专利名称：用于检测布鲁氏菌的lamp引物及含有该引物的试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及布鲁氏菌的检测，具体地说，涉及用于检测布鲁氏菌的LAMP引物及含有该引物的试剂盒。
背景技术：
布鲁氏菌(Brucella)是一种无芽孢、无鞭毛的对人畜有致病力的革兰阴性胞内寄生菌，是布鲁氏菌病(brucellosis,简称布病)的病原体。传统的布鲁氏菌种型包括羊种(3个型)、牛种(8个型)、猪种(5个型)、犬种(I个型)、绵羊附睾种(I个型)及沙林鼠种(I个型)，共6个种19个型。感染人的布鲁氏菌种以前三种居多。布病患者有发热、多汗、肝脾肿大、关节和全身肌肉痛等症状；布病因误诊误治容易转为慢性期，慢性期布病病程长， 易复发或发生再感染，可导致病人劳动力降低甚至丧失。动物感染后可导致流产、不孕、繁殖成活率下降等。在我国，布病被列为乙类传染病，羊种、牛种布鲁氏菌感染量居多，伴有猪种、犬种菌感染。诊断布病的金标准是分离培养布鲁氏菌，然而这种方法风险较大、耗时，阳性率仅为15% 70%。血清学方法虽然是目前国内最普遍的布病检测方法，但在布鲁氏菌感染早期没有抗体产生时，抗体检测方法受限，加之存在血清学交叉反应，所以仅靠血清学方法容易出现布病的误诊和漏诊。分子生物学方法特别是PCR技术能特异性地检测到布鲁氏菌核酸，而且该方法简单快速，将该技术用于布鲁氏菌的检测鉴定，可以提高布病临床诊断的准确性。然而采用常规PCR方法进行布鲁氏菌检测，对仪器设备(如PCR仪、凝胶成像系统)要求高，投入大，给技术的基层推广造成了极大障碍。
发明内容
本发明的目的是提供一种便于基层推广使用的，用于检测布鲁氏菌的LAMP引物及含有该引物的试剂盒。为了实现本发明目的，本发明的一种用于检测布鲁氏菌(Brucella)的LAMP引物组，其包括外侧正向引物F3 :5 ’ -GAACGTGTTGGATTGACCT-3 ’ ；外侧反向引物B3 :5’ -TGCTGTTGTCGATGCTATCG-3’ ；及内侧正向引物 FIP : 5 ’ -GCAGCCTATGATGCCGATCACTTGATCTGAGCCGTTGCCT-3 ’ ；内侧反向引物BIP :5’ -CCACACCCTTCAAGCCGGATAGCCGCTGCGAATAAAGCCAA-3’ ；以及环引物LB :5’ -AAGGCTTGAAGCTTGCGGA-3’ ；环引物LF :5，-CCTTCATTGCCAGCAATCTCA-3，。本发明还提供含有上述LAMP引物组的用于检测布鲁氏菌的试剂盒。前述试剂盒中还包括dNTPs、Bst DNA聚合酶、甜菜碱、Mg2+、反应缓冲液中的一种或多种。更优选地，前述试剂盒还包括标准阳性模板。本发明进一步提供上述LAMP引物组或试剂盒在检测布鲁氏菌中的应用，包括步骤1)提取样品中的DNA ;2)以步骤I)中提取的DNA为模板，进行LAMP-PCR扩增反应；3)分析PCR产物，即对上述扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，根据电泳检测结果判定样品中是否含有布鲁氏菌。其中，LAMP-PCR反应体系以25 μ I计为
模板DNAΙμ
IOmMdNTPs2.5μ1
20μΜ 引物 FIP2μ1
_7] 20μΜ 引物 BIP2μ1
20μΜ 引物 F30.25μΙ
20μΜ 引物 Β30.25μ1
20μΜ 引物 LBI μ!
