专利名称：一种在小鼠胚胎细胞中基因定点突变的构建方法
技术领域：
本发明涉及利用类转录激活子核酸酶快速基因编辑的方法，具体涉及一种在小鼠细胞中基因定点突变的构建方法。
背景技术：
随着人类基因组计划的完成，后基因组时代的生物研究迫切需要有效的手段来进行基因功能的分析。由于生理和遗传层面同人类较高的一致性，基因敲除小鼠模型成为了破译人类基因功能及寻找人类疾病治疗手段的有力工具。基因打靶技术是构建基因敲除小鼠的主要传统手段。基因打靶就是通过同源重组将外源基因定点整合入靶细胞基因组上某一确定的位点，以达到定点修饰改造染色体上某 一基因为目的的一项技术。传统基因打靶技术的限制因素之一是周期长且难度大的打靶载体构建过程。其次，由于动物细胞内自发的同源重组发生率只有10_5-10_6，将打靶载体电转入小鼠胚胎干细胞之后，要花费大量时间和人力物力筛选发生目的同源重组的胚胎干细胞。而且ES细胞在体外培养过程中对培养条件要求苛刻，稍有不慎将会引起其不可逆的分化，而使其失去生殖系转移能力，不能在后续操作中产生突变子代。再次，显微注射的ES细胞仅有一定的概率成功整合成为能够形成配子的生殖系细胞。并且要求ES细胞处于良好的生长及未分化的状态。另外，如果已有现成的目的基因被靶向的ES细胞，但与欲研究的小鼠品系不同，则将需要花费大量的时间进行回交，以稀释ES细胞原有的遗传背景。人工锌指核酸酶(Zinc Finger Nucleases, ZFN)技术是近年来发展起来的一项基因组定点修饰的技术。ZFN是一种由靶向特定DNA序列的锌指蛋白和具有非特异性作用的FokI核酸内切酶切割结构域组成的重组蛋白。一对人工设计的，识别特定的DNA序列的ZFN与目标DNA序列(通常为相邻两段各18-24bp，间隔4_7bp)结合之后，它们的FokI核酸内切酶将形成二聚体，从而切割DNA双链,形成双链断裂(double strand break, DSB)。该损伤主要通过易错性的非同源末端连接(Non-homologous end joining,NHEJ)以及高保真性的同源重组(homologous recombination,HR)进行修复。其中非同源末端连接通过造成目的基因的移码，可被用来对目的基因进行基因敲除。通过在受精卵阶段显微注射编码ZFN的DNA或相应mRNA，已实现对小鼠，大鼠，斑马鱼等模式生物的基因敲除。尽管ZFN技术在基础研究和应用领域有着广阔的前景，然而根据需要构建对特定DNA序列有高度特异性和亲和力的ZFN是一项劳动量大，周期长，成功率低的工作，这已经成为阻碍该ZFN大规模应用的瓶颈。ZFN的DNA识别结构域由若干个锌指模块组成，每个锌指模块识别特定的3个连续碱基，因此相邻的3 6个锌指模块可识别DNA上连续的9 ISbp个碱基。这种三连体识别模式意味着在可供靶向的DNA序列选择上有更小的灵活性。尽管已有数百种锌指模块，但是并没有涵盖所有可能的碱基排列组合。同时由于相邻锌指模块间的相互作用会影响其碱基识别的特异性(context dependence),因此ZF在构建过程中要经过大量的优化才能实现对目的基因的特异性结合。另外由于ZF相对较低的DNA结合特异性，ZFN在细胞内的过表达会由于脱靶效应(Off Target Effect)造成较高的细胞毒性。
发明内容
本发明的目的克服现有技术在构建基因敲除小鼠技术中存在的周期长，工作量大，难度高，效率低等不足，提供了通过在小鼠受精卵显微注射体外转录的靶向目标基因的TALEN信使RNA，实现快速构建基因敲除小鼠的方法。本发明涉及一种利用类转录激活子核酸酶快速构建靶向性基因组DNA改变的基因修饰小鼠的方法及其应用。本发明提供了一种在小鼠胚胎细胞中基因定点突变的构建方法，通过在小鼠胚胎细胞中引入特定核算序列构建基因定点突变小鼠，包括以下步骤(I)在小鼠目标基因组序列中确定目标靶序列；
