专利名称：一种重组大肠杆菌及其用于制备芦荟大黄素的方法
技术领域：
本发明涉及一种重组大肠杆菌及其用于制备芦荟大黄素的方法，属生物技术领域。
背景技术：
芦荟大黄素(Aloe-emodin)，又称芦荟泻素，化学名称为1，8_二羟基_3_羟甲基蒽醌，是重要的蒽醌类物质，主要存在于芦荟叶的表层中，具有抗肿瘤、抗菌抗病毒、抗氧化等一系列生物活性，因而在医药、保健食品、化妆品、日用洗涤用品等行业，获得广泛应用。
芦荟大黄素分子结构如通式(I)所示，芦荟苷的分子结构示于通式(2)，从通式
(I)和通式(2)的分子结构式可以看出，芦荟大黄素蒽醌环ClO位上的羰基被葡萄糖取代后即构成了芦荟苷，芦荟苷是芦荟大黄素的糖苷衍生物。
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Cl)(2)在芦荟中，芦荟苷含量可达到干重的百分之十几甚至更高，相当于芦荟大黄素含量的十几倍甚至上百倍，芦荟苷的价格也远低于芦荟大黄素，因此，以芦荟苷为起始原料制备芦荟大黄素具有现实意义。多年来很多学者相继发表了涉及以芦荟苷为起始原料，经过水解氧化反应，得到芦荟大黄素的相关技术报道和专利，其中比较典型的方法有(I)张仰明等人(CN200610028926. 7)以氯化铁为氧化剂，在酸性条件下，将芦荟苷氧化得到芦荟大黄素。虽然产率较高，工业化操作简单易行，但是产生的废水中含有大量铁离子，可能会造成对环境的铁离子污染和产品中的铁残留。(2)中国专利申请号200580038713. 6公开了瑞士梅迪多姆实验室股份有限公司S ·卡里诺等人提出的一种制备芦荟大黄素的方法，即在强酸催化下，以二元醇或三元醇为溶剂，较高温度、较高压力下用含氧气体氧化芦荟苷得到芦荟大黄素。该方法较高效地制备了芦荟大黄素，但存在的最大问题在于反应过程需要在较高温度和较高压力的条件下使用含氧气体完成，对管道设备的要求较高，在实际生产中存在不安全因素。此外，成本也较高。(3)苏为科(CN101508637B)公开了另一种芦荟大黄素的制备方法，即以过硫酸盐为氧化剂，氧化芦荟苷制备芦荟大黄素。将芦荟苷和过硫酸盐氧化剂按一定比例加入到反应器中，加入水作为反应介质，在一定的温度条件下搅拌反应，即可完成芦荟苷向芦荟大黄素的转变，转化率较高。该方法工艺简单，转化率较高，其不足之处在于加入大量过硫酸盐强氧化剂，产生大量活性氧，易断裂芦荟大黄素蒽醌环，降低收率；反应温度较高；需要以纯芦荟苷为原料,也会增加生产成本。以上几种化学合成方法需使用强酸或较高温度或者氧气，需要特殊设备或者加入大量过硫酸盐强氧化剂。总之，反应条件不温和，对反应设备要求较高，而且能耗相对也较高，增加废水量不利于环境保护，而且反应没有选择性，容易产生各种副产物，增加产品分离提取的难度和经济成本，同时影响最终产品的纯度和应用效果。
发明内容
本发明提供了一种能够生物转化芦荟苷生成芦荟大黄素的重组大肠杆菌，已于2012年5月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号、中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No. 6114，其分类学命名为大肠埃希氏菌 Escherichia coli BL21trxB(DE3)-pET28a(+)。本发明的目的在于公开一种使用重组大肠杆菌培养液制备芦荟大黄素的方法，利·用微生物产生的酶作为催化剂，生物转化芦荟苷制备芦荟大黄素，具有反应条件温和，副产物少，无需特殊设备，能耗低，对环境友好等特点，以期克服现有技术存在的上述缺陷。为达到上述目的，本发明采用的技术方案是一种使用重组大肠杆菌制备芦荟大黄素的方法，包括发酵培养重组大肠杆菌Escherichia coli BL2ItrxB (DE3)-pET28a(+)E⑶0416CGMCC No. 6114，和从反应产物中纯化芦荟大黄素，其特征在于还包括酶促水解步骤将培养后的大肠杆菌发酵液过冷冻离心，获得的上清液作为酶源，以芦荟苷为底物，芦荟苷加入量为O. 05 7. 5g/L，酶的加入量为20 300U/g底物，在pH5. O 9. O的磷酸盐缓冲液中进行水解反应，反应温度为20 50°C，反应时间为2 24小时。所述酶液是将重组大肠杆菌发酵液(含菌体)经4°C、12000rpm,离心15min，弃沉淀，上清液即为酶液。所述酶活测定方法是将5ml酶液、5ml磷酸盐缓冲液(40mmol/L磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，pH7. 