专利名称：苯并噻二唑结合罗伦隐球酵母防治水果采后病害的方法
技术领域：
本发明涉及一种苯并噻二唑和罗伦隐球酵母(jCryptococcus IaurentiI)结合使用对水果采后病害生物防治的方法，属于水果采后病害生物防治领域。
背景技术：
水果在采摘、运销、储藏过程中因腐烂造成的损失是巨大的，也是全球关注的问题。据报道，在发达国家有10% - 30%的新鲜产品由于采后病害导致腐烂，而在缺乏贮运冷藏设备的发展中国家，果实采后腐烂率则高达40% — 50%。国外水果贮藏保鲜量占水果总产量60%以上，目前我国果品贮藏量800多万吨，不到总量的15%，其中冷藏库和气调库的贮藏量为70万吨，仅占总产量的7%。我国水果采后损失一般在20% - 30%,高者甚至达到50%。2007年3月国家统计局发布的《中华人民共和国2006年国民经济和社会发展统计公报》显示，2006年我国水果总产量达17050万吨。据此估算，我国水果采后的损失每年将达·到数百亿元人民币的水平。水果腐烂的主要原因在于病原微生物的致病作用，这些病原微生物主要有灰葡11 {Bo try tis cinerea ) >(.Rhizopus s toloniger ) > (.PeniciIlium spp.)、毛霉 iMucor spp.)、链格孢(Alterimriei spp.)、曲霉(AspergiIlus spp.)和软腐细菌(.Erwinia #.)等。病原微生物对采后水果的危害不仅在于其导致水果在数量上造成的严重损失，而且由于许多病原真菌能分泌产生许多次生代谢产物从而引起严重的食品安全问题，如扩展青霉(A ezpa/75 )产生的棒曲霉素(patulin)、灰葡萄孢(汉ciflerea )产生的葡双醒霉素(botrydial)等。目前最常用的控制水果采后腐烂的方法是低温贮藏和化学杀菌剂处理。近年来低温贮藏技术在我国得到了广泛的发展和应用，但已有的冷藏设备往往不能满足大多数水果的需要。同时，在低温条件下仍有相当数量的致病菌能够在水果上生长，并造成水果腐烂。例如，能引起多种水果灰霉病的灰葡萄孢{Botryris cinerea),也称灰霉菌,在-O. 5°C时也能生长繁殖，引起许多水果腐烂变质，造成严重经济损失。而那些对低温敏感的水果，因只能在不低于使产品受冷害的温度下贮藏，病原物的生长、繁殖不能得到有效地抑制，腐烂相当严重。长期以来，控制水果采后病害的主要措施是使用杀菌剂。化学杀菌剂对防治病害可以起到立竿见影的效果，但是，化学杀菌剂长期和大量的使用，不仅导致病原微生物产生抗药性，同时严重污染环境，有损于人类健康。美国国家科学院(National Academy ofScinces)的一份报告显示，在用于处理食品的全部农药中，杀菌剂构成60%的致癌危险。随着国家经济发展和消费水平的提高，人们对食品安全和环境保护意识的日益增强，目前多种化学杀菌剂(如CaptaruBenomyl等)已被明令禁止使用或者在部分水果产品上限制使用，其直接的后果是目前许多水果采后病害已经没有杀菌剂能予以控制。因此，各国科学家都在积极地探索能代替化学杀菌剂的安全、高效的新型水果采后病害防治方法。当前国际上对用拮抗微生物进行水果采后病害的生物防治的研究已经取得了阶段性的成果，并认为这是最有希望取代化学杀菌剂的方法之一。