20μΜ 引物 LFΙμ
8U4ilBstDNA 聚合酶ΙμΙ
10 X NEB缓冲液2.5μ1
IOOmM MgSO4ΙμΙ
IOOmM甜菜碱ΙμΙ
(JdH2O补足至 25μ1;其中，IOXNEB缓冲液的成分为200mM Tris-HClUOOmM KCl、IOOmM (NH4)2SO4'60mM MgSO4 和 l%Tween 20，以水配制。LAMP-PCR反应条件为63°C 50分钟，80°C 5分钟，冰上终止反应。用上述引物组对待测样品DNA进行恒温扩增，若电泳检测结果出现梯状DNA条带，则该样品含有布鲁氏菌病菌，若没有扩增出条带，则该样品中不含布鲁氏菌病菌。本发明采用的环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermalamplification, LAMP),其作为一种新型的核酸扩增方法，摆脱了特殊扩增仪器和繁琐检测过程的约束，能在6(T65°C左右利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶和4 / 6特异性引物(针对目的片段的6 / 8区域)对核酸进行高效扩增。与传统的PCR技术相比，LAMP技术的特异性和灵敏性都更胜一筹。其原理是6(T65°C是双链DNA复性和延伸的最佳温度范围，在65°C左右DNA合成处于一种动态平衡状态，因此该温度下有新合成的DNA。LAMP技术依靠4种特异引物和一种活性较高的链置换DNA聚合酶(Bst DNA聚合酶)，使链置换DNA反应处于一种动态循环中。扩增主要分为两个阶段，一是LAMP反应中起始结构的合成阶段，二是后续扩增循环阶段。任何引物与双链DNA中的任一条链进行碱基互补配对延伸时，另一条链就会解离成单链。上游内部引物FIP的F2序列首先与模板F2c结合，在链置换型DNA聚合酶的作用下向前延伸启动链置换合成。外部引物F3与模板F3c结合并延伸，置换出完整的FIP连接的互补单链。FIP上的Flc与此单链上的Fl为互补结构。自我碱基配对形成环状结构。以此链为模板。下游引物BIP与B3先后启动类似于FIP和F3的合成，形成哑铃状结构的单链。迅速以3’末端的Fl区段为起点.以自身为模板，进行DNA合成延伸形成茎环状结构，自此完成反应的第一阶段。第二阶段是扩增循环阶段，以茎环状结构为模板，FIP与茎环的F2c区结合。开始链置换合成，解离出的单链核酸上也会形成环状结构。迅速以3’末端的B I区段为起点，以自身为模板。进行DNA合成延伸及链置换。形成长短不一的2条新茎环状结构的DNA，BIP引物上的B2与其杂交。启动新一轮扩增。且产物DNA长度增加一倍。为增加灵敏性在反应体系中可以另外添加2条环状引物LF和LB，它们分别与茎环状结构结合启动链置换合成，反复循环。扩增的最后产物是包括不同数量茎环结构和长度各异DNA的混合物，且产物DNA为扩增靶序列的交替反向重复序列。环介导等温扩增方法结果判定方法包括①肉眼观察法核酸大量合成时，从dNTP析出的焦磷酸根离子和反应溶液中的子(Mg2+)结合，生成副产物焦磷酸镁白色沉淀物。依据此原理，通过肉眼观察副产物焦磷酸镁白色沉淀是否产生从而判断扩增是否发生。②荧光染料法通过肉眼观察白色沉淀是否产生来判断扩增是否发生存在一定的视觉误差，而通过添加荧光染料例如SYBR Green I、溴化乙锭(EB)等进行呈色反应，结果更易判定。例如，SYBR Green I荧光染料特异性的与双链DNA的小沟结合后发出比原来强80(Γ1000倍的荧光。在核酸大量 合成时，SYBR Green I会自动掺入双链DNA中，如果发生扩增反应，反应结束时混合液由橙色变成绿色，并伴有白色沉淀的产生；反之，反应结束时颜色依然保持SYBR Green I的橙色不变。③琼脂糖凝胶电泳法根据LAMP原理，LAMP反应的最终产物含有若干倍茎长度的茎环结构和类似花椰菜的结构。所以，产物在琼脂糖凝胶上电泳呈现的不是单一条带，而是典型的梯状条带。④浊度仪检测利用日本荣研株式会社研制的针对LAMP的实时监控终点浊度仪对LAMP反应结束后生成的白色沉淀一副产物焦磷酸镁进行全程监控，不仅可以使扩增和检测一管一步完成，而且使扩增过程更加直观，可以对产物进行定量。本发明将LAMP引物恒温扩增技术用于布鲁氏菌病菌的快速检测，可快速、准确、便捷地检测出血清标本中的布鲁氏菌。该方法的特异性和灵敏度均较常规PCR方法更高，对布鲁氏菌的早期预防、病原监测等方面具有重要意义；同时可以免除高昂的仪器投入，更适合用于布鲁氏菌病流调现场或基层卫生防疫。与现有技术相比，本发明的优点在于(一)所选靶序列使得检测更敏感，更特异。布鲁氏菌插入序列IS711在不同布鲁氏菌种型中有多个插入位点和不同的拷贝数，而且比较稳定。在布鲁氏菌主要流行菌种中，羊种布鲁氏菌、猪种布鲁氏菌均有7个完整的IS711拷贝，牛种菌有6个完整拷贝和I个不完整拷贝。而绵羊附睾种布鲁氏菌更有多达38个IS711拷贝。本发明选取该序列作为靶基因，不仅在目的序列的拷贝数上优于其它序列，而且序列中CG含量(50%以上)以及Tm值都非常适合LAMP的引物设计要求。通过对10倍梯度稀释的布鲁氏菌不同种型基因组DNA进行扩增，显示出灵敏度上的差异，其中对绵羊附睾种布鲁氏菌的灵敏度最低。(二)反应时间更短。通过在LAMP体系中添加环引物，使反应时间缩短近半，反应最快在20min便能出现条带,而不加入环引物,反应时间至少需要30min。(三)本发明构建的LAMP体系不仅可用于布鲁氏菌菌株检测，还可用于临床标本的早期检测。
(四)本发明提供的LAMP检测方法成本低、设备简单、使用方便，适合基层大规模的布病筛查工作。