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(2)按所述目标靶序列的顺序，构建能够识别并切割目标基因的TALEN核酸序列；(3)将所述TALEN核酸序列导入小鼠胚胎细胞内；所获得的小鼠胚胎细胞用于体外培养或直接植入母鼠，表达TALEN并切割目标基因组，从而筛选目标基因突变的小鼠。与传统方法相比，本发明方法省略了体外进行ES细胞筛选的过程，整个操作过程只需直接将核酸导入胚胎中，不需要将ES细胞引入胚胎，避免了因ES细胞在体外培养时因培养条件不符合要求时导致的不可逆分化。其中，所述小鼠目标基因组序列包括编码基因的基因组序列、低度重复序列、中度重复序列、高度重复序列、低拷贝序列、基因间的转录活跃序列或非转录序列。其中，所述小鼠胚胎细胞包括小鼠单细胞受精卵或多细胞小鼠胚胎。其中，所述步骤(3)是将所述TALEN核酸序列在体外转录为mRNA并纯化后，通过显微注射导入小鼠胚胎细胞。所述TALEN核酸序列可以通过质粒构建、人工合成等方法获得。其中，所述步骤(3)中，切割目标基因组所形成的DNA断裂位点通过非同源末端连接修复或通过同源重组修复。其中，所述目标基因突变包括碱基插入、缺失、改变、移码突变或敲除。其中，所述目标基因突变的小鼠是指通过选取目标基因发生突变的小鼠与野生型小鼠杂交，再选取上述杂交所得的同窝杂合子小鼠进行自交，然后从上述所得新生小鼠中筛选目标基因突变的纯合子小鼠。本发明还提供一种小鼠胚胎细胞，所述细胞是按权利要求1-7所述方法制备获得。本发明还提供一种纯合子小鼠，是含有按权利要求1-7所述方法制备获得的小鼠胚胎细胞。即，将按权利要求1-7所述方法制备获得的小鼠胚胎细胞用于体外培养或直接植入母鼠，表达TALEN并切割目标基因组，筛选获得目标基因突变的小鼠；再将其与野生型小鼠杂交，再选取上述杂交所得的同窝杂合子小鼠进行自交，然后从上述所得新生小鼠中筛选目标基因突变的纯合子小鼠。本发明米用类转录激活子核酸酶(Transcription Activator-Like EffectorNuclease, TALEN)实现对目标基因序列的特异性切割。TALEN由TAL effectors及其融合的FokI核酸酶组成。其中，TALE(TAL effectors)是由12个或以上特异性识别DNA的串联“蛋白模块”及其两侧的N-末端与C-末端序列组成。TAL effectors的DNA识别模块由34个氨基酸组成，每个TAL effectors的DNA识别模块与DNA结合的特异性是由第12位和第13位氨基酸残基决定的，被称作重复可变的di-residues (RVDs)位点。RVDs与A、G、C、T四种碱基有着恒定的对应关系，即NI识别A，NG识别T，HD识别C，NN识别G。因此，欲使TALeffectors识别并结合某一特定核酸序列，只须将TAL effectors的DNA识别模块按照目标DNA序列串联克隆即可。在实际操作中一般在目标基因中选择两处相邻(间隔15 20个碱基)的祀序列(一般十几个碱基)分别进行TAL effectors识别模块的构建。所构建的TALEN在细胞内识别并切割特定的目标基因序列,形成双链断裂(double strand break,DSB) ο该损伤通过易错性的非同源末端连接(Non-homologous end joining,NHEJ)进行修复后，将有2/3的概率造成目的基因的移码，从而实现对目的基因的敲除。另外，可通过在TALEN对基因组产生切割的细胞(或胚胎)中引入两端带有同源臂中间包含外源核酸序列的DNA片段，使断裂的基因组DNA以外源DNA片段为模板进行同源修复，这样使得在对目的基因进行敲除的同时，将所需的核酸序列引入目的基因的基因组中，形成定点敲入(Knockin)的细胞(或胚胎)。
