专利名称：一种麻疹病毒RT-tHDA检测试剂盒及检测方法
技术领域：
本发明涉及一种麻疹病毒RT-tHDA检测试剂盒及检测方法。
背景技术：
麻疹是由麻疹病毒引起的一种以发热、呼吸道症状与出疹为特征的急性传染病。自20世纪70年代全球实施扩大免疫规划(EPI)以来，全世界麻疹发病率、死亡率大幅度下降，但目前每年仍出现许多散发病例，并常常引起局部的流行。按照我国消除麻疹的工作要求，对出现的麻疹病例必须要进行实验室确认。
发明内容
本发明目的是提供一种依赖解旋酶恒温扩增技术快速检测麻疹病毒核酸的试剂 盒及检测方法。本发明采用的技术方案是—种麻疫病毒核酸的逆转录依赖耐热解旋酶恒温扩增(RT-ThermophilicHelicase-dependent Amplification, RT-tHDA)试剂盒，主要包括主要包括 RT-tHDA 反应试剂和特异性扩增引物，所述特异性扩增引物如下上游引物5，-AACACGAACAGATGACAAGTTGCGAAT-3’ ;下游引物5’ -TGTTATCCTTCAATGGTGCCCACTC-3 ’。本发明试剂盒的关键在于引物的选择，RT-tHDA反应试剂为RT-tHDA反应中所用的常规试剂，如 IsoAmp Enzyme Mix, MgC12, hermoScript Reverse Transcriptase 等,这些组分对于本领域技术人员来说属于公知常识，可根据需要自行配制，或者直接购买时候HAD试剂盒,如Biohelix公司的HDA试剂盒等。本发明还涉及利用所述试剂盒检测麻疹病毒的方法，所述方法包括(I)提取待测样品RNA ;所述样品RNA提取可按常规方法进行，如采用德国QIAGEN公司的RNeasy Mini Kit或其它试剂盒,按照试剂盒说明书进行提取。(2)以待测样品RNA为模板，加入特异性扩增引物和PCR反应试剂，配成RT-tHDA反应体系，进行扩增反应；(3 )对RT-tHDA反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，若出现于I IObp大小的电泳条带，则待测样品中含有麻疹病毒；反之则否。本发明中，所述扩增反应条件为65°C，120min。所述RT-tHDA反应体系终浓度组成如下IOxAnneal ing buffer Ii 5μ MgSO4 [100 (mM)] 1.75μ1 NaCl ( 500mM ) 4μ1 IsoAmp dNTP Solution 3.5μ1 IsoAmp Enzyme Mix 3.5μ 样品RNA 2μ1
20μΜ上下游引物各0.75μ1Invitrogen 公司耐热逆转录酶 ThermoScript Reverse TranscriptaseO. 5 μ I加水补齐至50 μ I。 目前，实验室确认麻疹的常用方法，包括血清学检测与病原学检测，前者用酶联免疫吸附实验(Enzyme-linked Immunosorbent Assay, ELISA)检测患者血清中的特异性麻疫免疫球蛋白(Immunoglobulin，Ig)M，后者则是以分离麻疹病毒和检测麻疹病毒核酸来进行确认。一般采用病毒分离、逆转录-聚合酶链反应(Reverse Transcription-PolymeraseChain Reaction, RT-PCR)或荧光定量RT-PCR方法进行核酸检测，但由于仪器成本较高，使其在基层推广时受到一定的限制。近年发展起来的依赖解旋酶的核酸等温扩增技术[Helicase-dependent Isothermal Deoxyribonucleic Acid(DNA)Amplification,HAD],模拟体内DNA复制的自然过程，使其扩增反应的全过程均在单一温度下进行，无需专门的扩增仪器，克服了 PCR反应需经历几十个温度变化的循环过程，特别适合在现场检测中应用。本发明自行设计特异性引物，建立了快速检测麻疹病毒核酸的逆转录依赖耐热解旋酶恒温扩增(RT-Thermophilic Helicase-dependent Amplification, RT-tHDA)方法,现将结果陈述如下。本申请发明人从美国的NCBI基因库上下载了近二十年来世界各地的麻疹病毒核酸序列，对其进行了同源性比较，在麻疹病毒核酸的血凝素基因设计若干对引物，对该区域进行特异性扩增，从中筛选出最佳的引物，并对RT-tHDA方法进行优化，验证其敏感性、特异性和重复性。经分别对腮腺炎病毒、风疹病毒、呼吸道合胞病毒与疑似患者临床样本的检测比较，该方法具有高特异性，只能检出麻疹病毒核酸，与其他呼吸道病毒均无交叉反应，而且比常规RT-PCR法更快速和简便。用建立的新方法，对近期浙江省疑似麻疹患者21份临床样本进行实验室快速诊断，获得了令人满意的结果，为该病及时采取控制措施发挥了很好的作用。本发明的有益效果主要体现在本发明方法对麻疹病毒的检测有高度的特异性，与其他呼吸道病毒腮腺炎病毒、风疹病毒、呼吸道合胞病毒等病毒无交叉反应；本发明方法检测的灵敏度高，可直接从疑似麻疹患者的含漱液、咽拭子、尿液等标本中检测麻疹病毒核酸，从病毒核酸提取至完成检测仅需3h左右。