随着酵母分类、生态、生理、生物化学和分子生物学的研究取得进展，人们对果蔬贮藏中利用酵母的兴趣日益提高。国内外的研究表明，许多酵母菌应用于水果表面，可以防治水果由致病霉菌引起的病害，这些酵母被称为拮抗酵母。酵母菌遗传稳定，抑菌谱广、效价高，一般不产生对人和寄主植物有害的代谢产物，安全性高，且对营养要求低，生长快，并对多种胁迫、逆境具有较强的耐受力，对大多数杀菌剂不敏感，对其它化学和物理处理能够相容。因此近年来拮抗酵母作为水果采后病害生防菌，受到国际上的广泛关注。国外方面，Sansone等从苹果表面分离得到的粘红酵母对由沒otryiis cinerea引起的灰霉病有显著的防治效果，在实验室条件下，其腐烂率与对照相比降低了 54%。Calvente等的研究也发现粘红酵母对水果采后青霉病害有显著的抑制效果。我国水果采后病害生物防治研究起步较晚，郑晓冬等在体外和体内抑菌试验中研究了粘红酵母对由指状青霉引起的柑桔青霉腐烂的抑制效果，发现粘红酵母在控制由指状青霉引起的柑桔腐烂中显示出了很高的抑菌活性，在25°C条件下，对照的发病率为100%，而使用I X IO8个/ml的菌悬液的发病率仅为45 %，而且随着酵母浓度的提高，发病率也有逐渐下降的趋势。张红印等研究了粘红酵母对草莓采后灰霉病的抑制效果，对草莓进行了前期的预处理后，接种I X IO9个/ml的菌悬液和I X IO5个/ml的病·原菌孢子菌悬液，分别在4°C下贮藏7天和20°C下贮藏2天后，发现接种粘红酵母的草莓，其腐烂率与对照相比分别降低了 95%和94.7 %。范青(2001)等对果实病害生物防治拮抗菌进行了筛选和分离，结果表明季也蒙假丝酵母{Candida guiIiermondii) > τ樣形克勒克酵母iKloeckeim、汉逊德巴利酵母{Debaryomyces hansenii)对甜樱桃褐腐病都表现出显著的抑制效果，季也蒙假丝酵母和柠檬形克勒克酵母能有效地防治核果类果实软腐病；Tian等(2004)的研究表明，在甜樱桃采前喷洒I X IO8个/mL的丝抱酵母{Trichosporon ,罗伦隐球酵母{Cryptococcus laurentif)和红酵母{Rhodotorula glut inis),分别在25°C, 0°C以及气调忙藏下，丝孢酵母对甜楼桃采后病害具有显著的抑制效果；张红印等(2005)研究了不同温度下，罗伦隐球酵母对灰霉病的防治效果，结果表明，25°C下，经罗伦隐球酵母处理的梨果，其灰霉病的发病率为16. 7%，显著地低于对照；罗伦隐球酵母结合CaCl2使用效果更显著。从国内外文献中可知当前以有效微生物取代化学杀菌剂用于采后水果病害的防治已显示出巨大的应用前景，水果采后病害的生物防治成为一个新的研究热点。但到目前为止，已实际应用于生产的拮抗菌种类不多，只有Biosave和Aspire等少数几种产品上市，而我国目前尚没有拮抗菌应用于实际生产。主要原因在于商业生产条件下，目前已报道的拮抗微生物的防治效果往往不如化学杀菌剂的效果，从而达不到保鲜要求。这些因素影响了拮抗菌作为果蔬保鲜剂在生产中的使用。为了尽快地将拮抗微生物应用于水果贮藏保鲜实际生产，还需进一步筛选拮抗效果好、抗病谱广的微生物，并进一步提高拮抗酵母的拮抗效力，从而将其应用于水果贮藏保鲜。苯并噻二唑(2，1，3-Benzothiadiazole，BTH)，化学名称为2，1，3-苯并噻二唑，是水杨酸的结构类似物，水杨酸是植物抗病反应的信号分子和诱导植物对非生物逆境反应的抗逆信号分子。BTH是一种典型的植物抗病诱导剂，离体条件下无杀菌活性，但能够诱导植物的免疫活性，活化物体内的防御机制，激发抗病蛋白的产生，诱导抗病性。近年来的研究发现，苯并噻二唑(BTH)具有广谱的诱抗活性，可诱导多种植物对细菌、真菌和病毒等产生抗性。近年来，BTH功能的研究已经成为生物学最重要、发展最迅速的研究领域之一。本发明利用苯并噻二唑和罗伦隐球酵母结合使用提高其对水果采后病害生物防治的效力，从而降低水果的腐烂率，进而达到水果贮藏保鲜的目的。
发明内容