本发明在小鼠胚胎中基因定点突变的构建方法，例如，在小鼠胚胎中实施基因敲除方法，包括步骤如下(I)在目标小鼠基因N端编码序列中寻找合适的靶序列。(2)按照上述靶序列的顺序，组装相应的TALEN识别模块，然后连入TALEN表达质粒。(3)将上述质粒体外转录成mRNA,并进行纯化。(4)将上述体外转录的mRNA显微注射入人工受精形成的小鼠受精卵。(5)将上述受精卵植入假孕母鼠输卵管内。(6)提取上述步骤所得子代小鼠的基因组DNA进行基因型鉴定。(7)将目标基因发生移码突变的小鼠分别与野生型小鼠杂交。(8)将上述杂交所得同窝的杂合子小鼠进行自交。(9)鉴定上述自交所得小鼠的基因型，筛选目标基因移码突变的纯合子小鼠。本发明的优点包括与现有技术ZFN介导的基因敲除技术相比，本发明采用的TALEN的DNA识别模块与单个碱基有着明确的对应关系，模块的排列组合方式不影响彼此的DNA识别与结合能力，从而成功解决了常规ZFN方法不能识别任意目标DNA序列，以及识别特性经常受上下游序列影响的问题，使得本发明在TALEN的串联DNA识别模块的构建过程中免去了 ZFN构建过程中相应的复杂而昂贵的优化筛选过程。本发明很大程度上降低了 TALEN的构建成本，便于普通实验室能够自己构建靶向目基因的TALEN。此外，因TALeffectors的碱基识别特异性，使TALEN在细胞内表现出更低的毒性。与传统的在小鼠胚胎干细胞内通过同源重组对目标基因进行敲除或改变相比，本发明避免周期长且难度大的打靶载体构建过程。其次，本发明中的显微注射TALEN信使RNA所得子代小鼠，如实施例所述，其中一条等位基因发生碱基缺失的概率高达80%，优选地，通过进一步优化实验条件和提高实验技能，突变率可达到90%以上。而现有技术及文献表明，通过小鼠胚胎干细胞内同源重组及后继筛选，发生定点敲除的概率不超过10%。筛选出的ES细胞还需经过胚胎显微注射而产生嵌合体小鼠。嵌合体小鼠如果发生生殖系转移(germline transmission)才有可能得到特定基因敲除的杂合子小鼠。而由于ES细胞在筛选过程中培养条件的变化而发生不可逆的分化，很可能突变的ES细胞分化的子代细胞不能进入生殖系而得不到敲除小鼠。本发明通过注射单细胞期的胚胎，不存在ES细胞分化的问题，因此通过重复实验是一般能够得到基因敲除的小鼠品系。本发明通过注射较高浓度的TALEN信使RNA实现了很高的突变效率，这在节省实验时间以及人力物力的投入方面有很大的意义。而且，这种高突变效率也将有助于该技术在产卵较少、生长周期较长且单个动物经济价值高的大型动物中的应用。再次，本发明直接向人工受精的小鼠受精卵中显微注射TALEN信使RNA，避免了周期长、劳动量大、筛选发生目的同源重组小鼠胚胎干细胞的过程。另外，本发明中构建TALEN质粒的环节只需要I 3周，从显 微注射到鉴定出目标基因发生移码的杂合子小鼠只需要I个月左右，而传统的通过在小鼠胚胎干细胞内进行同源重组构建基因敲除小鼠的周期通常需要至少一年的时间。本发明方法极大缩短了实验周期，有利于研究的闻效推进。本发明通过在小鼠胚胎中进行靶向任意基因组DNA并使其发生改变从而快速构建基因敲除小鼠方法，通过向小鼠受精卵中直接引入识别并切割目标基因的类转录激活子且含有核酸酶(Transcription Activator-Like Effector Nuclease, TALEN)的编码 DNA、mRNA、各种人工病毒颗粒或蛋白，通过DNA双链断裂(double strand break, DSB)以及由此引起的非同源末端连接(Non-homologous end joining, NHEJ)修复来造成目标基因的移码，从而获得目标基因敲除的FO代杂合子或纯合子小鼠。