP)，和使用来自细胞外环境的预形成dN的补救合成途径(NSP)。在不受特定理论约束的 情况下，我们假设：1)通过DNP的dNTP池生产不足是快速分裂的hIPSC中复制应力、DNA破坏 和基因组不稳定性的重要原因，并且2)通过将培养基补充NSP的dN底物的限定混合物来允 许由hIPSC细胞利用NSP将增加 dNTP池，并且将减轻复制应力、DNA破坏和基因组不稳定性。 [0231]在不受特定理论约束的情况下，假设：1)通过从头合成途径(DNP)从葡萄糖和氨基 酸的dNTP池生产不足是hIPSC中复制应力、DNA破坏和基因组不稳定性的重要原因，并且2) 允许hIPSC还使用除DNP之外的第二dNTP生物合成途径即核苷补救合成途径(NSP)将减轻复 制应力、DNA破坏和基因组不稳定性。在说明性实施方案中，允许NSP的使用是通过将hIPSC 培养基补充NSP的脱氧核糖核苷(dN)底物的混合物来完成。
[0232] 概括地说，提供针对基因组不稳定性问题的简单、有效、普遍适用和有成本效益解 决方案，所述解决方案适用于使用当前方法产生的hIPSC。明确来说，已证实：干细胞和 hIPSC中的基因组不稳定性的发生可通过允许这些细胞通过NSP来合成dNTP而防止。这可通 过将培养基补充NSP的dN底物的优化混合物来实现
[0233] 人诱导型多能干细胞的衍生和表征
[0234] 我们已经使用LoxP-侧连多顺反子重编程载体(随后使用Cre重组酶将所述载体从 基因组去除（Sommer等人（2010)Stem Cells 28:64-74))或通过使用基于合成mRNA的方法 (Warren等人(2010)Cell Stem Cell ,7:618-630)将成年人真皮成纤维细胞(HDF)重编程到 人诱导型多能干细胞(hIPSC)中。所有重编程和后续的培养都在标准hIPSC培养基中进行， 所述标准hIPSC培养基根据当前的标准实践规范不补充任何核苷（www. stemgent ? com/ products/show/69.NUTRISTEM? XF/FF Culture Medium)。两种无转基因 hIPSC系都表现出 标准的表征参数，如先前所述(Byrne等人(2009)P1〇S One 4:e7118)。这些参数包括类胚胎 干细胞(ESC)形态学、关键多能性标志物(NAN0G、0CT4、SSEA3、SSEA4、Tra-1-6(^PTra-1-81) 的显著表达(在原始皮肤成纤维细胞中检测不到所述表达（图1，A图）），和在重度联合免疫 缺陷（SCID)小鼠中畸胎瘤形成之后向所有三种胚层的代表物的分化（图1，B图）。我们随后 从研究级条件(含有动物衍生表位:含有Matrigel底物和Knockout血清替换物(KSR)的培养 基）到推定临床级无动物表位的"无异种"限定条件(Cel IStart底物和优化的无异种培养 基，50%mTeSRI，Stemcell Technologies和50%NutriStem, Stemgent)来对我们的无转基 因 hIPSC系进行转换，如先前所述(Karumbayaram等人(2012)Stem Cells Trans.Med. 1:36_ 43)。两种hIPSC系都是核型的，如我们先前已描述了在"临床级转换"（CC)之前和之后的情 况（Byrne等人（2009)P1〇S One 4:e7118)〇
