专利名称：Pcr-焦磷酸法检测单增李斯特菌的检测引物、试剂盒和检测方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及PCR-焦磷酸法检测单增李斯特菌的检测引物、试剂盒和检测方法。
背景技术：
单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes, LM0),简称单增李斯特菌,是ー种重要的食源性致病菌，能引起人和动物的李斯特菌病，临床表现为人和动物脑膜炎，败血症及孕妇流产、热性胃肠炎等，且死亡率极高，可达30%以上。随着分子生物学的发展，已有用普通PCR或荧光PCR检测VP的报道，虽然这些方法可达到快速、高通量的目的，但却无法获得分子诊断的黄金标准-基因序列，因此有出现假阳性的可能。焦磷酸测序(pyrosequencing)技术是近年来发明的一项实时地进行短片段DNA测序技术,该技术在DNA序列分析时不需要电泳和荧光标记，直接测定测序引物后面的碱基序列，通过提供可靠 的序列信息来确认PCR产物，同时由于主要分析PCR产物双链中的一条链的序列，避免了由于DNA链的ニ级结构造成的人工假象，使测序结果更加准确。
发明内容
本发明的目的是提供简便、快捷、准确性高、特异性强的PCR-焦磷酸法检测单增李斯特菌的检测引物、试剂盒和检测方法。本发明根据单增李斯特菌LMO溶血素基因hly (GenBank:DQ054589)，设计扩增引物和测序引物，建立了结合PCR-焦磷酸测序检测LMO的方法，达到从DNA碱基序列水平上快速、准确检测单增李斯特菌LMO的目的，从而实现了本发明的目的。本发明的PCR-焦磷酸法检测单增李斯特菌的检测引物，其特征在于，包括PCR引物和测序引物PCR 引物上游引物 F AGTATACCACGGAGATGCAGTGA ；(如 SEQ ID NO. I 所示)下游引物 R GGCAAATCAATGCTGAGTGTT ；(如 SEQ ID NO. 2 所示)测序引物S AATTTCGAGCCTAACCT (如 SEQ ID NO. 3 所示)。本发明的第二个目的是提供PCR-焦磷酸法检测单增李斯特菌的检测试剂盒，包括DNA提取试剂，PCR反应试剂，单链模板制备试剂，焦磷酸测序试剂，PCR引物和测序引物，其特征在于，所述的PCR引物和测序引物为PCR 引物上游引物 F AGTATACCACGGAGATGCAGTGA ；(如 SEQ ID NO. I 所示)下游引物 R GGCAAATCAATGCTGAGTGTT ；(如 SEQ ID NO. 2 所示)测序引物S AATTTCGAGCCTAACCT (如 SEQ ID NO. 3 所示)。本发明的第三个目的是提供非诊断目的的PCR-焦磷酸法检测单增李斯特菌的检测方法，其特征在于，包括以下步骤(I)对样品进行增菌培养，提取增菌液中菌体的基因组DNA作为模板；
(2)使用上述PCR弓丨物进行PCR反应，回收PCR产物，制备单链模版，然后应用上述测序引物对PCR产物进行焦磷酸测序，自测序引物3\端后的第一个碱基开始测序，测序引物后的21个DNA碱基序列为ATCCAGGTGCTCTCGTAAAAG时，判断样品中含有单增李斯特菌。优选，所述的PCR 反应，其扩增体系 50 iiL，PCR Mix Buffer 25 yl，Taq 酶 5 yl，MgCl2 I u 1,10 y M上、下游引物各2 u I,DNA模板I y I,去离子水14 y I,所述的PCR反应条件为预变性 95°C 4min ；95°C 15s，65°C 30s, ,72°C 30s，43 个循环；72°C 12min。本发明根据单增李斯特菌hly基因设计扩增引物和测序引物，建立了 PCR-焦磷酸测序，从DNA碱基序列水平上检测单增李斯特菌的方法。本发明先对目标片段进行PCR扩增，保证扩增片段的特异性，再用扩增产物制备单链模板，在测序引物的引导下进行焦磷酸测序。