本发明克服了通过向小鼠受精卵注射人工锌指核酸酶(Zinc Finger Nucleases, ZFN)不能识别任意目标DNA序列，且识别特性经常受上下游序列影响的问题，以及由此带来的ZFN构建过程中复杂而昂贵的优化筛选过程。与传统的通过在小鼠胚胎干细胞内用同源重组打靶载体对目标基因进行敲除相t匕，本发明具有无需构建同源重组打靶载体、无需进行ES打靶细胞筛选，突变体比例高，操作简便，实验成本和周期大大减少等优点。
图I为一个典型的人工TALEN蛋白的结构示意图。图2为携带识别四种不同碱基的单个重复单元的载体示意图。
图3为构建识别二连核苷酸(AT)的双单元载体的示意图。图4为以双单元载体为起始材料，通过3轮酶切连接反应组装其中一侧TALE重复模块过程的示意图。图5为最终TALEN表达载体的构建示意图。图6为显微注射Lpr-TALEN所得新生小鼠所对应PCR产物T7E1酶切电泳图。图7为显微注射L印r-TALEN所得新生小鼠碱基缺失情况示意图。图8为显微注射Paklipl-TALEN所得新生小鼠所对应PCR产物T7E1酶切电泳图。图9为显微注射Paklipl-TALEN所得新生小鼠碱基缺失情况示意图。图10为Paklipl同源重组打靶载体示意图。
具体实施例方式结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。如按照Sambrook等人,分子克隆,实验室手册(New York ColdSpring Harbor Laboratory Press, 1989)所记载人,或按照厂商的建议条件。本发明在小鼠胚胎细胞中基因定点突变的构建方法，是一种进行靶向任意基因组DNA并使其发生改变的方法，该方法包括向小鼠细胞中引入识别并切割目标基因的类转录激活子核酸酶(TALEN)的编码核酸、蛋白或人工修饰的病毒等生物活性物质，这些生物活性物质最终通过转变成为能够识别特异DNA序列并具有对识别序列附近的DNA分子进行切割的蛋白质分子。然后，将细胞进行体外培养或者直接将其转入适宜的母鼠输卵管或者子宫中，使类转录激活子核酸酶表达并使得在切割位点附近的目标基因组DNA发生双联断裂，接着对该DNA断裂位点进行修复。其中，修复方式包括·(a)非同源末端连接修复。非同源末端连接修复导致基因突变(碱基插入、缺失)被引入到目的基因组序列中。(b)同源重组修复。同源重组修复使供体外源DNA序列引入到目标基因组DNA序列中，导致内源目标基因序列的改变。本发明中，小鼠细胞是小鼠胚胎细胞。小鼠胚胎包括小鼠单细胞受精卵或多细胞小鼠胚胎。本发明在小鼠胚胎细胞中基因定位突变的构建方法，包括基因突变或基因敲除，其步骤包括(I)在小鼠目标基因组序列中寻找合适的靶序列。(2)按照上述靶位点的碱基序列，构建相应的TALEN质粒/核酸序列。(3)将上述TALEN质粒DNA或其相应mRNA或相应蛋白质序列或相应人工病毒颗粒导入小鼠细胞。(4)将上述细胞植入适宜的母鼠输卵管或者子宫内。(6)提取上述步骤所得新生小鼠的基因组DNA进行鉴定。(7)选取目标基因发生移码突变或敲除的小鼠与野生型小鼠杂交。(8)选取上述杂交所得的同窝杂合子小鼠进行自交。(9)提取上述步骤所得新生小鼠的基因组DNA，筛选目标基因发生移码突变或敲除的纯合子小鼠。所述小鼠目标基因组序列为编码基因的基因组序列、低度重复序列、中度重复序列、高度重复序列、低拷贝序列、基因间的转录活跃序列或非转录序列。实施例I在小鼠细胞中Lpr基因敲除的构建