[0235] 在CC诱导应力和扩增之后，两种细胞系从核型正常(46XY)变为拥有额外染色体12 (图1，C图）。所观察到的基因组不稳定性与若干公布的研究紧密关联，所述研究证实了 hIPSC在遗传学上时不稳定的，尤其当置于外在应力的条件下如此(Nagaria等人（2013) Biochimica et Biophysica Acta,1830:2345-2353)，并且优先地复制染色体 12(Draper等 人(2004)Nat.Biotechnol.22:53-54)。先前已暗示的是，hIPSC中的所有染色体都具有染色 体易位和复制的相同初始发生率，但是当发生染色体12的复制时，所述复制在通过选择工 艺(Id.)使hIPSC群体体外扩展到培养物中之后，遍及所述hIPSC群体产生优先的扩增。应注 意，我们将基于CC的应力视为针对长期培养(>6-12个月）诱导应力的有用模型，所述诱导应 力还趋向于产生hIPSC和hESC累积核型异常(尤其是染色体12)，如我们历经2个月周期在基 于CC的应力之后观察到的。
[0236] hIPSC对比起源的HDF的较小dNTP池
[0237] 我们量化了原始HDF和早期通路(无 CC应力）hIPSC中的三磷酸脱氧核糖核苷酸 (dNTP)池，如先前所述(Austin等人（2012)J.Exp.Med. ,209:2215-2228)。我们观察到，在 hIPSC重编程之后，所有四种dNTP的水平的显著下降(在32-52%之间）（图2)。
[0238] 涉及dNTP生物合成的基因在快速分裂的hIPSC中和在HDF中以类似水平表达并在 HDF中以细胞分裂速率较慢
[0239] 对HDF和衍生的早期通路hIPSC的4€€711161：1^1总体转录分析（如先前所述来进行 (Awe等人(2013)Stem Cell Res.&Theap. ,4:15))证实：关键多能性特异性标志物的显著上 调;关键成纤维细胞特异性标志物的表达在hIPSC重编程之后减少(表2)。我们还观察到，先 前与基因组不稳定性的诱导联系的基因（CCNE1、E2F2、E2F35)的上调。然而，我们并没有观 察到关键dNTP生物合成基因的表达的任何显著差异(表2)。由于hIPSC具有比HDF更快的平 均群体倍增时间(PDT)(18小时对比48小时），这些数据支持了我们的假设，即：hIPSC中的小 dNTP池可由以下产生：1)较快的细胞增殖速率，这增加了 dNTP用于DNA复制的使用率，和2) 不能上调涉及dNTP生物合成的基因的表达。
[0240] 表2.在hIPSC重编程之后基因表达的改变。

[0242] hIPSC对比HDF的高水平DNA破坏:dN补充减少hIPSC中的DNA破坏
[0243] 我们利用y组蛋白2A.X(yH2A.X)染色，如先前所述(Bester等人(2011)Cell，145: 435-446)，以便估计HDF和早期通路hIPSC中的双链断裂(DSB)的数目。在hIPSC中到比起源 的HDF中显著更多的yH2A.X阳性灶。我们还观察到:在dN补充的4天之后，显著较少的yH2A.X 阳性灶（图3A，比较中间图和下方图）。这个发现为以下假设提供了另外的支持:hIPSC表现 出比真皮成纤维细胞更高水平的基因组不稳定性，并且基因组不稳定性可利用细胞培养基 的dN补充来防止。我们还观察到:hIPSC群体内的yH2A.X阳性灶数目的显著异质性，这支持 了我们的假设，即：基因组不稳定性的发生跨越hIPSC群体来说是不均匀的，并且hIPSC的亚 群体很可能遭受另外的基因组DNA破坏，如通过yH2A.X染色所测定的，并且因此表示对发展 核型异常最为敏感的细胞。
[0244] dN补充促进基于CC的应力之后的hIPSC基因组稳定性
