专利名称：一种mdr1的g2677t/a单核苷酸多态性检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明属生命科学和生物技术领域，特别是一种MDRl的G2677T/A单核苷酸多态性检测试剂盒，采用基因测序技术，可以对MDRl (G2677T/A)多态性位点进行检测。
背景技术：
多药耐药基因I (multidrug resistance gene I, MDRl)位于人类染色体7q21. Γ21. 12，基因全长约209kb。MDRl 21外显子上的错义突变G2677T/A造成基因产物的氨基酸发生变化，丙氨酸(Ala)转变为丝氨酸(Ser)或苏氨酸(Thr)，使得该基因的表达和功能发生改变。MDRl的G2677T/A的多态性包括了以下6种GG型(野生纯合型)、GT型 (杂合型)、GA型(杂合型)、AT型(突变杂合型)、TT型(突变纯合型)、AA型(突变纯合型)。多药耐药(MDR)是导致肿瘤化疗失败及多种疾病预后差的重要原因之一，而P-糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp)机制是多药耐药的主要原因之一。Ρ-gp是I个由MDRl基因编码的分子量为170kD的细胞膜糖蛋白，具有广泛的作用底物，P-gp 一旦与抗肿瘤药物结合，便通过ATP提供能量，将药物从胞内泵出胞外，同时P-gp还能增加小肠壁对药物的排除从而造成耐药。G2677T/A的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)与P-gp活性的关系最为密切，且诸多研究表明G2677T/A影响了包括化疗药物、免疫抑制剂等许多药物的药代谢动力学，并与许多恶性肿瘤的发生、预后相关。于庆忠等在研究肺癌患者MDR1G2677T/A与钼类化疗疗效的相关性时发现，携带至少I个T等位基因的患者的化疗有效率2. 8%要显著低于其他基因型患者的58. 1% ；Kmi等对急性髓细胞性白血病患者的研究发现，G2677G的白血病患者的完全缓解率要明显高于携带其他基因型的患者；Kurata等在研究中发现G2677GG个体服用单剂量地高辛后，血清药物浓度低于G2677GT或者是 G2677TT个体；唐惠林等的研究表明，在844例肾病患者中，GG基因型患者的Csk剂量调整谷浓度明显低于其他基因型患者，同时GG基因型患者的给药后2h剂量调整浓度及平均日剂量与(TT+TA+AA)基因型患者之间有显著差异。因此，了解患者及不同人群中G2677T/A基因型情况，有助于临床医生更好地针对个体或群体的差异制定相关治疗方案和选择合适的药物及剂量。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种检测MDRl的G2677T/A单核苷酸多态性的试剂盒，可用于检测MDRl (G2677T/A)位点是否发生突变。一种MDRl的G2677T/A单核苷酸多态性检测试剂盒，包括红细胞裂解液、DNA提取液、PCR试剂、单链纯化试剂和测序试剂，其特征在于PCR试剂包括特异性扩增引物SEQ NOUSEQ NO 2，其序列为SEQ NO IGCAATAGCAGGAGTTGTTGAA,SEQ N02 Biot i n-TCTTAGAGCATAGTAAGCAGTAGG ；测序试剂包括特异性测序引物SEQ N03，其序列为
SEQ N03 GATAAGAAAGAACTAGAAGG 进一步地，所述PCR试剂包括2*PCR BufTerUOmM dNTP、5U/ul Taq酶、特异性扩增引物SEQ NOl和SEQ NO 2、灭菌水；所述单链纯化试剂包括链亲和素包被的磁珠、70%(V/V)乙醇、变性液、I XWash Buffer、结合缓冲液、退火缓冲液；所述测序试剂包括DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶、三磷酸腺苷双磷酸酶、底物APS、荧光素及dNTP。所述试剂盒的使用方法包括如下步骤(I)提取样本中的DNA(2)以DNA为模板，依据所述的特异性扩增引物(SEQ NOUSEQ NO 2)进行PCR扩增；(3)将步骤(2)所得的PCR产物以所述的标记生物素的引物序列进行单链纯化； (4)将步骤(3)得到的单链纯化产物进行测序；(5)结果分析。进一步地，步骤(2)的PCR反应按以下条件进行扩增94°C 2min预变性；98°C 10s、58°C 30s,68°C 30s, 38 个循环；68°C 5min。