图I为 本发明实施例2的向LAMP产物中加入SYBR Green I染料后肉眼观察结果；其中，1飞管为布鲁氏菌倍比稀释后扩增结果(呈绿色)，7管为阴性对照(呈橙色)。图2为本发明实施例3的LAMP法和常规PCR法的灵敏度检测电泳结果；其中，M为IOObp DNA Marker ;1 6分别为浓度范围IOOpg / μ I-Ifg / μ I的10倍梯度稀释质粒标准品扩增结果；Ν为空白对照；7 12分别为浓度范围IOOpg / μ I-Ifg / μ I的常规PCR10倍梯度稀释质粒标准品扩增结果。图3为本发明实施例4的LAMP特异性电泳检测结果；其中，M为IOObp DNAMarker ； " θ分别对应的菌株为汉赛巴尔通体、霍乱弧菌、土拉弗朗西斯菌、大肠杆菌 0:157、大肠杆菌0:16、小肠结肠耶尔森菌0:9、金黄葡萄球菌、布鲁氏菌5444、1611和13305。
图4为本发明实施例4的布鲁氏菌6个种19个型标准菌株LAMP检测电泳结果；其中，M为IOObp DNA Marker ;I 19分别对应布鲁氏菌牛8个型，羊3个型，猪5个型，犬、绵羊附睾和沙林鼠各I个型。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。以下实施例均按照常规实验条件，如SambiOOk等分子克隆实验手册(NewYork:Gold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的操作技术规程,或按照制造厂商所建议的实验条件。实施例I用于检测布鲁氏菌的LAMP弓丨物组的合成在GenBank中选择布鲁氏菌(Brucella)特异性保守基因一插入序列IS711作为目的基因(GenBank中编号为DQ845343. 1)，根据第141080 141282位的序列通过在线工具http://primerexplorer. jp/e/V4设计、筛选并合成一套参数符合LAMP引物设计要求的引物。其中包括2条内引物(FIP、BIP)，2条外引物(F3、B3)和2条环引物(LB、LF)。序列见表I :表I布鲁氏菌LAMP检测方法弓I物序列
权利要求
1.用于检测布鲁氏菌(Brucella)的LAMP引物组，其特征在于，其包括 外侧正向引物 F3 :5’ -GAACGTGTTGGATTGACCT-3’ ； 外侧反向引物 B3 :5’ -TGCTGTTGTCGATGCTATCG-3’ ；及内侧正向引物 FIP :5’ -GCAGCCTATGATGCCGATCACTTGATCTGAGCCGTTGCCT-3’ ； 内侧反向引物 BIP :5’ -CCACACCCTTCAAGCCGGATAGCCGCTGCGAATAAAGCCAA-3’ ；以及 环引物 LB :5’ -AAGGCTTGAAGCTTGCGGA-3’ ；环引物 LF :5’ -CCTTCATTGCCAGCAATCTCA-3’。
2.含有权利要求I所述LAMP引物组的用于检测布鲁氏菌的试剂盒。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括dNTPs、BstDNA聚合酶、甜菜碱、Mg2+、反应缓冲液中的一种或多种。
4.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括标准阳性模板。
5.权利要求I所述LAMP引物组或权利要求2-4任一项所述试剂盒在检测布鲁氏菌中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，包括以下步骤 1)提取样品中的DNA； 2)以步骤I)中提取的DNA为模板，进行LAMP-PCR扩增反应； 3)分析PCR产物。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，LAMP-PCR反应体系以25μ I计为模板DN AΙμ IOmM dNTPs2.5u.l 20μΜ 引物 FIP2μ1 2_Μ 引物BIP2μ1 20μΜ 引物 F30.25μ1 20μΜ! #Β30.25μ! 20μΜ 引物 LBΙμ 20μΜ 引物 LFΙμ8υ/μ1 Bst DNA聚合崎Ιμ 10 X NEB缓冲液2.5μ1 IOOmM MgSO4ΙμΙIOOmM甜菜碱ΙμΙCidH2O补足至 25μ1; 其中，IOXNEB 缓冲液的成分为200mM Tris-HClUOOmM KCl、IOOmM (NH4) 2S04、60mMMgSO4 和 l%Tween 20，以水配制。
8.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于，LAMP-PCR反应条件为63°C50分钟，.80 °C 5分钟，冰上终止反应 。
全文摘要
本发明提供一种用于检测布鲁氏菌(Brucella)的LAMP引物及含有该引物的试剂盒，所述引物包括2条内引物(FIP、BIP)，2条外引物(F3、B3)和2条环引物(LB、LF)(如Seq ID No.1-6所示)。本发明将LAMP引物恒温扩增技术用于布鲁氏菌病菌的快速检测，可快速、准确、便捷地检测出血清标本中的布鲁氏菌。该方法的特异性和灵敏度均较常规PCR方法更高，对布鲁氏菌的早期预防、病原监测等方面具有重要意义；同时可以免除高昂的仪器投入，更适合用于布鲁氏菌病流调现场或基层卫生防疫。
文档编号C12Q1/68GK102816847SQ20121029127
公开日2012年12月12日 申请日期2012年8月15日 优先权日2012年8月15日
发明者姜海, 崔步云, 张利, 田国忠, 朴东日, 赵鸿雁 申请人:中国疾病预防控制中心传染病预防控制所