I、TALE靶位点的预测，即确定目标靶序列以L印r基因为本实施例中的小鼠目标基因组序列。登陆网页TAL EffectorNucleotide Targeter 2.O (https://boglab. pip. iastate. edu/node/add/talen-old),按照操作说明，将目的基因L印r的第三个外显子(由于未能在L印r的第一二个外显子中找到满足条件的靶位点)序列粘贴入相应文本框，勾选有关参数的选择框。设定拟被TALE模块识别的碱基数量Otepeat Array Length)范围，优选地，本实施例中设定为15-20 ;设定间隔区域(Spacer)碱基数量，优选地，本实施例中设定为15_20。经筛选得到了若干候选革巴位点。进一步地，本实施例选择的祀位点序列(SEQ ID NO. I)如以下所示LeftGCACTTAACCTGGCATAT|CCAATCTCTCCCTGGAA|ATTTAAGTTGTTTTGTGGCGTGAATTGGACCGTATA|GGTTAGAGAGGGACCTT|TAAATTCAACAAAACACCRight本实施例中，由于所用的TALEN质粒系统中位于TALE结合位点3’端用来识别碱基T的最后O. 5个TALE模块已经被预先整合进pCS2_FokI载体，因此，勾选选项“Requirea T atposition N”,从而使候选序列TALE结合位点3’端均为T。 2、TALE模块的组装，即构建能够识别并切割目标基因的TALEN质粒根据上述靶位点序列进行TALE模块组装。如图I所示的一个典型的人工TALEN蛋白的结构，位于中部的是重复的DNA结合模块，其左侧和右侧分别是来自TALE氮端的136个氨基酸和来自TALE碳端的63个氨基酸，更右侧的是FokI核酸酶的切割结构域。一个典型的天然存在的重复单元是由34个氨基酸组成，其中第12和第13位是决定DNA结合的特异性重复可变的di-residues (RVDs)位点。优选地，本实施例中使用的质粒系统采用了一种“替代重复单元”，使得在不影响蛋白编码的情况下“替代重复单元”的两端分别有SpeI和NheI这两个同尾酶酶切位点。该同尾酶体系使得通过重复的酶切以及连接反应进行TALE模块的构建成为可能。模块组装的起始材料为携带识别单个碱基的TALE模块的质粒，这些质粒是在PMD18-T (TAKARA)的基础上构建的。四个携带识别单个碱基的TALE模块质粒分别被命名为PA，pT，pC，pG，其相应编码的重复可变二连氨基酸分别是NI，NG, HD和NN，如图2所示的携带识别四种不同碱基的单个重复单元的载体示意图。每个载体分别携带一个单个替代TALE单元，后者分别带有编码NI，NG, NN, HD的RVD，从而分别识别碱基A，T，G，C。 靶向目标DNA序列的TALE模块可以通过一系列使用Nhel+HindlII以及Spel+HindHI的酶切-链接反应循环进行构建。图3所示为一个通过使用同尾的限制性内切酶NheI和SpeI，以及另外一个内切酶HindIII，将两个单个单元载体(A，T)通过一轮酶切连接反应构建成识别二连核苷酸(AT)的双单元载体的示例，其中S，N, H分别代表Spel，NheI以及Hindlll。以在识别单个碱基的TALE模块质粒的基础上构建识别5’ -AT-3’双碱基的TALE重复模块为例说明了 TALEN质粒的构建过程(I)用Nhel+Hindlll双酶切pA载体，37°C反应2小时。切胶回收含有TALE模块的线性化载体(此处为2. 8kb)。(2)用Spel+Hindlll双酶切pT载体，37°C反应2小时。切胶回收含有TALE模块的DNA片段(此处为102bp)。(3)使用T4Ligase对步骤(I)和⑵中回收的DNA片段和载体进行连接，16°C连接2小时。(4)将步骤(3)中的连接产物转化入DH5 α或类似的感受态，涂于氨苄抗性LB平板，放入37 °C恒温培养箱过夜。
