专利名称：一种西索霉素高产菌种遗传改良的方法
一种西索霉素高产菌种遗传改良的方法
技术领域：
本发明涉及一种微生物遗传改良的方法，尤其涉及一种西索霉素高产菌种遗传改 良的方法。
背景技术：
氨基糖苷类抗生素具有水溶性好，性质稳定，抗菌谱广，抗菌杀菌能力强，吸收排 泄良好，与内酰胺类联合有协同作用等特点，自问世以来一直是临床上重要的抗感染 药物，尤其是作为治疗革兰氏阴性菌感染和结核病不可缺少的药物。由于此类抗生素存在 不同程度的耳、肾毒副作用，以及长期使用所出现的耐药情况，使人们不断致力于研制一些 对钝化酶稳定，对产酶菌、耐药菌具良好抗菌作用，且耳、肾毒性较低的氨基糖苷类新品种。西索霉素为小单孢菌产生的氨基糖甙类抗生素，属于碱性水溶性物质，其硫酸盐， 为白色有黄白色结晶性粉末，有引湿性，迅速溶于水，几乎不溶于乙醇，溶液有右旋性。抗菌 谱与庆大霉素近似，对金葡球和大肠杆菌、克霉白杆菌、变形杆菌、肠杆菌、绿脓杆菌、痢疾 杆菌等革兰阴性有效。对绿脓杆菌的抗菌作用，比庆大霉素强与妥布毒素近似。对沙雷杆 菌的作用，低于庆大霉素，但高于妥布霉素。为了进一步提高西索霉素生产菌种的发酵单位，提高产量、有效组分，及改善产品 质量，首先要从菌种工作做起，开展小单孢菌的遗传选育。由于小单孢菌生长缓慢、细胞壁 的结构特殊，对物理、化学诱变剂耐受性强，遗传稳定性好，不易引起遗传变异。因此必须采 用一种有效的诱变手段，才能达到良好的诱变效果。离子注入技术作为一种新型诱变手段具有跟常规物理化学诱变方法不同的地方。 离子注入对生物体的作用具有能量沉积、质量沉积、动量传递和电荷中和与交换的四种作 用。能量沉积不仅像其他电离辐射一样能导致生物体的直接损伤和间接损伤，而且还具有 更高的线性能量转移值(LET)和尖锐的电离峰(Bragg峰)；质量沉积能引起细胞内生物大 分子的移位和重排，并可生成新的产物；动量传递可导致细胞表面溅射，并像手术刀一样对 细胞表面进行刻蚀与加工，使细胞表面产生许多的微孔和洞；电荷中和与交换可以导致细 胞表面电性的变化而改变细胞的跨膜物理磁场，从而影响细胞的内外能量转换、物质运输、 信息传递等生物学过程。因此离子注入技术用于诱变育种有可能在损伤较轻的情况下获得 较高的突变率和较宽的突变谱。
发明内容本发明所要解决的技术问题在于提供一种西索霉素高产菌种遗传改良的方法，能 够有效的提高了西索霉素的产量。本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的一种西索霉素高产菌种遗传 改良的方法，将涂布有稀释好的伊尼奥小单孢菌菌悬液的培养皿置于真空度为10_3Pa的离 子注入机靶室的靶台上；接着对培养皿上的菌膜进行离子注入诱变，该离子注入的离子源 以5s脉冲式注入，且间隔15s、注入的剂量为50X 1013ions/cm2 200 X 1013ions/cm2 ；然后取出培养皿用无菌水洗脱，梯度稀释涂布于分离平皿，于34°C培养10天左右，用于单菌落 的筛选，以摇瓶发酵西索霉素的效价为标准，挑取高产菌株；经过反复多轮离子注入诱变选 育，获得一株效价达到1700u/ml左右的西索霉素高产菌株。进一步地，所述离子源为20KeV的氮离子。本发明一种西索霉素高产菌种遗传改良的方法的有益效果在于诱变获得的伊尼 奥小单孢菌，与原始菌株相比，发酵效价提高了 90%，利用该诱变获得的伊尼奥小单孢菌对 西索霉素进行选育，最终得到一株效价达到1700u/ml左右的西索霉素高产菌株，进而有效 的提高了西索霉素的产量。
具体实施方式本发明一种西索霉素高产菌种遗传改良的方法，将涂布有培养稀释好的伊尼奥小 单孢菌悬液的培养皿置于真空度为10_3Pa的离子注入机靶室的靶台上；接着对培养皿上的 菌膜进行离子注入诱变，该离子注入的离子源以5s脉冲式注入，且间隔15s，且每轮离子注 入的剂量不同时，每轮诱变获得的伊尼奥小单孢菌对西索霉素进行选育所得西索霉素菌株 的效价均有差异。实施例将培养好的伊尼奥小单孢菌新鲜斜面用接种铲下菌苔，置于含玻璃珠的三角瓶 震荡60min使菌体分散均勻，后根据菌体的数量用无菌水对其进行稀释，将稀释获得的菌 悬液均勻涂布于消毒后的干净培养皿上形成菌膜；把该培养皿置于离子注入机靶室德靶 台上，对培养皿上的菌膜进行离子注入诱变，其中，以20KeV的氮离子为离子注入的离子 源，靶室真空度为10’a，以5s脉冲式注入，间隔15s，注入的剂量为50X1013ions/cm2~ 100X1013ions/cm2 ；然后取出平皿，以1. 