[0245] 我们在具有和不具有dN的条件下培养我们的hIPSC，以便研究dN补充是否可防止 在基于CC的应力期间观察到的基因组不稳定性。应注意，虽然hIPSC已被证明在重编程和延 长的培养期间累积基因组破坏（Ben-David等人（2010)Cell Cycle(Georgetown，Tex. )9: 4603-4604)，但是当我们通过进行CC对细胞施加应力时，我们观察到两种独立hIPSC系中最 为极端的基因组破坏(核型异常）。这个观察结果提供了在相对短的时段(2月）内诱导严重 基因组破坏的快速和一致的实验测定法。首先在Matr igel上以mTeSRI ( Stemcel 1 Technologies)和NutriStem( Stemgent)的组合来培养人iPSC。随后将它们分成在细胞培养 基中在外源性供应dN存在或不存在下（每一种dN为30yM)生长的两个组。在补充的一周之 后，我们开始向无异种条件的转换过程，这只需要切换为作为基底膜的CellStart以及 NutriStem培养基。在培养的两周之后，提取基因组DNA(gDNA)用于基于单一核苷酸多态性 (SNP)的杂合性损失(L0H)分析，所述分析先前已被证实是基于DSB的基因组不稳定性的一 种精确测量手段(Bester等人(2011 )Cell，145:435-446)。为测定两种条件(+/-dN)之间L0H 的水平，如先前所述使用AfTymetrix的SNP 6.0阵列来进行分析（Id.)。如通过L0H所测定， 补充dN将基因组不稳定性的发生率减少至未不充培养基中观察到的基因组不稳定性发生 率的20 % (图4)。结合在dN补充的4天之后yH2A. X阳性灶的显著减少（图3A和3B)，L0H的降低 提供了支持我们假设的证据，所述假设即：dN补充减少hIPSC重编程和培养中的复制应力和 相关联基因组不稳定性。
[0246]重要的是要注意到，先前的研究已将DSB的发生与人癌细胞中的L0H关联（Id.)，从 而突显了基于SNP的L0H测量法作为用于测定基因组不稳定性的可量化方法的价值。在我们 利用和不利用dN补充对的CC应力hIPSC进行的研究中，我们观察到:基因组稳定性的五倍增 加，如通过在CC诱导应力之后L0H的降低所测定。这可在图4中观察到，其中12个L0H染色体 基因座在基于CC的应力之后被鉴别。与在dN处理的hIPSC(由红色箭头标明）中所观察到的 L0H基因座相比，在未处理的hIPSC(由绿色箭头标明）中观察到表明基因组破坏的多达五倍 的L0H基因座。这提供了支持我们假设的强有力的证据，所述假设即：dN补充可改善hIPSC中 CC诱导的基因组不稳定性。然而，重要的是要注意到，L0H基因座的一半(如由蓝色箭头所标 明）在dN处理的样品和dN未处理样品中都是不稳定的。
[0247] 虽然已证明了功效，但是相信dN补充程序可被进一步优化。迄今所产生的数据都 支持以下假设:dNTP池缺乏在我们和其他人已在hIPSC中在一般培养和诱导应力之后观察 到的基因组不稳定性中起到关键作用。
[0248] 此外，我们的初步数据还暗示了用于增强临床级hIPSC和其衍生物的基因组稳定 性的简单和普遍适用的培养基脱氧核糖核苷补充程序。
[0249] 概括地说，我们提出的是:建立这种能够维持遗传稳定的干细胞和hIPSC和衍生物 的优化培养基系统将有助于安全地开启用于患者的基于个体化多能干细胞的治疗剂的未 来前景。
[0250] 实施例2
[0251] 获得稳定的干细胞dN浓度
[0252] 我们已获得了多种不同的STABLESTEM?浓度，一种针对短期培养(每一种dN为30y M)，一种针对长期培养(每一种dN为5yM)以及合适的30:30: 5:5混合物，所述混合物已被证 明在跨越多种细胞类型增强基因组稳定性、增加细胞功能和提高分化潜力方面是稳健的 (参见，例如表3)。
[0253] 表3.dN 浓度。