(5)挑取步骤(4)中的克隆进行扩增，提取质粒，用Spel+Hindlll进行酶切，用2%琼脂糖胶进行电泳。释放的DNA片段大小约为204bp(102bpX2)的，即为阳性克隆。(6)重复步骤(I) (4)中的方法继续TALE模块的组装。最终得到的包含全部所需TALE模块的质粒pMD-TALE。按上述方法构建的4种碱基任意两两组合可得到16个质粒，在此基础上进行组装能够有效缩短所需要的时间。图4为以双单元载体为起始材料，通过3轮酶切连接反应组装其中一侧TALE重复模块过程的示意图。通过pMD18-T载体上多克隆位点两侧的测序引物(M13-47和RV-M)从两个方向对pMD-TALE载体进行测序，以确认TALE模块拼接无误。
用NheI酶切pCS2_FokI载体，其中用来结合左侧和右侧TALE模块的分别被命名为pCS2-PEAS和pCS2-PERR，并对其进行去磷酸化以防止其发生自连。其中pCS2_PEAS经过了 E484A，R487S点突变改造，pCS2_PERR进行了 D483R点突变改造，从而使两者只能形成异源二聚体，而不能形成同源二聚体，以此提高对靶位点识别的特异性，降低非特异性识别造成的脱靶效应。如图5所示的最终TALEN表达载体的构建，即，用Spel+Nhel双酶切pMD-TALE质粒，将所释放片段连入已用NheI线性化并去磷酸化的pCS2-FokI载体，其中左右两个TALE分别连入PCS2-PEAS和pCS2-ERR。将连接产物转化入感受态大肠杆菌，涂于氨苄抗性LB平板，37 °C培养过夜，并挑取克隆。通过使用SP6引物进行测序确定TALE模块在pCS2_TALEN载体中的插入方向。3、体外转录TALEN mRNA并进行显微注射取相同摩尔数(质量，如果TALE模块数相等的话)的上述步骤中TALE模块插入方向正确的PCS2-PEAS和pCS2-ERR质粒，进行混合，通过TALEN编码区下游的NotI位点进行线性化，使用SP6 mMESSAGE mMACHINE Kit试剂盒对线性化的质粒进行体外转录。将体外转录所得mRNA用试剂盒所提供的LiCl溶液进行沉淀，使用显微注射用TE重悬并将浓度稀释为20ng/y I。使用显微注射仪器将上述mRNA溶液注射入体外受精小鼠受精卵的原核部分，构建形成特定的小鼠胚胎细胞(受精卵)。体外培养1-2小时后将存活的受精卵移植入假孕母鼠的输卵管。4、新生小鼠的基因型鉴定新生小鼠出生2周后，剪取脚趾，抽提基因组DNA。在靶向切割序列上游设计PCR引物Pl (SEQ ID NO. 2)，下游设计PCR引物P2 (SEQID NO. 3)，以待鉴定小鼠基因组DNA为模板进行PCR扩增，PCR反应结束后对产物进行纯化，变性，缓慢退火，加入可识别并在非匹配的位点进行切割的HEndonuclease I，进行琼脂凝胶电泳。图6为显微注射L印r-TALEN所得新生小鼠所对应PCR产物T7E1酶切电泳图。如图6所示，其中每个泳道600bp左右条带为Paklipl鉴定引物P1，P2扩增所得产物，其中泳道I，2，3，4，6，7中约250和350bp处为经T7EI切割产生的条带，其中条带的强度与碱基缺失的数量成正比。Pl 引物序列TGCAAGGATTTCCAGAATCC
P2 引物序列GAATGCAGGCAGAACACAAC将第1，2，3，4，6，7号小鼠PCR产物分别连入pMD18T载体，分别挑取若干克隆提取质粒并进行测序，其中每只小鼠均有一定比例的克隆存在碱基缺失。图7为显微注射Lepr-TALEN所得新生小鼠碱基缺失情况示意图，如图7所示，其中带有灰色阴影的序列为TALEN左右两侧靶序列，其中折线所占据的位置分别为各小鼠所缺失的碱基。选取缺失非3的整数倍碱基的杂合型小鼠，分别与野生型小鼠杂交，并将所得到的同窝小鼠进行自交，即可得到目的基因Lepr敲除的纯合子小鼠。实施例2在小鼠细胞中Paklipl基因敲除与敲入的构建I、靶向Paklipl敲入位点的TALEN质粒的构建及验证