本发明利用苯并噻二唑和罗伦隐球酵母结合使用来提高其对水果采后病害生物防治的效力。经苯并噻二唑和罗伦隐球酵母结合使用，可以明显地抑制水果病原菌，防治水果采后腐烂。本发明具有安全、高效、成本低等优点，可以广泛地用于水果采后病害的生物防治过程中，减少水果采后病害造成的损失。本发明提供了苯并噻二唑(BTH)结合罗伦隐球酵母使用防治水果采后病害的方法，按照下述步骤进行将罗伦隐球酵母活化，用NYDB培养基培养罗伦隐球酵母，离心得到菌体，配制含苯并噻二唑O. lg/Ι的酵母浓度为5X IO8菌悬液；将菌悬液均匀喷洒在水果·上，自然风干；放在塑料筐中，用保鲜膜密封后，放在室温条件下存放。其中所述的NYDB培养基为酵母膏5g，牛肉浸膏8g，葡萄糖10g，纯化水1000ml，pH自然。其中所述的罗伦隐球酵母(jCryptococcus laurentif)。其中所述的配制含苯并噻二唑O. lg/Ι的酵母浓度为5X IO8菌悬液方法，按照下述步骤进行将菌体用无菌水稀释制备成I X IO9个/ml的菌悬液，与浓度为O. 2g/l的苯并噻二唑按体积比I :1混合。其中所述的水果优选草莓或苹果。本发明的优点
(I)本发明所使用的罗伦隐球酵母(jCryptococcus laurentii)购于中国农业微生物菌种保藏管理中心(ACCC)，其拮抗效力强，对人体安全无害。(2)本发明使用苯并噻二唑和罗伦隐球酵母结合使用，与单独使用苯并噻二唑处理或罗伦隐球酵母处理相比，可以显著提高罗伦隐球酵母的拮抗活性，从而降低水果的腐烂率，进而达到水果贮藏保鲜的目的。(3)本发明使用苯并噻二唑和罗伦隐球酵母结合使用，可以代替化学杀菌剂防治水果采后病害，避免使用化学杀菌剂对人的危害，具有显著的经济效益和社会效益。
其中图I为苯并噻二唑与罗伦隐球酵母结合使用对草莓根霉病、灰霉病的控制效应；注=CK :对照；BTH :苯并噻二唑(O. lg/Ι);酵母罗伦隐球酵母菌悬液(5X IO8个/ml);BTH+酵母5X IO8个/ml罗伦隐球酵母菌悬液(含浓度为O. lg/Ι的BTH)。发病率是20°C放置4d后测定的结果。不同字母代表差异显著(P=O. 05)。图2为苯并噻二唑与罗伦隐球酵母结合使用对苹果青霉病的控制效应；注CK 对照；BTH :苯并噻二唑(O. lg/Ι);酵母罗伦隐球酵母菌悬液(5X IO8个/ml) ;BTH+酵母5 X IO8个/ml罗伦隐球酵母菌悬液(含浓度为O. lg/Ι的BTH)。发病率是25°C放置IOd后测定的结果。不同字母代表差异显著(P=O. 05)。图3、4为苯并噻二唑与罗伦隐球酵母结合使用对草莓自然腐烂的影响；注CK 对照；BTH:苯并噻二唑(O. lg/1);酵母罗伦隐球酵母菌悬液(5X IO8个/ml) ;BTH+酵母5 X IO8个/ml罗伦隐球酵母菌悬液(含浓度为O. lg/Ι的BTH)。不同字母代表差异显著性(P=O. 05)。图5为苯并噻二唑与罗伦隐球酵母结合使用对苹果自然腐烂的影响；注CK :对照；BTH:苯并噻二唑(O. lg/Ι);酵母罗伦隐球酵母菌悬液(5X IO8个/ml) ;BTH+酵母5 X IO8个/ml罗伦隐球酵母菌悬液(含浓度为O. lg/Ι的BTH)。不同字母代表差异显著性(P=O. 05)。
具体实施例方式通过借助以下实施实例将更加详细的说明本发明。以下实施例仅是说明性的，本发明并不受这些实施实例的限制。
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罗伦隐球酵母{Cryptococcus 7a T6Wiii),购于购于中国农业微生物菌种保藏管理中心(ACCC)，于NYDA (NYDB培养基的基础上添加2%的琼脂)培养基4°C低温保存。培养程序为(I)固体活化将罗伦隐球酵母接种于NYDA培养基中，在28°C培养48h ; (2)液体培养在250 ml的三角瓶中装入50 ml的NYDB种子培养基，用接种环接入一环活化好的罗伦隐球酵母，在200 rpm (转/分钟)，28°C条件下培养24h ; (3)离心分离再悬浮将酵母培养混合物在7000 Xg条件下,离心10-15 min,并用无菌蒸懼水洗漆2次，以去除培养介质，用无菌蒸馏水重新再悬浮，并用血球计数板调节酵母细胞浓度为IXlO9个/ml，再用灭过菌的生理盐水或BTH溶液稀释到所需浓度。实施例I :苯并噻二唑与罗伦隐球酵母结合使用对对水果病害的抑制效果