[0255] 长期STABLESTEM?培养基补充允许人iPS细胞增殖至少3周，同时显著减少细胞所 受的基因组破坏的量(图7);如由y H2A. X阳性双链断裂所测量的。在hIPSC重编程和培养期 间基因组不稳定性的原因尚不清楚。然而，我们最近发现的是:快速分裂的hIPSC中的三磷 酸脱氧核糖核苷酸(dNTP)池的大小比衍生出hIPSC的皮肤细胞的dNTP池显著更小。另外，我 们发现的是:将干细胞培养基补充脱氧核糖核苷(dN)可显著救援dNTP池（图6)。
[0256] 应了解，本文所述的实施例和实施方案仅用于说明性目的并且根据其产生的各种 修改或变化将为本领域技术人员所想到并且欲包括于本申请的精神和权限以及随附权利 要求的范围内。本文引用的所有公布、专利和专利申请出于所有目的据此以引用的方式整 体并入本文。
【主权项】
1. 一种用于培养具有提高的遗传稳定性的干细胞的细胞培养基，所述培养基包含： 用于干细胞的基础培养基，其中所述培养基补充有一种或多种三磷酸核苷或其一种或 多种前体。2. -种用于提高体细胞或干细胞遗传稳定性的核苷混合物传递(NCT)介质，所述介质 包含： 化妆品或药物递送媒介物;和 一种或多种三磷酸核苷或其前体。3. 如权利要求1所述的细胞培养基或如权利要求2所述的核苷混合物传递介质，其中所 述一种或多种三磷酸核苷独立地选自由以下各项组成的组:三磷酸脱氧腺苷(dATP)、三磷 酸脱氧鸟苷(dGTP)、三磷酸脱氧胞苷(NCTP)、三磷酸脱氧胸苷(dTTP)、三磷酸脱氧尿苷、三 磷酸腺苷(ATP)、三磷酸鸟苷(GTP)、三磷酸胞苷(CTP)、三磷酸5-甲基尿苷(m5UTP)和三磷酸 尿苷(UTP)。4. 如权利要求1所述的细胞培养基或如权利要求2所述的核苷混合物传递介质，其中所 述一种或多种三磷酸核苷独立地选自由以下各项组成的组:三磷酸脱氧腺苷(dATP)、三磷 酸脱氧鸟苷(dGTP)、三磷酸脱氧胞苷(NCTP)、三磷酸脱氧胸苷(dTTP)和三磷酸脱氧尿苷。5. 如权利要求1所述的细胞培养基或如权利要求2所述的核苷混合物传递介质，其中所 述一种或多种三磷酸核苷独立地选自由以下各项组成的组:三磷酸腺苷(ATP)、三磷酸鸟苷 (GTP)、三磷酸胞苷(CTP)、三磷酸5-甲基尿苷(m5UTP)和三磷酸尿苷(UTP)。6. 根据权利要求1和3-5中任一项所述的细胞培养基或根据权利要求2-5中任一项所述 的核苷混合物传递介质，其中所述培养基补充有或所述NCT介质包含独立地选自由以下各 项组成的组的三磷酸核苷的一种或多种前体：三磷酸脱氧腺苷（dATP)、三磷酸脱氧鸟苷 (dGTP)、三磷酸脱氧胞苷(NCTP)、三磷酸脱氧胸苷（dTTP)、三磷酸脱氧尿苷、三磷酸腺苷 (ATP)、三磷酸鸟苷（GTP)、三磷酸胞苷（CTP)、三磷酸5-甲基尿苷（m5UTP)和三磷酸尿苷 (UTP)〇7. 如权利要求6所述的细胞培养基或NCT介质，其中三磷酸核苷的所述一种或多种前体 独立地选自由以下各项组成的组:三磷酸脱氧腺苷(dATP)、三磷酸脱氧鸟苷(dGTP)、三磷酸 脱氧胞苷(NCTP )、三磷酸脱氧胸苷(dTTP)和三磷酸脱氧尿苷。8. 如权利要求6所述的细胞培养基或NCT介质，其中三磷酸核苷的所述一种或多种前体 独立地选自由以下各项组成的组:三磷酸腺苷(ATP)、三磷酸鸟苷(GTP)、三磷酸胞苷(CTP)、 三磷酸5-甲基尿苷(m5UTP)和三磷酸尿苷(UTP)。9. 根据权利要求1和3-8中任一项所述的细胞培养基或根据权利要求3-8中任一项所述 的NCT介质，其中所述培养基补充有或所述NCT介质包含三磷酸脱氧腺苷(dATP)或其前体。10. 如权利要求9所述的细胞培养基或NCT介质，所述培养基补充有或所述NCT介质包含 三磷酸脱氧腺苷。11. 如权利要求9所述的细胞培养基或NCT介质，所述培养基补充有或所述NCT介质包含 三磷酸脱氧腺苷的前体。