以Paklipl基因为本实施例中的小鼠目标基因组序列。登陆网页TALEffectorNucleotide Targeter 2.O (https://boglab. pip. iastate. edu/node/add/talen-old)，按照操作说明，将目的基因Paklipl的第一个外显子序列粘贴入相应文本框，勾选有关参数的选择框。设定拟被TALE模块识别的碱基数量(Repeat Array Length)范围，优选地，本实施例中设定为15-20 ;设定间隔区域(Spacer)碱基数量，优选地，本实施例中设定为15-20。由于Paklipl第一个外显子长度较短，未在其中找到满足条件的靶位点，进而提交了第二个外显子序列，经筛选得到了若干候选靶位点。进一步地，本实施例选择的靶位点序列(SEQ ID NO. 4)如以下所示LeftCCAACAGTCGCTATGT|AGTCTCTGGCAGCAA|AGATGAGACGATTCACGGTTGTCAGCGATACA|TCAGAGACCGTCGTT|TCTACTCTGCTAAGTGRight接下来按照实施例I中的思路进行TALE模块的组装，构建能够识别并切割目标基因的TALEN质粒，进而体外转录TALEN mRNA并进行显微注射。当新生小鼠出生2周后，剪取脚 止，抽提基因组DNA。在靶向切割序列上游设计PCR引物Ρ3 (SEQ ID NO. 5)，下游设计PCR引物Ρ4 (SEQID NO. 6)，以待鉴定小鼠基因组DNA为模板进行PCR扩增，PCR反应结束后对产物进行纯化，变性，缓慢退火，加入可识别并在非匹配的位点进行切割的HEndonuclease I，进行琼脂凝胶电泳。图8为显微注射Paklipl-TALEN所得新生小鼠所对应PCR产物T7E1酶切电泳图，如图8所示，其中每个泳道800bp左右条带为Paklipl鉴定引物P3，P4扩增所得产物，其中2，4，5号小鼠所对应的泳道中约200和600bp处为经T7E1切割产生的条带，其中条带的强度与碱基缺失的数量成正比。P3 引物序列TTGGCCCTTCTTGGTCCCTC。P4 引物序列TCCCACAGGCTTGTGCTCAC。将第2，4，5号小鼠PCR产物分别连入pMD18T载体，分别挑取若干克隆提取质粒并进行测序，其中三者分别有一定比例的克隆存在碱基缺失。图9为显微注射Paklipl-TALEN所得新生小鼠碱基缺失情况示意图，如图9所示，其中带有灰色阴影的序列为TALEN左右两侧靶序列，其中折线所占据的位置分别为各小鼠所缺失的碱基。通过以上实验证明针对该靶点的TALEN质粒是有效的，为接下来开展TALEN辅助下的同源重组奠定了基础。2、以靶位点两侧序列为同源重组引导序列构建敲入载体
图10为Paklipl同源重组打靶示意图。用引物对P5(SEQ ID NO. 7)，P6 (SEQ IDNO. 8)扩增靶位点左侧序列HRDSl和用引物对P7 (SEQ ID NO. 9)，P8(SEQ ID NO. 10)扩增靶位点右侧序列HRDS2，连入T载体，得到质粒pHRDSl+2，同时通过设计PCR引物时引入酶切位点使得HRDSl和HRDS2之间引入AscI酶切位点。然后以pEGFP-ACN载体为模板，用引物对P9(SEQ ID NO. 11), PlO (SEQ ID NO. 12)扩增得到带有pA的EGFP编码序列，并通过AscI酶切位点连入之前构建好的pHRDSl+2，PCR确定插入方向。将鉴定正确并线性化的DNA片段与Pakl ipI-TALEN mRNA显微共注射入小鼠受精卵的细胞核部分。