一、试验方案
供试的果实经过精细挑选，尽量选择果实均匀一致，表面无擦伤、机械伤和病虫伤害。将水果用无菌打孔器打孔，其中草莓的表面伤口为3mm (直径)X3mm (深)，苹果的表面伤口为5_ (直径)X3mm (深)。每个伤口处等量加入30 μ I以下处理液(I) 5 X IO8个/ml的罗伦隐球酵母菌悬液(含浓度为O. lg/Ι的BTH); (2) 5X IO8个/ml的罗伦隐球酵母菌悬液；(3)BTH (O. lg/Ι)和(4)无菌水。2 h后，再向草莓伤口处分别接种30 μ L以下致病菌孢子悬浮液草莓IX IO5个/ml的灰葡萄孢(Aoiirii1S ciflerea)孢子悬浮液、I X IO4个/ml的葡枝根霉(Miizopus)孢子悬浮液；向苹果伤口处接种30 μ L, 5 X IO4个
/ml的扩展青霉孢子悬浮液。自然晾干后,将果实放入塑料筐并用保鲜膜密封，恒温培养箱中培养(湿度95%)，苹果置于25°C，草莓置于20°C。每处理重复3次，每次重复10个果实。整个试验重复2次。经过若干天的培养，记录果实发病率，以此评价罗伦隐球酵母的抑菌效果。发病率的计算公式如下
发病率(%)=发病的果实/接种病原菌的果实总数X100%
_■、试验结果
按照上述步骤试验，统计水果的腐烂率结果如下
I.I对草莓根霉病、灰霉病的抑制效果
从图I可以看出，经罗伦隐球酵母单独处理、BTH与罗伦隐球酵母结合处理的草莓，其灰霉病发病率显著低于对照处理，其中结合处理效果最好，腐烂率为20. 83%，远远低于对照(100%,)，为对照处理的20. 83%。单独使用罗伦隐球酵母的腐烂率为36. 11%，为对照处理的36.11%。单独使用BTH处理对根霉病没有显著影响。罗伦隐球酵母单独处理和BTH与罗伦隐球酵母结合处理对草莓采后根霉病都有显著的抑制效果，其腐烂率分别为26. 38%和
12.5%，远远低于对照(100%，)，单独应用BTH对草莓采后根霉病的腐烂率为95. 83%，与对照相比没有显著影响。1.2对苹果青霉病的抑制效果
从图2可以看，罗伦隐球酵母(5X IO8个/ml)与BTH (O. lg/Ι)结合能显著抑制苹果青霉病的发病率，结合处理青霉病的发病率51. 39%，单独使用罗伦隐球酵母处理也能显著抑制苹果的青霉病，但是效果不如结合处理，发病率为72. 22%。单独使用苯并噻二唑处理不能显著降低苹果青霉病的发病率。实施例2 :苯并噻二唑与罗伦隐球酵母结合使用对水果自然腐烂的抑制效果· 一、试验方案
将以下处理液均匀喷于水果表面，自然晾干(1)5X108个/ml的罗伦隐球酵母菌悬液(含O. lg/Ι的BTH) ; (2) 5X IO8个/ml的罗伦隐球酵母菌悬液；(3) BTH (O. lg/Ι)和(4)无菌水。然后，将处理好的果实放入塑料筐用保鲜膜密封，草莓分别在20°C (RH 95%)的恒温培养箱中贮藏6天或4°C冰柜中贮藏10天后转入20°C (RH 95%)的恒温培养箱中贮藏I天；苹果室温下贮藏3个月。取出水果统计腐烂水果个数，并观察腐烂情况。每处理重复3次，整个实验重复2次。苯并噻二唑与罗伦隐球酵母结合使用对草莓自然腐烂的抑制效果以草莓的发病率表示，对苹果自然腐烂的抑制效果以苹果的腐烂指数表示。发病率的计算公式如下
发病率(%)=发病的果实/处理的果实总数X 100%