12. 如权利要求11所述的细胞培养基或NCT介质，其中三磷酸脱氧腺苷的所述前体选自 由以下各项组成的组:二磷酸脱氧腺苷、单磷酸脱氧腺苷、脱氧腺苷和腺嘌呤。13. 根据权利要求1和3-12中任一项所述的细胞培养基或根据权利要求2-12中任一项 所述的NCT介质，其中所述培养基补充有或所述NCT介质包含三磷酸脱氧鸟苷(dGTP)或其前 体。14. 根据权利要求13所述的细胞培养基或NCT介质，其中所述细胞培养基补充有或所述 NCT介质包含三磷酸脱氧鸟苷。15. 根据权利要求13所述的细胞培养基或NCT介质，其中所述细胞培养基补充有或所述 NCT介质包含三磷酸脱氧鸟苷的前体。16. 如权利要求15所述的细胞培养基或NCT介质，其中三磷酸脱氧鸟苷的所述前体选自 由以下各项组成的组:二磷酸脱氧鸟苷、单磷酸脱氧鸟苷、脱氧鸟苷和鸟嘌呤。17. 根据权利要求1和3-16中任一项所述的细胞培养基或根据权利要求2-16中任一项 所述的NCT介质，其中所述培养基补充有或所述NCT介质包含三磷酸脱氧胞苷(NCTP)或其前 体。18. 如权利要求17所述的细胞培养基或NCT介质，其中所述细胞培养基补充有或所述 NCT介质包含三磷酸脱氧胞苷。19. 如权利要求17所述的细胞培养基或NCT介质，其中所述细胞培养基补充有或所述 NCT介质包含三磷酸脱氧胞苷的前体。20. 如权利要求19所述的细胞培养基或NCT介质，其中脱氧胞苷的前体选自由以下各项 组成的组:二磷酸脱氧胞苷、单磷酸脱氧胞苷、脱氧胞苷和胞嘧啶。21. 根据权利要求1和3-20中任一项所述的细胞培养基或根据权利要求2-20中任一项 所述的NCT介质，其中所述培养基补充有或所述NCT包含三磷酸脱氧胸苷(dTTP)或其前体。22. 如权利要求20所述的细胞培养基或NCT介质，其中所述培养基补充有或所述NCT介 质包含三磷酸脱氧胸苷。23. 如权利要求20所述的细胞培养基或NCT介质，其中所述培养基补充有或所述NCT介 质包含三磷酸脱氧胸苷的前体。24. 如权利要求23所述的细胞培养基或NCT介质，其中三磷酸脱氧胸苷的所述前体选自 由以下各项组成的组:二磷酸脱氧胸苷、单磷酸脱氧胸苷、脱氧胸苷和胸腺嘧啶。25. 根据权利要求1和3-24中任一项所述的细胞培养基或根据权利要求2-24中任一项 所述的NCT介质，其中所述培养基或NCT介质补充有三磷酸脱氧尿苷或其前体。26. 如权利要求25所述的细胞培养基或NCT介质，其中所述培养基补充有或所述NCT介 质包含三磷酸脱氧尿苷。27. 如权利要求25所述的细胞培养基或NCT介质，其中所述培养基补充有或所述NCT介 质包含三磷酸脱氧尿苷的前体。28. 如权利要求27所述的细胞培养基或NCT介质，其中三磷酸脱氧尿苷的所述前体选自 由以下各项组成的组:二磷酸脱氧尿苷、单磷酸脱氧尿苷、脱氧尿苷和尿嘧啶。29. 根据权利要求1和3-28中任一项所述的细胞培养基或根据权利要求2-28中任一项 所述的NCT介质，其中所述培养基或NCT介质补充有三磷酸腺苷(ATP)或其前体。30. 如权利要求29所述的细胞培养基或NCT介质，其中所述培养基补充有或所述NCT介 质包含三磷酸腺苷(ATP)。31. 如权利要求29所述的细胞培养基或NCT介质，其中所述培养基补充有或所述NCT介 质包含三磷酸腺苷的前体。32. 如权利要求31所述的细胞培养基或NCT介质，其中三磷酸腺苷(ATP)的所述前体选 自由以下各项组成的组:二磷酸腺苷、单磷酸腺苷、腺苷和腺嘌呤。33. 根据权利要求1和3-32中任一项所述的细胞培养基或根据权利要求2-32中任一项 所述的NCT介质，其中所述培养基补充有或所述NCT介质包含三磷酸鸟苷(GTP)或其前体。34. 