图I. RT-tHDA方法检测麻疹病毒特异性结果；M :OX174_Hinc II DNAMarker ；1 麻疹疫苗株沪191 ；2 :麻疹流行株浙江/05/08 ；3 :风疹病毒；4 :腮腺炎病毒5. EV71 ；6 :呼吸道合胞病毒。图2为RT-tHDA方法检测不同稀释度麻疹病毒结果；图3为RT-PCR方法检测不同稀释度麻疹病毒；图2、图 3 中M ΦΧ174-Η ηο II DNA Marker ；1 的病毒浓度 5. 012X l(T7mol/L ；2 的病毒浓度
5.012Xl(T8mol/L ；3 的病毒浓度 5. 012 X l(T9mol/L ；4 的病毒浓度 5. 012 X l(T10mol/L ；5 的病毒浓度 5. 012X l(Tnmol/L ；6 的病毒浓度 5. 012 X l(T12mol/L。图4为直接从临床标本中检测麻疹病毒的结果； Μ. ΦΧ174-Η ηο II DNA Marker ；1 :阴性对照；2 :麻疹疫苗株沪191 ;3 6荧光定量RT-PCR检测阳性样本；7 :荧光定量RT-PCR阴性样本。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此实施例I :材料与方法I. I实验病毒株麻疹疫苗株沪191(上海，Shanghai ;S191 )、流行性腮腺炎(腮腺炎)病毒Jerry Lynn (JL)株,风疫病毒GOS株,呼吸道合胞病毒Long株,分别由上海生物制品 研究所与中国食品药品检定研究院提供。麻疹病毒流行株浙江(Zhejiang，ZJ) /05/08，肠道病毒71型(Enterovirus Type71, EV71)株，以及疑似麻疹患者含漱液、咽拭子、尿液等，由浙江省疾病预防控制中心(CDC)病毒所提供。I. 2引物设计对麻疹病毒不同基因型进行比对，选取各基因型病毒血凝素基因的共同保守区域设计引物，以保证引物的通用性。受DNA解旋酶解链能力影响，RT-tHDA产物大小控制在80碱基对(Base Pair, bp) 120bp，引物长度在24bp 30bp，DNA熔解温度(Melting temperature,Tm)设置在62°C 74°C,胞卩密唳及鸟嘌呤(Guanine and Cytosine,GC)百分比在40% 60%，引物内避免二级结构，引物间与引物内无互补序列，并用基于局部比对算法的搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool, BLAST)对所设计的引物进行特异性确认。根据以上条件设计一对特异性引物F:5， -AACACGAACAGATGACAAGTTGCGAAT-3，;R: 5 ’ -TGTTATCCTTCAATGGTGCCCACTC-3，。扩增片段大小为llObp，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成纯化。L 3病毒核酸的提取麻疹病毒核糖核酸(Ribonucleic Acid，RNA)的提取采用德国Roche公司的核酸提取试剂盒(High Pure Viral Nucleic Acid Kit),根据试剂盒说明书提取病毒RNA，置于_70°C保存备用。I. 4RT-tHDA的反应条件RT-tHDA采用Biohelix公司HDA试剂盒并添加耐热逆转录酶进行反应，反应体系50微升(μ 1)，其中IOXAnnealingbuffer ΙΙ5μ I、MgSO4[100毫摩尔(mM)]l. 75 μ I、NaCl (500mM) 4 μ I、IsoAmpdNTP Solution 以及 IsoAmp Enzyme Mix各3·5μ I、样品RNA2y 1、20μΜ上下游引物各O. 75μ I、Invitrogen公司耐热逆转录酶ThermoScript Reverse TranscriptaseO. 5 μ 1，加 ddw 至 50 μ I。将反应液混勻后，置于650C 120min进行反应后，取5μ I以O. 02克/毫升(g/ml)琼脂糖凝胶电泳观察结果。I. 5 常规 RT-PCR 反应麻疹病毒核酸序列引物 F: 5，-AACACGAACAGATGACAAGTTGCGAAT-3，;R: 5 ’ -TGTTATCCTTCAATGGTGCCCACTC-3，