步骤(3)单链纯化的具体步骤为将得到的50ul PCR产物与3ul链亲和素包被的磁珠及47ul结合缓冲液混合，室温孵育l(Tl5min，期间震荡2 3次，然后使用Vaccuumprep tool吸取磁珠,将带有磁珠的Vaccuum prep tool先后放进70% (V/V)乙醇、变性液、 I Xffash Buffer中清洗IOs左右，再将Vaccuum prep tool放入含有49ul退火缓冲液及Iul测序引物(SEQ N03)的96孔板中，释放磁珠，将该96孔板放置于80°C 2min，再冷却至室温，即得到测序反应所需的单链纯化产物。步骤(5)结果分析的具体方法是将测序结果与标准序列对比，得到MDRl 2677位点的碱基类型。MDRl 部分标准序列为TTGGGACAGGAATAATTATATCCTTCATCTATGGTTGGCAACTAACACTGTTACTCTTAGCAATTGTACCCATCATTGCAATAGCAGGAGTTGTTGAAATGAAAATGTTGTCTGGACAAGCACTGAAAGATAAGAAAGAACTAGAAGGTGCTGGGAAGGTGAGTCAAACTAAATATGATTGATTAATTAAGTAGAGTAAAGTATTCTAATCAGTGTTATTTTGTTACTCCCTACTGCTTACTATGCTCTAAGAATGTGTTTATAACCATTCCTCAAAGCAATCTTTTTCATGCTTATT。其中下划线部分为2677位点。本发明的有益效果目前，对于检测MDRl的G2677T/A多态性的最可靠的方法就是进行测序，而本发明通过特异性引物扩增目的区域，并利用焦磷酸测序分析鉴定多态性。该方法不但保证了一定的准确性及灵敏度，同时相对Sanger测序法具备了较短的检测周期，具有灵敏度高，操作简单、成本低等优点。
图I是样本A测序图。测序结果为T￡CTGGGAAGGTGAGTCAAA，该样本是GG型(野生型)，图中方框部分是样本A基因型的判断区。图2是样本B测序图。测序结果为:TG (A)CTGGGAAGGTGAGTCAAA,该样本是GA型(杂合型)，图中方框部分是样本B基因型的判断区。图3是样本C测序图。测序结果为TG (T)CTGGGAAGGTGAGTCAAA,该样本是GT型(杂合型)，图中方框部分是样本C基因型的判断区。图4是样本D测序图。测序结果为:TT (A)CTGGGAAGGTGAGTCAAA,该样本是TA型(突变杂合型)，图中方框部分是样本D基因型的判断区。图5是样本E测序图。测序结果为TICTGGGAAGGTGAGTCAAA，该样本是TT型(突变纯合型)，图中方框部分是样本E基因型的判断区。图6是样本F测序图。测序结果为TACTGGGAAGGTGAGTCAAA，该样本是AA型(突变纯合型)，图中方框部分是样本F基因型的判断区。图疒12分别是样本么、8、(、03、？的犯叩虹测序图谱。目的是为验证图2 7的结果，最终发现两种测序检测结果一致。
具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应当注意的是，实施例中未说明的常规条件和方法，通常按照所属领域实验人员常规采用方法譬如，奥斯柏和金斯顿主编的《精 编分子生物学实验指南》第四版，或者按照制造厂商所建议的步骤和条件。实施例I检测MDRl (G2677T/A)单核苷酸多态性的试剂盒，包括红细胞裂解液、DNA提取液、PCR试剂、单链纯化试剂和测序试剂，其中(i)PCR 扩增试剂2*PCR BufferUOmM dNTP、5U/ul Taq 酶、扩增引物(SEQ NOUSEQ NO 2)及灭菌水；SEQ NOUSEQ NO 2的序列为SEQ NO IGCAATAGCAGGAGTTGTTGAA,SEQ N02 Biot i n-TCTTAGAGCATAGTAAGCAGTAGG ；(ii)单链纯化试剂链亲和素 bead、70% (V/V)乙醇、Denaturation Solution、I X WashBuffer、结合缓冲液、退火缓冲液；(iii)测序试剂DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶、三磷酸腺苷双磷酸酶、底物APS、荧光素及 dNTP (dNTP即dATP、dTTP、dCTP、dGTP)及测序引物(SEQN03)。SEQ N03 序列为GATAAGAAAGAACTAGAAGG。上述试剂盒的使用方法包括如下步骤( I)提取样本中的DNA(2)以DNA为模板，依据所述的特异性扩增引物(SEQ NOUSEQ NO 2)进行PCR扩增；(3)将步骤(2)所得的PCR产物以所述的标记生物素的引物序列进行单链纯化；(4)将步骤(3)得到的单链纯化产物进行测序；(5)结果分析。通过几百例临床受检样本用本试剂盒中的引物(SEQ NOUSEQ N02、SEQ N03)进行实时荧光定量PCR，发现其具有较高的扩增稳定性、特异性、灵敏度；同时使用Sanger测序法对相同的受检样本进行测序，结果两类方法的检测结果完全一致，说明本试剂盒具有极高的检测准确性。