如权利要求33所述的细胞培养基或NCT介质，其中所述培养基补充有或所述NCT介 质包含三磷酸鸟苷(GTP)。35. 如权利要求33所述的细胞培养基或NCT介质，其中所述培养基补充有或所述NCT介 质包含三磷酸鸟苷的前体。36. 如权利要求35所述的细胞培养基或NCT介质，其中三磷酸鸟苷的所述前体选自由以 下各项组成的组:二磷酸鸟苷、单磷酸鸟苷、鸟苷和鸟嘌呤。37. 根据权利要求1和3-36中任一项所述的细胞培养基或根据权利要求2-36中任一项 所述的NCT介质，其中所述细胞培养基补充有或所述NCT介质包含三磷酸胞苷(CTP)或其前 体。38. 如权利要求37所述的细胞培养基或NCT介质，其中所述培养基补充有或所述NCT介 质包含三磷酸胞苷。39. 如权利要求37所述的细胞培养基或NCT介质，其中所述培养基补充有或所述NCT介 质包含三磷酸胞苷的前体。40. 如权利要求39所述的细胞培养基或NCT介质，其中三磷酸胞苷的所述前体选自由以 下各项组成的组:二磷酸胞苷、单磷酸胞苷、胞苷和胞嘧啶。41. 根据权利要求1和3-40中任一项所述的细胞培养基或根据权利要求2-40中任一项 所述的NCT介质，其中所述培养基或NCT介质补充有三磷酸5-甲基尿苷(m5UTP)或其前体。42. 如权利要求41所述的细胞培养基或NCT介质，其中所述培养基补充有或所述NCT介 质包含三磷酸5-甲基尿苷。43. 如权利要求41所述的细胞培养基或NCT介质，其中所述培养基补充有或所述NCT介 质包含三磷酸5-甲基尿苷的前体。44. 如权利要求43所述的细胞培养基或NCT介质，其中三磷酸5-甲基尿苷的所述前体选 自由以下各项组成的组:二磷酸5-甲基尿苷、单磷酸5-甲基尿苷、5-甲基尿苷和胸腺嘧啶。45. 根据权利要求1和3-44中任一项所述的细胞培养基或根据权利要求2-44中任一项 所述的NCT介质，其中所述培养基补充有或所述NCT介质包含三磷酸尿苷(UTP)或其前体。46. 如权利要求45所述的细胞培养基或NCT介质，其中所述培养基补充有或所述NCT介 质包含三磷酸尿苷。47. 如权利要求45所述的细胞培养基或NCT介质，其中所述培养基补充有或所述NCT介 质包含三磷酸尿苷的前体。48. 如权利要求47所述的细胞培养基或NCT介质，其中三磷酸尿苷的前体选自由以下各 项组成的组:二磷酸尿苷、单磷酸尿苷、尿苷和尿嘧啶。49. 根据权利要求2-48中任一项所述的核苷混合物传递(NCT)介质，其中所述NCT介质 包含媒介物，所述媒介物被配制用于通过选自由以下各项组成的组的路线进行施用:皮下 施用、肠胃外施用、表皮施用、口服施用、鼻部或吸入施用、如通过涂料、气溶胶或以透皮方 式的局部施用。50. 根据权利要求2-48中任一项所述的核苷混合物传递(NCT)介质，其中所述NCT介质 包含媒介物，所述媒介物被配制用于表皮施用、皮下施用或皮内施用。51. 如权利要求50所述的核苷混合物传递(NCT)介质，其中所述介质被配制在选自由以 下各项组成的组的媒介物中：泥剂、草药混合物、脂肪、乳液、洗剂、乳剂、凝胶、生物剂、溶 液、喷剂、膏剂、泡沫、摩丝、液体、混悬液、分散液、气溶胶、皂、香波和调理剂。52. 如权利要求50所述的核苷混合物传递(NCT)介质，其中所述介质被配制为乳剂（例 如，面部乳剂）。53. 根据权利要求56-58中任一项所述的核苷混合物传递(NCT)介质，其中所述介质包 含选自由以下各项组成的组的制剂:皱纹去除乳剂、真皮填充剂、祛疤乳剂和痤疮治疗物。54. 根据权利要求1和3-48中任一项所述的细胞培养基或根据权利要求2-53中任一项 所述的核苷混合物传递(NCT)介质，其中补充所述培养基或包含所述NCT介质的所述三磷酸 核苷或其前体是以足以提高干细胞的短期和/或长期遗传稳定性的浓度存在，所述提高是 与没有通过三磷酸核苷或其前体补充的相同培养基中培养的相同细胞相比较而言。