5,1.2% NaCl)、30mg芦荟苷，加入50ml三角瓶中，30°C、210rpm振荡反应20min，用HPLC法检测芦荟大黄素的含量。酶活单位(U)的定义在30°C、pH7. 5条件下，每小时酶促水解芦荟苷产生I微摩尔芦荟大黄素所需的酶量。水解反应的pH优先7 8。水解反应的温度优先25 40C。所说的磷酸盐缓冲液为磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，浓度为20 200mmol/L，其中含O. 2 I. 5% NaCl0发酵培养大肠杆菌菌种Escherichia coli BL2ItrxB(DE3)-pET28a(+)E⑶0416CGMCC No. 6114，依次包括下列步骤(I)平板培养将甘油保藏菌种在室温自然融化，接种到平板培养基上，25 40°C恒温培养I 2天；(2)种子培养摇瓶装液量10 30% (v/v)，培养温度25 40°C，摇床转速60 300rpm,恒温振荡培养I 4h (至OD600在O. 6 I. O之间)，4°C静置过夜；(3)发酵培养摇瓶装液量10 30% (v/v)，接种量2 10% (v/v)，培养温度20 50°C，摇床转速60 300rpm，恒温振荡培养5 24h。
所使用的平板培养基、种子培养基和发酵培养基均为LB培养基。种子培养基和发酵培养基均为LB液体培养基，配方为蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCllOg，溶于800ml去离子水中，用NaOH调pH至7. 5,加去离子水至1L, 121°C灭菌20min。平板培养基为LB固体培养基，在LB液体培养基基础上添加2. 0%琼脂粉，121°C灭菌20min后得到。所述从反应产物中纯化芦荟大黄素的方法是指，在酶促水解反应的混合液中，力口入600mL甲苯，萃取分液3次，合并萃取液，于60°C真空旋转蒸发浓缩至30ml左右，待冷却至室温后放置冰箱中，在4°C下保持I小时，再在-10°C下保持2小时；抽滤，洗涤结晶两次，60°C真空干燥。，本发明的积极效果是反应条件温和，副产物较少，提取纯化方便；不需要特殊设备，能耗低，对环境友好等特点，转化率可达到65 %以上，所得芦荟大黄素纯度大于98 %。 利用微生物产生的酶作为催化剂，在温和条件下催化水解廉价易得的芦荟苷，制备应用价值很高的稀有碳糖苷元——芦荟大黄素，市场应用前景宽广。生物材料样品保藏与生物材料存活证明
一种能够生物转化芦荟苷生成芦荟大黄素的重组大肠杆菌，其分类学命名为大肠埃希氏菌Escherichia coli,该菌株于2012年5月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号、中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No. 6114。
图I为本发明中芦荟大黄素的质谱图；图2为本发明中芦荟大黄素的核磁共振谱图。
具体实施例方式下面将通过实施例对本发明作进一步的阐述，其目的是为更好理解本发明的内容。因此，所举之例并不限制本发明的保护范围。本发明提供了一种能够生物转化芦荟苷生成芦荟大黄素的重组大肠杆菌，已于2012年5月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址北京市朝阳区北辰西路I号院3号、中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No. 6114，其分类学命名为大肠埃希氏菌 Escherichia coli BL21trxB(DE3)-pET28a(+)。本发明公开了一种使用重组大肠杆菌培养液生物转化芦荟苷制备芦荟大黄素的方法，包括发酵培养大肠杆菌Escherichia coli BL2ItrxB (DE3) -pET28a (+)，和从反应产物中提取纯化芦荟大黄素，其特征在于包括酶促水解步骤。菌种筛选将vector pET28a(+) (NcoI&EcoRI)载体直接转入 Escherichia coliBL2ItrxB(DE3)菌株，得到带卡那抗性的重组大肠杆菌E. coli BL2ItrxB(DE3)-pET28a(+)。将该菌接种到平板分离培养基上，37°C培养24h，再从平板中挑取单菌落培养。