实施例2 本发明试剂盒的具体使用方法I、DNA 提取I)抽取300uL血液加入900uL红细胞裂解液，颠倒混匀，室温放置5分钟，期间再颠倒混勻几次。IOOOOrpm离心I分钟(若离心机最高转速不允许,可3000rpm离心5min),吸去上清，留下白细胞沉淀，加200uL缓冲液GA，振荡至彻底混匀。2)加入20 μ I蛋白酶K溶液，混匀后加入200 μ I缓冲液GB，充分颠倒混匀，70°C放置10分钟，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。3)加人200 μ I无水乙醇，充分振荡混匀15秒，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。4)将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中(吸附柱放入收集管中)，12，OOOrpm(13, 400Xg)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。5)向吸附柱CB3中加入500μ I缓冲液⑶(使用前请先检查是否已加入无水乙 醇)，12，OOOrpm(13, 400 Xg)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。6)向吸附柱CB3中加入700 μ I漂洗液PW (使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12，OOOrpm(13, 400 Xg)离心30秒，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。7)向吸附柱CB3中加入500 μ I漂洗液Pff, 12，OOOrpm(13, 400Xg)离心30秒，倒掉废液。8)将吸附柱CB3放回收集管中，12，000rpm(13，400Xg)离心2分钟，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。9)将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100 μ I洗脱缓冲液TE，室温放置2-5分钟，12，OOOrpm(13, 400 Xg)离心2分钟，将溶液收集到离心管中。2、PCR 扩增一例样本的总 PCR 体系为 50ul :2*PCR Buffer 25ul、10mM dNTP 10ul、引物 SEQNOl 和 SEQ N02 各 I. 25ul、5U/ul Taq 酶 lul、灭菌水 9ul、DNA 模板 2. 5ul。PCR 反应程序94 °C 2min 预变性；98 °C 10s, 58 °C 30s, 68 °C 30s, 38 个循环；68 °C 5min。3、单链纯化将得到的50ul PCR产物与3ul链亲和素bead及47ul结合缓冲液混合，室温孵育10 15min,期间震荡2 3次，以免bead下沉。然后使用Vaccuum prep workstation中的Vaccuum prep tool 吸取 bead,将带有 bead 的 Vaccuum prep tool 先后放进 70% (V/V)乙醇、Denaturation Solution、I X Wash Buffer 中清洗 IOs 左右，再将 Vaccuum prep tool 放入含有49ul退火缓冲液及Iul测序引物(SEQ N03)的96孔板中，释放bead，将该96孔板放置于80°C 2min，再冷却至室温，即得到测序反应所需的单链纯化产物。4、结果分析，具体方法为测序结果与标准序列对比，得到MDRl的2677位点碱基类型。MDRl部分标准序列为TTGGGACAGGAATAATTATATCCTTCATCTATGGTTGGCAACTAACACTGTTACTCTTAGCAATTGTACCCATCATTGCAATAGCAGGAGTTGTTGAAATGAAAATGTTGTCTGGACAAGCACTGAAAGATAAGAAAGAACTAGAAGGTGCTGGGAAGGTGAGTCAAACTAAATATGATTGATTAATTAAGTAGAGTAAAGTATTCTAATCAGTGTTATTTTGTTACTCCCTACTGCTTACTATGCTCTAAGAATGTGTTTATAACCATTCCTCAAAGCAATCTTTTTCATGCTTATT。其中下划线部分为2677位点。