5mL无菌水洗脱，梯度稀释涂布于分离平皿，于 34°C培养10天左右，选取生长良好的单菌落接种于种子培养基上，于34°C、220rpm条件下 培养36h，后转接到发酵培养基上，于34°C、220rpm条件下发酵120h ；最后采用HPLC方法测 定西索霉素效价，选取效价比出发菌株提高10%以上的菌株，做进一步摇瓶复筛，从而获得 遗传性状稳定的高产菌株，效价提高了 90%左右。为了简化说明并便于比较本发明在注入离子剂量不同情况下所得结果的差异，在 以下几个对比例的说明中，仅针对与实施例的相异处进行说明，而不再对相同处作重复赘 述。对比例1本对比例与实施例的唯一不同之处在于注入离子的剂量为大于100X1013ionS/ cm2而小于等于150X1013ions/cm2，最终获得遗传性状稳定高产菌株的效价提高了 40%左
右o对比例2本对比例与实施例的唯一不同之处在于注入离子的剂量为大于150X1013ionS/ cm2而小于等于200X 1013ions/cm2，最终获得遗传性状稳定高产菌株的效价提高了 60%左
右o对比例3本对比例与实施例的唯一不同之处在于注入离子的剂量为大于等于25X1013ions/cm2而小于50X 1013ions/cm2，最终获得遗传性状稳定高产菌株的效价提高了 30%左右。对比实施例与对比例的结果可知利用离子注入技术诱变伊尼奥小单孢菌时，虽 然在离子注入的剂量不同的情况下，诱变获得的伊尼奥小单孢菌对西索霉素进行选育所得 西索霉素菌株的效价明显具有差异性，但该剂量与所得西索霉素菌株的效价并没有一定的 规律性，意外的是，当剂量为S0X1013ions/cm2 100X1013ions/cm2时，诱变所获得的伊 尼奥小单孢菌的发酵效价最高，其对西索霉素进行选育所获得的高产菌株的效价提高了 90%。另外，将实施例中获得的西索霉素高产菌株用于大罐发酵，具体过程如下按常 规方法进行摇瓶培养后，培养液接种于1T种子罐进行一级制种，其接种量为2%、温度为 34°C、转速为300rpm、通气量为1 1. 2v/v/m ；菌株在一级种子罐生长36h后转入二级6吨 繁殖罐，其移种量为10%、温度为34°C、转速为250rpm通气量1 lv/v/m ；菌株在二级繁 殖罐培养18h后移入35吨发酵罐，其移种量20%、温度为34°C、转速为200rpm、通气量为 1 lv/v/m、发酵周期120 150h;在发酵罐培养72h后开始定期取样测定效价，当西索霉 素效价达到1500u以上，总糖溶度低于0.5%后可以放罐。其中，一级种子罐的培养基组成为玉米淀粉1. 5 4. 5%，葡萄糖0. 2 0. 8%， 干酪素 0. 1 0. 6%，酵母粉 0. 3 1. 5%，蛋氨酸 0. 05 0. 1 %，CaC030 . 5 ~ 1. 0%, pH 6. 0 8. 0。二级繁殖罐与发酵罐的培养基组成均为玉米淀粉4 8 %，黄豆饼粉3 5 %，玉 米浆 0. 5 1. 0%，蛋氨酸 0. 05 0. 1%，CoCl 0. 001 0. 002%, CaC030 . 5 — 1. 0%, pH 6. 0 8. 0。
权利要求
一种西索霉素高产菌种遗传改良的方法，其特征在于将涂布有稀释好的伊尼奥小单孢菌菌悬液的培养皿置于真空度为10-3Pa的离子注入机靶室的靶台上；接着对培养皿上的菌膜进行离子注入诱变，该离子注入的离子源以5s脉冲式注入，且间隔15s、注入的剂量为50×1013ions/cm2～200×1013ions/cm2；然后取出培养皿用无菌水洗脱，梯度稀释涂布于分离平皿，于34℃培养10天左右，用于单菌落的筛选，以摇瓶发酵西索霉素的效价为标准，挑取高产菌株；经过反复多轮离子注入诱变选育，获得一株效价达到1700u/ml左右的西索霉素高产菌株。
2.如权利要求1所述一种西索霉素高产菌种遗传改良的方法，其特征在于所述离子 源为20KeV的氮离子。
全文摘要
本发明涉及一种西索霉素高产菌种遗传改良的方法，将培养好的伊尼奥小单孢菌斜面制成一定溶度的菌悬液，涂布于无菌培养皿上，对培养皿上的菌膜进行离子注入诱变，该离子注入的离子源以5s脉冲式注入，且间隔15s、注入的剂量为50×1013ions/cm2～200×1013ions/cm2，最后通过摇瓶发酵筛选高产且遗传形状稳定的菌株。本发明的优点在于诱变获得的伊尼奥小单孢菌，与原始菌株相比，发酵效价提高了90％，进而有效的提高了西索霉素的产量。
文档编号C12N15/01GK101864411SQ20101018401
公开日2010年10月20日 申请日期2010年5月26日 优先权日2010年5月26日 公开号201010184014.发明者周剑, 高悟岩 申请人:高悟岩;周剑