重复60个周期，得到能够代谢芦荟苷制备芦荟大黄素的重组菌株。平板分离培养基配方蛋白胨1%，芦荟苷0.4%，NaClO. 5%，琼脂2%。制备方法用INNaOH调节pH至7. 5，121°C灭菌20min。高压灭菌后待降温到55°C左右，加入芦荟苷，按照0. 5ml/L加入卡那霉素，摇匀后倒平板。发酵培养大肠杆菌Escherichia coli BL21trxB (DE3)-pET28a (+),依次包括下列步骤(I)平板培养将甘油保藏菌室温融化，接种到平板培养基上，25 40°C培养I 2天；(2)种子培养摇瓶装液量10 30% (v/v)，培养温度25 40°C，摇床转速60 300rpm,恒温振荡培养I 4h (至OD600在O. 6 I. O之间)，4°C静置过夜；(3)发酵培养摇瓶装液量10 30% (v/v)，接种量2 10% (v/v)，培养温度20 50°C，摇床转速60 300rpm，恒温振荡培养5 24h。所使用的平板培养基、种子培养基和发酵培养基均为LB培养基。种子培养基和发酵培养基均为LB液体培养基，配方为蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCllOg， 溶于800ml去离子水中，用NaOH调pH至7. 5,加去离子水至1L, 121°C灭菌20min。平板培养基为LB固体培养基，在LB液体培养基基础上添加2. O %琼脂粉，121°C灭菌20min。实施例中所述酶液是将大肠杆菌发酵液(含菌体)经4°C、12000rpm,离心15min，弃沉淀，上清液即为酶液。所述酶活测定方法是将5ml酶液、5ml磷酸盐缓冲液(40mmol/L磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，pH7. 5,1.2% NaCl)、30mg芦荟苷，加入50ml三角瓶中，30°C、210rpm振荡反应20min，用HPLC法检测芦荟大黄素的含量。酶活单位(U)的定义在30°C、pH7. 5条件下，每小时酶促水解芦荟苷产生I微摩尔芦荟大黄素所需的酶量。所述反应产物中纯化芦荟大黄素的方法是指水解反应产物中，加入600mL甲苯，3次萃取分液，合并萃取液，于60°C真空浓缩至30ml左右，待冷却至室温后放置冰箱，在4°C下保持I小时，再在-10°C下保持2小时；抽滤，洗涤结晶两次，60°C真空干燥。用HPLC法检测芦荟大黄素的纯度检测方法，并计算酶催化反应转化率芦荟大黄素高压液相检测方法色谱柱=Eclipse XDB-C18柱(4. 6mmX250mm，5 μ m);检测波长254nm ;流动相甲醇-水溶液(80 20);流速0. 8mL/min ;柱温室温。芦荟大黄素的质谱条件ESI离子源喷雾电压4. 5kV ;毛细管温度200°C ;毛细管电压45V ;鞘气(N2)流速40个单位；流动相甲醇0. 01mol/L乙酸铵水溶液(50 50V/V);流速0. 20mL/min ;负离子一级质谱全扫描。芦荟大黄素的核磁共振条件Varian XL400 (400MHz)超导核磁共振仪上进行，以DMSO-d6为溶剂，1H-匪R的工作频率为400. 13MHz。产物经质谱和核磁共振鉴定，表明产物确为芦荟大黄素。实施例I一株重组大肠杆菌菌株及其用于制备芦荟大黄素的方法，包括发酵培养重组大肠杆菌菌株 Escherichia coli BL21trxB (DE3)-pET28a(+)ECU0416CGMCC No. 6114 (I)平板培养将筛选出来的重组菌株，接种到平板培养基上，37°C恒温培养I天;(2)种子培养从平板上挑取菌落接种于种子培养基(250ml瓶装液50ml)，37°C、250rpm振荡培养4h (至OD600在O. 6 I. O之间)，4°C静置过夜；(3)发酵培养按4%接种量将种子液接种于发酵培养基(250ml瓶装液50ml)，于30°C、250rpm振荡培养llh，产酶量可以达到148U/L发酵液。上述重组大肠杆菌发酵终止后，将发酵液(含菌体)经4°C、12000rpm，离心15min,弃沉淀，上清液即为酶液。将300mg芦荟苷，50ml酶液，50ml磷酸盐缓冲液(40mmol/L磷酸氢二钠·磷酸二氢钠缓冲液，PH7. 5，I. 2% NaCl)加入到500ml三角瓶中，30°C、210rpm振荡反应8小时。加入600mL甲苯，3次萃取分液，合并萃取液。于60°C真空浓缩至30ml左右，待冷却至室温后放置冰箱，在4°C下保持I小时，再在-10°C下保持2小时。