实施例3临床样品检测取待检的临床样品A、B、C、D、E、F，按实施例2所述方法提取基因组、配制试剂并检测。PCR产物纯化后进行测序，将所得序列与标准序列比对，判断结果。样品A的测序结果图如图I所示，测序结果为T￡CTGGGAAGGTGAGTCAAA，该样本是GG型(野生型)，图中方框部分是样本A基因型的判断区。样品B的测序结果图如图2所示，测序结果为:TG (A) CTGGGAAGGTGAGTCAAA,该样本是GA型(杂合型)，图中方框部分是样本B基因型的判断区。样品C的测序结果图如图3所示，测序结果为:TG (T)CTGGGAAGGTGAGTCAAA,该样 本是GT型(杂合型)，图中方框部分是样本C基因型的判断区。样品D的测序结果图如图4所示，测序结果为:TT (A) CTGGGAAGGTGAGTCAAA’该样本是TA型(突变杂合型)，图中方框部分是样本D基因型的判断区。样品E的测序结果图如图5所示，测序结果为TICTGGGAAGGTGAGTCAAA，该样本是TT型(突变纯合型)，图中方框部分是样本E基因型的判断区。样品F的测序结果图如图6所示，测序结果为TACTGGGAAGGTGAGTCAAA，该样本是AA型(突变纯合型)，图中方框部分是样本F基因型的判断区。图疒12分别是样本么、8、(、03、？的犯叩虹测序图谱。目的是为验证图2 7的结果，最终发现两种测序检测结果一致。
权利要求
1.一种MDRl的G2677T/A单核苷酸多态性检测试剂盒，包括红细胞裂解液、DNA提取液、PCR试剂、单链纯化试剂和测序试剂，其特征在于 PCR试剂包括特异性扩增引物SEQ NOUSEQ NO 2，其序列为SEQ NOlGCAATAGCAGGAGTTGTTGAA,SEQ N02 Biot i n-TCTTAGAGCATAGTAAGCAGTAGG ； 测序试剂包括特异性测序引物SEQ N03，其序列为SEQ N03 GATAAGAAAGAACTAGAAGG
2.如权利要求I所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR试剂包括2*PCRBufferUOmMdNTP、5U/ul Taq酶、特异性扩增引物SEQ NOl和SEQ NO 2、灭菌水；所述单链纯化试剂包括链亲和素包被的磁珠、70% (V/V)乙醇、变性液、IXWash Buffer、结合缓冲液、退火缓冲液；所述测序试剂包括DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶、三磷酸腺苷双磷酸酶、底物APS、荧光素及dNTP。
3.如权利要求I或2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的使用方法包括如下步骤 (1)提取样本中的DNA (2)以DNA为模板，依据所述的特异性扩增引物(SEQNOUSEQ NO 2)进行PCR扩增； (3)将步骤(2)所得的PCR产物以所述的标记生物素的引物序列进行单链纯化； (4)将步骤(3)得到的单链纯化产物进行测序； (5)结果分析。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，步骤(2)的PCR反应按以下条件进行扩增94°C 2min 预变性；98°C 10s、58°C 30s,68°C 30s，38 个循环；68°C 5min。
5.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，步骤(3)单链纯化的具体步骤为将得到的50ul PCR产物与3ul链亲和素包被的磁珠及47ul结合缓冲液混合，室温孵育l(Tl5min,期间震荡2 3次,然后使用Vaccuum prep tool吸取磁珠,将带有磁珠的Vaccuumprep tool先后放进70%(V/V)乙醇、变性液、I Xffash Buffer中清洗IOs左右，再将Vaccuumprep tool放入含有49ul退火缓冲液及Iul测序引物(SEQ N03)的96孔板中，释放磁珠，将该96孔板放置于80°C 2min,再冷却至室温，即得到测序反应所需的单链纯化产物。
全文摘要
本发明公开了一种MDR1的G2677T/A单核苷酸多态性检测试剂盒，包括红细胞裂解液、DNA提取液、PCR试剂、单链纯化试剂和测序试剂,其特征在于PCR试剂包括特异性扩增引物SEQ NO1、SEQ NO2，其序列为SEQ NO1GCAATAGCAGGAGTTGTTGAA；SEQ NO2Biotin-TCTTAGAGCATAGTAAGCAGTAGG；测序试剂包括特异性测序引物SEQ NO3，其序列为SEQ NO3GATAAGAAAGAACTAGAAGG。
文档编号C12Q1/68GK102816845SQ20121029075
公开日2012年12月12日 申请日期2012年8月15日 优先权日2012年8月15日
发明者陈奕磊, 徐建成, 王淑一, 孙翠莲 申请人:吉林艾迪康医学检验所有限公司