得到小鼠后，使用分别与HRDSl和EGFP互补的一对引物鉴定并筛选发生目的敲入的小鼠。P5 引物序列ATGCAGATCTAGTCCGACATGTCAAGATGGP6 引物序列ATCCGGCGCGCCATACATAGCGACTGTTGGAGGP7 引物序列ATCCGGCGCGCCTCTGGCAGCAAAGATGAGACP8 引物序列ATCGGTCGACAACCTCAGGATAAGGAGCAC P9 引物序列GTATGGCGCGCCGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTPlO 引物序列CAGAGGCGCGCCTGAATTCGCCCTTATCGGCG。
权利要求
1.一种在小鼠胚胎细胞中基因定点突变的构建方法，其特征在于，包括以下步骤 (1)在小鼠目标基因组序列中确定目标靶序列； (2)按所述目标靶序列的顺序，构建能够识别并切割目标基因的TALEN核酸序列； (3)将所述TALEN核酸序列导入小鼠胚胎细胞内； 所获得的小鼠胚胎细胞用于体外培养或直接植入母鼠，表达TALEN并切割目标基因组，从而筛选目标基因突变的小鼠。
2.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述小鼠目标基因组序列包括编码基因的基因组序列、低度重复序列、中度重复序列、高度重复序列、低拷贝序列、基因间的转录活跃序列或非转录序列。
3.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述小鼠胚胎细胞包括小鼠单细胞受精卵或多细胞小鼠胚胎。
4.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)是将所述TALEN核酸序列在体外转录为mRNA并纯化后，通过显微注射导入小鼠胚胎细胞。
5.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，切割目标基因组所形成的DNA断裂位点通过非同源末端连接修复或通过同源重组修复。
6.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述目标基因突变包括碱基插入、缺失、改变、移码突变或敲除。
7.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述目标基因突变的小鼠是指通过选取目标基因发生突变的小鼠与野生型小鼠杂交，再选取上述杂交所得的同窝杂合子小鼠进行自交，然后从上述所得新生小鼠中筛选目标基因突变的纯合子小鼠。
8.—种小鼠胚胎细胞，其特征在于，所述细胞是按权利要求1-7所述的方法制备获得。
9.一种纯合子小鼠，其特征在于，所述纯合子小鼠含有按权利要求1-7所述方法制备获得的小鼠胚胎细胞。
全文摘要
本发明公开一种在小鼠胚胎细胞中基因定点突变的构建方法，通过在小鼠胚胎细胞中引入特定核算序列构建基因定点突变小鼠，包括以下步骤在小鼠目标基因组序列中确定目标靶序列；按所述目标靶序列的顺序，构建能够识别并切割目标基因的TALEN核酸序列；将所述TALEN核酸序列导入小鼠胚胎细胞内；所获得的小鼠胚胎细胞用于体外培养或直接植入母鼠，表达TALEN并切割目标基因组，从而筛选目标基因突变的小鼠。本发明具有无需构建同源重组打靶载体、无需进行ES打靶细胞筛选，突变体比例高，操作简便，实验成本和周期大大减少等优点。
文档编号C12N5/10GK102839156SQ20121029100
公开日2012年12月26日 申请日期2012年8月15日 优先权日2012年8月15日
发明者李大力, 邱中伟, 刘明耀 申请人:华东师范大学