检测的所得碱基序列，用NCBI网站的BLAST功能反复比对时发现，单增李斯特菌hly基因测序引物后的喊基序列具有良好的特异性，测序引物后21个DNA喊基序列为ATCCAGGTGC TCTCGTAAAA G时就可鉴定为单增李斯特菌。试验结果显示，检测的16株LMO前21个碱基序列均与ATCCAGGTGC TCTCGTAAAA G序列完全匹配，而阪崎肠杆菌等对照菌株未测出DNA碱基序列或测出结果与测序引物后的21个碱基序列不匹配。模拟样品检测结 果，焦磷酸测序结果与传统检测方法一致，但在检测周期上传统方法需要培养、划线分离、生化鉴定等，需要4d-5d，而焦磷酸测序方法增菌一次增菌24h、第二次增菌18-24，核酸提取、PCR扩增和焦磷酸测序3h-4h，整个试验45h-48h完成，简便快捷，而且可通DNA碱基序列的水平上检测LM0，避免了单纯PCR扩增检测易污染造成的假阳性结果，准确性高。
图I是单增李斯特菌hly基因的PCR扩增产物电泳图，其中M:50bpmaker、l LM0ATCC19115、2-16 :LM0トLM015、17 :去离子水；图2是单增李斯特菌特异性试验PCR扩增产物电泳图，M: 50bpmaker、I: LMOATCC19115、2:阪崎肠杆菌、3:大肠杆菌、4:痢疾志贺氏菌、5:金黄色葡萄球菌、6:粪链球菌、7:藤黄微球菌、8:肺炎克雷伯氏菌、9 :小肠结肠炎耶尔森氏菌、10 :去离子水；图3是LMO ATCC19115焦磷酸测序结果图；图4是LMOl焦磷酸测序结果图；图5是LM02焦磷酸测序结果图；图6是LM03焦磷酸测序结果图；图7是LM04焦磷酸测序结果图；图8是LM05焦磷酸测序结果9是LM06焦磷酸测序结果图；图10是LM07焦磷酸测序结果图；图11是LM08焦磷酸测序结果图；图12是LM09焦磷酸测序结果图；图13是LM010焦磷酸测序结果图；图14是LMOll焦磷酸测序结果图；图15是LM012焦磷酸测序结果图；图16是LM013焦磷酸测序结果图17是LM014焦磷酸测序结果图；图18是LM015焦磷酸测序结果图；图19是大肠杆菌焦磷酸测序结果图；图20是金黄色葡萄球菌焦磷酸测序结果图。
具体实施例方式以下实施例是对本发明的进ー步说明，而不是对本发明的限制。实施例I :I材料和方法
菌株信息单增李斯特菌菌株共16株，其中标准菌株I株-单增李斯特菌ATCC19115，食品中分离的菌株15株，菌株信息见表I。阴性对照株8株，分别为阪崎肠杆菌ATCC29544、大肠杆菌ATCC25922、痢疾志贺氏菌NICPBP51252、金黄色葡萄球菌CMCC26003、粪链球菌ATCC2921、藤黄微球菌CMCC28001、肺炎克雷伯氏菌CMCC46102、小肠结肠炎耶尔森氏菌CMCC52221。上述菌株来自中国普通微生物菌种保藏管理中心、中国药品生物制品鉴定所和广东出入境检验检疫局技术中心。所有菌株均经VITEK2和API试剂条进行确证。表I :单增李斯特菌菌株信息
菌株编号样品来源菌株编号样品来源菌株编号样品来源
LMOl进n冻章鱼LMCP冻整壳夏夷贝LMCH 进「I紫石房蛤
LM04进n冻蟹子LM05进I!冻章负LM06进n冻章负
LM07猪肉LM08冰鲜三文鱼LM09鹅爪
LMOlO冻猪耳LMOll冻猪耳LM012冻凤爪
LM013冻或鱼LM014冻猪后脚LMO15 进ロ冻章鱼