55. 如权利要求54所述的细胞培养基或核苷混合物传递(NCT)介质，其中所述干细胞是 选自由体细胞组成的组的干细胞。56. 根据权利要求1、3-48和54-55中任一项所述的细胞培养基或根据权利要求2-55中 任一项所述的NCT介质，其中补充所述培养基或包含所述NCT介质的每一种三磷酸核苷或其 前体是以在以下范围变化的浓度存在：约ΙμΜ直至约50μΜ，或约ΙμΜ至约40μΜ，或约ΙμΜ直至 约35μΜ，或约ΙμΜ直至约30μΜ。57. 根据权利要求1、3-48和54-55中任一项所述的细胞培养基或根据权利要求2-55中 任一项所述的NCT介质，其中补充所述培养基或包含所述NCT介质的每一种三磷酸核苷或其 前体是处于开始(储备）为或最终(外在递送)为以下各项的浓度：约50μΜ或更低，或约40μΜ 或更低，或约30μΜ或更低，或约25μΜ或更低，或约20μΜ或更低，或约15μΜ或更低，或约ΙΟμΜ或 更低，或约5μΜ或更低。58. 如权利要求所述57的细胞培养基或NCT介质，其中补充所述培养基或包含所述NCT 介质的每一种三磷酸核苷或其前体是以在约5μΜ至约30μΜ范围变化的开始(储备）或最终 (外在递送)浓度存在。59. 如权利要求所述57的细胞培养基或NCT介质，其中补充所述培养物所述培养基或包 含所述NCT介质的每一种三磷酸核苷或其前体是以在约30μΜ的开始(储备)或最终(外在递 送)浓度存在。60. 如权利要求57所述的细胞培养基或NCT介质，其中补充所述培养物所述培养基或包 含所述NCT介质的每一种三磷酸核苷或其前体是以在约5μΜ的开始（储备）或最终（外在递 送)浓度存在。61. 根据权利要求1、3-48和54-60中任一项所述的细胞培养基或根据权利要求2-60中 任一项所述的NCT介质，其中所述细胞培养基或所述NCT介质是无异种病原体的。62. 根据权利要求1、3-48和54-61中任一项所述的细胞培养基或根据权利要求2-61中 任一项所述的NCT介质，其中所述细胞培养基或所述NCT介质不具有动物或人来源的血清白 蛋白。63. 根据权利要求1、3-48和54-62中任一项所述的细胞培养基，其中所述补充培养基选 自由以下各项组成的组：DMEM(Dulbecco改良Eagle培养基）、MEM(最低必需培养基）、BME (Eagle基础培养基）、RPMI 1640、DMEM/F-12(Dulbecco改良Eagle培养基：营养物混合物F-12)、DMEM/F_10(Dulbecco改良Eagle培养基：营养物混合物F-10)、α-ΜΕΜ(α-最低必需培养 基）、G-MEM(Glasgow最低必需培养基）、MDM(Isocove改良Dulbecco培养基）、必需8(Ε8)培 养基和KnockOut DMEM。64. 如权利要求63所述的细胞培养基，其中所述基础培养基是DMEM/F12。65. 如权利要求2所述的核苷混合物传递(NCT)介质，其中所述NCT介质包含所述媒介物 和根据权利要求1、3_48和55-64中任一项所述的细胞培养基。66. -种体细胞或干细胞培养物或核苷混合物传递(NCT)培养物，所述细胞培养物包含 在根据权利要求1、3-48和55-64中任一项所述的细胞培养基中的细胞，或包含在根据权利 要求2-62和65中任一项所述的NCT介质中的细胞。67. 如权利要求66所述的细胞培养物或NCT培养物，其中所述体细胞或干细胞是选自由 体细胞或干细胞组成的组的细胞。68. 如权利要求66所述的细胞培养物或NCT培养物，其中所述细胞包括干细胞。69. 