扩增片断llObp。采用 TAKARA 公司 one step RT-kit (code :DRR024A)，按试剂盒说明书操作，反应体系为25μ 1，其中10父町- 0 缓冲液2.5111，]\%(122.5111 (25mM), dNTP混合物(各 IOmM) 2. 5 μ 1，RNase 抑制剂(40U/μ I) O. 5 μ 1，AMV 酶(5U/μ I) O. 5ul，Taq 酶(5U/y l)0.5ul，上游与下游引物(20μΜ)各 0·5μ 1，模板 RNA2y 1，DEPC 水 4·5μ I。反应条件为 50°C 30min,95°C 3min 进行逆转录，然后 95°C 20s, 50°C 25s，72°C 30s 进行扩增，40个循环后转入72°C lOmin，取5μ I产物电泳后判断有无特异性条带(110bp)。I. 6RT-tHDA特异性、敏感性和重复性试验分别对麻疹疫苗株沪191、麻疹流行株浙江/05/08、腮腺炎病毒、风疹病毒、EV71、呼吸道合胞病毒提取核酸，用本发明建立的RT-tHDA方法进行检测，比较其检测的特异性。用NanoVue分光光度计测麻疹病毒核酸原液浓度，将核酸原液进行10倍梯度稀释至10_5，采用相同引物和反应体积，平行进行RT-tHDA和RT-PCR反应，比较两种核酸扩增方法的敏感性。2 结果2. I特异性试验结果见图1，可见，本发明建立的RT-tHDA方法对麻疹病毒具有较好的特异性，对其他呼吸道病毒如腮腺炎病毒、风疹病毒、呼吸道合胞病毒等无交叉反应。2. 2敏感性试验用NanoVue分光光度计测麻疹病毒核酸原液浓度，将核酸原液进行10倍梯度稀释至10_5，采用相同引物和反应体积，平行进行RT-tHDA和RT-PCR反应，比较两种核酸扩增方法的敏感性，结果见图2、图3。结果可见，本发明建立的RT-tHDA方法对麻疹病毒的敏感性与RT-PCR反应相当，最低检出浓度均为10-10mol/L。2. 4临床样本的检测从近期浙江省各地麻疹疑似患者的含漱液，咽拭子和尿液共21份临床样本中直接提取病毒RNA，用本发明RT-tHDA和荧光定量RT-PCR方法(见操作I. 5)同时检测，结果本发明RT-tHDA方法检测出麻疹病毒核酸阳性20份，荧光定量RT-PCR法检测出麻疹核酸阳性20份，本发明麻疹病毒RT-tHDA方法和荧光RT-PCR方法检测麻疹病毒的阳性率相当。本发明麻疹病毒RT-tHDA方法用于临床样本检测的验证在4个平行实验室进行，均获得了满意的结果，图4显示的是临床样本的检测图谱。
权利要求
1.一种麻疹病毒RT-tHDA检测试剂盒，主要包括RT-tHDA反应试剂和特异性扩增引物，其特征在于所述特异性扩增引物如下 上游引物5 ’ -AACACGAACAGATGACAAGTTGCGAAT-3，; 下游引物5’ -TGTTATCCTTCAATGGTGCCCACTC-3’。
2.利用权利要求I所述试剂盒检测麻疹病毒的方法，所述方法包括 (1)提取待测样品RNA; (2)以待测样品RNA为模板，加入特异性扩增引物和PCR反应试剂，配成RT-tHDA反应体系，进行扩增反应； (3)对RT-tHDA反应产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，若出现于IlObp大小的电泳条带，则待测样品中含有麻疹病毒；反之则否。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述扩增反应条件为65°C，120min。
全文摘要
本发明提供了一种麻疹病毒核酸的依赖解旋酶恒温扩增检测试剂盒及检测方法。所述试剂盒主要包括RT-tHDA反应试剂和特异性扩增引物，所述特异性扩增引物如下上游引物:5’-AACACGAACAGATGACAAGTTGCGAAT-3’;下游引物:5’-TGTTATCCTTCAATGGTGCCCACTC-3’。本发明方法对麻疹病毒的检测有高度的特异性，与其他呼吸道病毒无交叉反应，且灵敏度高，可直接从疑似麻疹患者的含漱液、咽拭子和尿液等标本中检测麻疹病毒核酸，从病毒核酸提取至完成检测仅需3h左右，非常适用于麻疹病毒感染引起突发疫情的实验室早期诊断。
文档编号C12Q1/68GK102827949SQ20121029205
公开日2012年12月19日 申请日期2012年8月16日 优先权日2012年8月16日
发明者卢亦愚, 徐昌平, 冯燕, 马丽敏, 钟淑玲 申请人:浙江省疾病预防控制中心