ATCC19115标准菌株I. 2主要仪器和试剂焦磷酸测序PyroMark ID系统-瑞典Biotage公司；PCR扩增仪-PE9700型；核酸提取仪-日本PSS公司；PCR用Buffer、dNTP、琼脂糖、PCR分子量标记(50_500bp) Taq酶-宝生物工程(大连)有限公司；链亲和素标记磁珠(sepharosebeads) -GE. Healthcare公司；焦磷酸测序用酶、dNTP、结合缓冲液(Binding Buffer)、退火缓冲液(Annealing Buffer)、变性缓冲液(Denaturation Buffer)、洗漆缓冲液(WashingBuffer)等-QIAGEN上海办事处；李氏增菌肉汤LB1、LB2-北京陆桥有限公司。I. 3引物设计根据单增李斯特菌的hlyA基因(GenBank:DQ054589)序列中的保守区域，用PyroMark Assay Design软件设计引物和测序引物，上游引物 F:AGTATACCACGGAGATGCAGTGA，下游引物 R:GGCAAATCAATGCTGAGTGTT，测序引物SiAATTTCGAGCCTA ACCT,扩增片段为249bp，下游引物4端标记生物素，委托宝生物工程(大连)有限公司合成。I. 4模板制备所有菌株均用LBl增菌夜30°C ± 1°C培养24h，移取0. lmL，转种于LB2增菌液内，于30°C ± 1°C培养18h-24h。取Iml菌悬液移入离心管，12000r/min离心5min去上清，用Iml去离子水漂浮沉淀，12000r/min离心3min去上清,重复两次,最后加200 U I去离子水在核酸提取仪上提取DNA，作为DNA模板，用于PCR扩增。I. 5PCR扩增体系及电泳參数扩增体系50ii L，PCR Mix Buffer25 ii 1，Taq酶5u I, MgCl2 Iu I,IOuM 上、下游引物各 2u 1(上游引物 F: AGTATACCACGGAGATGCAGTGA,下游引物R: GGCAAATCAATGCTGAGTGTT)，DNA模板I y 1，去离子水14 yl。循环參数为，预变性950C 4min ；95°C 15s，65°C 30s, ,72°C 30s，43 个循环；72°C 12min，4°C保存。PCR 扩增产物 一部分在2%琼脂糖凝胶上电泳，另一部分用于焦磷酸测序。单增李斯特菌的hly基因PCR扩增結果，16株LMO均扩增出249bp大小的DNA片段(图1)，特异性试验结果如图2所示，由图2可以看出，阪崎肠杆菌、大肠杆菌、痢疾志贺氏菌、粪链球菌、藤黄微球菌、肺炎克雷伯氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌未见扩增条带，只有第5泳道金黄色葡萄球菌在200bp-250bp处有扩增带。I. 6单链模板制备及焦磷酸测序将15 U I PCR产物转移至96孔PCR板中，加入2 V- I 磁珠(sepharose beads), 20 U I 结合缓冲液(Binding Buffer)和 43 U I 纯水，常温震荡混20min ;打开真空泵,将真空预装工具prep tool在高纯水中清洗30秒,将prep tool移到96孔PCR板中，抓取其中的磁珠，待磁珠基本抓取完毕后将携带有磁珠的prep tool放入70%こ醇中5秒,再分别在变性缓冲液Denaturation Buffer和洗漆缓冲液WashingBuffer中各清洗20s 30s, prep tool放在装有退火预混液PSQ 96板(预先加入43 y I退火缓冲液 Annealing Buffer 和 2 y I 10 y M 测序引物 S:AAITTCGAGCCTAACCT)的上方，关掉真空泵，轻轻摇动释放磁珠，将PSQ 96板在80°C放置5min,自然冷却至室温后进行焦磷酸测序反应。测序程序采用SQA模式，按ATCG的碱基排列顺序，依次循环加入15次，根据软件给出的剂量在试剂仓中加入底物混合物、酶混合物和4种脱氧核糖核苷酸，将PSQ96孔板和试剂仓放入PyroMark ID系统中进行焦磷酸测序。测序峰及相应的DNA碱基序列由仪器SQA软件自动分析产生。I. 7焦磷酸测序结果判断16株LMO焦磷酸测序结果，根据模版浓度等条件的不同，测出37bp_64bp大小不等的DNA碱基序列(表2，图3-图18)，而阪崎肠杆菌、大肠杆菌、痢疾志贺氏菌、粪链球菌、藤黄微球菌、肺炎克雷伯氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌对照菌株未测出DNA碱基序列(图19，本研究只列出大肠杆菌焦磷酸测序结果图)。