如权利要求68所述的细胞培养物或NCT培养物，其中所述干细胞选自由以下各项组 成的组:胚胎干细胞和成体干细胞，包括但不限于神经干细胞、肝干细胞、造血干细胞、脐带 血干细胞、表皮干细胞、胃肠干细胞、内皮干细胞、肌肉干细胞、间充质干细胞和胰腺干细 胞。70. 如权利要求68所述的细胞培养物或NCT培养物，其中所述细胞是诱导型多能干细胞 (IPSC)〇71. 如权利要求70所述的细胞培养物或NCT培养物，其中所述IPSC从选自由以下各项组 成的组的细胞重编程:成纤维细胞、神经干细胞、胃细胞、肝细胞、角质细胞、黑素细胞、羊膜 细胞、血液细胞、细胞和脂肪细胞。72. 如权利要求70或71所述的细胞培养物或NCT培养物，其中所述IPSC包括重编程选自 由以下各项组成的组的两个或更多个因子的细胞:KLF4(K)、LIN28(L)、c-MYC(M)、NAN0G (N) ;0CT4(0)、S0X2(S)和丙戊酸(VPA)。73. 如权利要求72所述的细胞培养物或NCT培养物，其中所述ISPC包括使用四个经典 Yamanaka因子KLF4(K)、c-MYC(M)、0CT4(0)和S0X2(S)重编程的细胞。74. 如权利要求73所述的细胞培养物或NCT培养物，其中所述重编程因子还包括LIN28。75. 根据权利要求70-74中任一项所述的细胞培养物或NCT培养物，其中所述IPSC是使 用选自由以下各项组成的组的载体来重编程:整合载体、非整合载体、可切除载体和无 DNA 载体。76. -种减少干细胞的遗传不稳定性的方法，所述方法包括:在根据权利要求1、3-48和 55-64中任一项所述的培养基根据权利要求的权利要求中任一项所述的细胞培养基中培养 所述细胞。77. -种进行自体干细胞转移的方法，所述方法包括:从受试者分离干细胞或从所述受 试者产生IPSC，和在根据权利要求1、3-48和55-64中任一项所述的细胞培养基中或在根据 权利要求2-62和65中任一项所述的NCT介质中扩增和/或培养所述干细胞或IPSC。78. -种促进组织的再生和/或维持的方法，所述方法包括：向受试者施用根据权利要 求2-62和65中任一项所述的NCT介质。79. 如权利要求78所述的方法，其中所述NCT介质包含媒介物，所述媒介物被配制用于 通过选自由以下各项组成的组的路线进行施用：皮下施用、肠胃外施用、表皮施用、口服施 用、鼻部或吸入施用、如通过涂料、气溶胶或以透皮方式的局部施用。80. 如权利要求78所述的方法，其中，其中所述NCT介质包含媒介物，所述媒介物被配制 用于表皮施用、皮下施用或皮内施用。81. 如权利要求80所述的方法，其中所述NCT介质被配制在选自由以下各项组成的组的 媒介物中：泥剂、草药混合物、脂肪、乳液、洗剂、乳剂、凝胶、生物剂、溶液、喷剂、膏剂、泡沫、 摩丝、液体、混悬液、分散液、气溶胶、皂、香波和调理剂。82. 如权利要求80所述的方法，其中所述NCT介质被配制为乳剂(例如，面部乳剂）。83. 如权利要求80所述的方法，其中所述NCT介质包含选自由以下各项组成的组的制 剂:皱纹去除乳剂、真皮填充剂、祛疤乳剂和痤疮治疗物。84. 根据权利要求78-83中任一项所述的方法，其中所述NCT被涂覆于人的皮肤。85. 如权利要求84所述的方法，其中所述NCT被涂覆来减少结疤。86. 如权利要求84所述的方法，其中所述NCT被涂覆来减少皱纹。87. 根据权利要求78-83中任一项所述的方法，其中所述NCT被皮内或皮下涂覆来增加 组织体积。
【文档编号】C12N5/074GK105849251SQ201480065970
【公开日】2016年8月10日
【申请日】2014年10月16日
【发明人】J·A·伯恩, C·拉度, P·李
【申请人】加利福尼亚大学董事会