抽滤，洗涤结晶两次，60°C真空干燥。结晶产物经HPLC检测，纯度为98. 5%，酶促反应转化率为73%。产物质谱图如图1，显示分子量为270 ;产物核磁共振图谱如图2，由此确定产物为芦荟大黄素。实施例2实施例I中发酵终止后，将发酵液(含菌体)经4°C、12000rpm,离心15min，弃沉淀，上清液即为酶液。将500mg芦荟苷，75ml酶液，50ml磷酸盐缓冲液(160mmOl/L磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，pH8. 0,1. 5% NaCl)加入到500ml三角瓶中，25°C、210rpm振荡反应24小时。加入600mL甲苯，3次萃取分液，合并萃取液。于60°C真空浓缩至30ml左右，待冷却至室温后放置冰箱，在4°C下保持I小时，再在-10°C下保持2小时。抽滤，洗涤结晶两次，60°C真空干燥。结晶产物经HPLC检测，纯度为98. 2%，酶催化反应转化率为65%。·实施例3实施例I中发酵终止后，将发酵液(含菌体)经4°C、12000rpm，离心15min，弃沉淀，上清液即为酶液。将200mg芦荟苷，IOOml酶液，IOOml磷酸缓冲液(80mmol/L磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，pH7. 0，0. 6%NaCl)加入到500ml三角瓶中，40°C、210rpm振荡反应12小时。加入600mL甲苯，3次萃取分液，合并萃取液。于60°C真空浓缩至30ml左右，待冷却至室温后放置冰箱，在4°C下保持I小时，再在-10°C下保持2小时。抽滤，洗涤结晶两次，60°C真空干燥。结晶产物经HPLC检测，纯度为98. 3%，酶催化反应转化率为71. 8%。
权利要求
1.一株重组大肠杆菌菌株 Escherichia coli BL2ItrxB(DE3)-pET28a(+)ECU0416CGMCCNo. 6114。
2.采用权利要求I所述的菌种制备芦荟大黄素的方法，包括发酵培养重组大肠杆菌菌株 Escherichia coli BL21trxB (DE3)-pET28a(+)ECU0416CGMCC No. 6114，和反应产物中纯化芦荟大黄素，其特征在于包括酶促水解步骤将培养后的大肠杆菌发酵液冷冻离心，获得的上清液作为酶源，以芦荟苷为底物，芦荟苷加入量为O. 05 7. 5g/L，酶的加入量为20 300U/g底物，在pH5. O 9. O的磷酸盐缓冲液中进行水解反应，反应温度为20 50°C，反应时间为2 24小时。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述水解反应的pH优先选择7 8。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述水解反应的温度优选25 40°C。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液为磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，浓度为20 200mmol/L，其中含O. 2 I. 5% NaCl。
全文摘要
本发明涉及用重组大肠杆菌菌株Escherichia coli BL21trxB(DE3)-pET28a(+)ECU0416 CGMCC No.6114制备芦荟大黄素，属生物技术领域。本发明包括发酵培养重组大肠杆菌和从生物转化反应液中提取纯化芦荟大黄素，其特征在于包括酶促水解步骤将发酵培养后的大肠杆菌发酵液冷冻离心，获得的上清液作为粗酶液，以芦荟苷为底物，芦荟苷加入量为0.05～7.5g/L，酶的加入量为20～300U/g底物，在pH5.0～9.0的磷酸盐缓冲液中进行水解反应，反应温度为20～50℃，反应时间为2～24小时。积极效果是利用微生物产生的酶作为催化剂，催化水解价廉易得的芦荟苷，制备价值很高的稀有碳糖苷元——芦荟大黄素，具有反应条件温和，不需要特殊设备，能耗低，对环境友好等特点，转化率可达到65％以上，所得芦荟大黄素纯度大于98％。
文档编号C12P7/66GK102952773SQ201210290350
公开日2013年3月6日 申请日期2012年8月15日 优先权日2012年8月15日
发明者寇正福, 许建和, 刘坐镇, 江邦和, 牛艳丰 申请人:华东理工大学, 上海华震科技有限公司