腐烂指数的计算方法观察苹果的腐烂情况，按照腐烂指数分级标准进行分级，再计算各组处理苹果的腐烂指数。腐烂指数分级标准O级果实完好无损；I级果实表面褐斑面积小于总面积的10% ；2级果实表面褐斑面积约占总面积的10%-30% ；3级果实表面褐斑面积约占总面积的30%-50% ；4级果实表面褐斑面积约占总面积的50%-70% ；5级果实表面褐斑面积大于总面积的709L腐烂指数=Σ (腐烂级别X腐烂个数)/ (苹果总数X 5) X 100%
_■、试验结果
按照上述步骤试验，统计草莓的自然腐烂率及苹果的腐烂指数结果如下
2.I对草莓自然腐烂率的影响
从图3可以看出，经过罗伦隐球酵母(5 X IO8个/ml)和BTH(O. lg/Ι)结合处理的草莓果实，在20°C (湿度95%)贮藏6天后，草莓果实的自然发病率均显著低于对照，为51. 67%，单独使用罗伦隐球酵母也能显著降低草莓果实的自然腐烂率但是效果不如结合处理好。从图4可以看出，低温贮藏情况下(4°C )，单独使用BTH对草莓自然腐烂没有显著的抑制效果。BTH与罗伦隐球酵母结合使用以及罗伦隐球酵母单独使用都显著抑制草莓自然腐烂，但两者之间的抑制效果没有显著差异。2. 2对苹果腐烂指数的影响
从图5可以看出，经罗伦隐球酵母(5X IO8个/ml)和BTH(0. lg/Ι)结合处理的苹果，其果实腐烂指数为18. 66 %，与对照苹果的腐烂指数(29 % )相比显著降低，BTH单独处理增大了苹果的腐烂指数，经罗伦隐球酵母单独处理的苹果的腐烂指数与对照苹果的腐烂指数相比较，两者的差异不显著。·
权利要求
1.苯并噻二唑(BTH)结合罗伦隐球酵母使用防治水果采后病害的方法，其特征在于按照下述步骤进行将罗伦隐球酵母活化，用NYDB培养基培养罗伦隐球酵母，离心得到菌体，配制含苯并噻二唑O. lg/Ι的酵母浓度为5 X IO8菌悬液；将菌悬液均匀喷洒在水果上，自然风干；放在塑料筐中，用保鲜膜密封后，放在室温条件下存放。
2.根据权利要求I所述的苯并噻二唑(BTH)结合罗伦隐球酵母使用防治水果采后病害的方法，其特征在于其中所述的NYDB培养基为酵母膏5g，牛肉浸膏8g，葡萄糖10g，纯化水 1000ml, pH 自然。
3.根据权利要求I所述的苯并噻二唑(BTH)结合罗伦隐球酵母使用防治水果采后病害的方法，其特征在于其中所述的罗伦隐球酵母(jCryptococcus Iaurenti )。
4.根据权利要求I所述的苯并噻二唑(BTH)结合罗伦隐球酵母使用防治水果采后病害的方法，其特征在于其中所述的配制含苯并噻二唑O. lg/Ι的酵母浓度为5X108菌悬液方法，按照下述步骤进行将菌体用无菌水稀释制备成I X IO9个/ml的菌悬液，与浓度为O.2g/l的苯并噻二唑按体积比I :1混合。
5.根据权利要求I所述的苯并噻二唑(BTH)结合罗伦隐球酵母使用防治水果采后病害的方法，其特征在于其中所述的水果为草莓或苹果。
全文摘要
本发明公开了苯并噻二唑结合罗伦隐球酵母防治水果采后病害的方法，属于水果采后病害生物防治领域。将罗伦隐球酵母(Cryptococcuslaurentii)活化，接种到NYDB培养基中培养24h，离心得到菌体，将菌体用0.1g/l的苯并噻二唑稀释制备成5×108个/mL的菌悬液；将菌悬液均匀喷洒于水果上，自然风干；放在塑料筐中，用保鲜膜密封后，放在室温条件下存放。本发明利用苯并噻二唑和罗伦隐球酵母结合使用提高其对水果采后病害生物防治的效力，使用简单，操作方便，效果好，成本低。其结合使用可以替代化学杀菌剂防治水果采后病害，避免使用化学杀菌剂对人的危害，具有显著的经济效益和社会效益。
文档编号A23B7/155GK102783518SQ201210291499
公开日2012年11月21日 申请日期2012年8月15日 优先权日2012年8月15日
发明者任晓锋, 孙瑜, 张红印 申请人:江苏大学