图2第5泳道的金黄色葡萄球菌焦磷酸测序结果，测的碱基序列为 ATCCAGGTGCTCTCAGTAAAGCAGTAITGCTAGTAAGTTAAGTAAAG (图 20 )，该序列与ATCCAGGTGCTCTCGTAAAAG比对，匹配的DNA碱基数仅为14个，即ATCCAGGTGCTCTC，因此判定为非LM0。16株LMO测序所得DNA碱基序列，分别与测序引物后的DNA序列比对，发现100%匹配的DNA碱基数为21bp-39bp，所有有效测序结果均超过21个碱基，表明设计的hlyA基因扩增引物和测序引物的特异性较好，并且可用测序引物后的前21个DNA碱基序列ATCCAGGTGCTCTCGTAAAAG来特异性地检测LMO。表2 :16株单增李斯特菌焦磷酸测序碱基序列结果
权利要求
1.ー种PCR-焦磷酸法检测单增李斯特菌的检测引物，其特征在于，包括PCR引物和测序引物 PCR 引物上游引物 F AGTATACCACGGAGATGCAGTGA ；下游引物 R GGCAAATCAATGCTGAGTGTT ； 测序引物 S AATTTCGAGCCTAACCTo
2.—种PCR-焦磷酸法检测单增李斯特菌的检测试剂盒，包括DNA提取试剂，PCR反应试剂，单链模板制备试剂，焦磷酸测序试剂，PCR引物和测序引物，其特征在于，所述的PCR引物和测序引物为 PCR 引物上游引物 F AGTATACCACGGAGATGCAGTGA ；下游引物 R GGCAAATCAATGCTGAGTGTT ； 测序引物 S AATTTCGAGCCTAACCTo
3.一种非诊断目的的PCR-焦磷酸法检测单增李斯特菌的检测方法，其特征在于，包括以下步骤 (1)对样品进行增菌培养，提取增菌液中菌体的基因组DNA作为模板； (2)使用权利要求I所述的PCR引物进行PCR反应，回收PCR产物，制备单链模版，然后应用权利要求I所述的测序引物对PCR产物进行焦磷酸测序，自测序引物3\端后的第一个碱基开始测序，测序引物后的21个DNA碱基序列为 ATCCAGGTGCTCTCGTAAAAG时,判断样品中含有单增李斯特菌。
4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述的PCR反应，其扩增体系50u L，PCR Mix Buffer 25 y 1，Taq 酶 5 y 1，MgCl2 I ii 1，10 y M 上、下游引物各 2 y 1，DNA 模板lul，去离子水14 iil，所述的PCR反应条件为预变性95 °C 4min ；95°C 15s, 65 °C 30s,，72°C 30s, 43 个循环；72°C 12min。
全文摘要
本发明公开了一种PCR-焦磷酸法检测单增李斯特菌的检测引物、试剂盒和检测方法。本发明根据单增李斯特菌hly基因设计扩增引物和测序引物，建立了PCR-焦磷酸测序，从DNA碱基序列水平上检测单增李斯特菌的方法。本发明先对目标片段进行PCR扩增，保证扩增片段的特异性，再用扩增产物制备单链模板，在测序引物的引导下进行焦磷酸测序。检测的所得碱基序列，用NCBI网站的BLAST功能反复比对时发现，单增李斯特菌hly基因测序引物后的碱基序列具有良好的特异性，测序引物后21个DNA碱基序列为ATCCAGGTGC TCTCGTAAAA G时就可鉴定为单增李斯特菌。
文档编号C12Q1/68GK102827931SQ201210291128
公开日2012年12月19日 申请日期2012年8月15日 优先权日2012年8月15日
发明者许龙岩, 袁慕云, 凌莉, 阳静, 唐勤, 陈碧玲, 易敏英 申请人:广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心