专利名称：耐辐射异常球菌R1 trkB基因培育耐盐植物的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及耐福射异常球菌Rl (Deinococcus radiodurans Rl) trkB基因(DR1667，GeneID: 1799538)的新功能，具体涉及该基因在增强植物对盐胁迫抗性方面的应用。
背景技术：
盐碱对农作物造成的损失在所有非生物胁迫中占首位(Dracup et al.，1998)。耐辐射异常球菌Rl (D. radiodurans Rl)因对长期的干燥和强氧化胁迫具有极强的抗性，而成为研究微生物非生物胁迫适应机制的理想菌株。 HKT (high-affinity K+transporter)基因家族转运蛋白具有可以调节植物体内K+/Na+平衡的能力，广泛存在于植物、真菌、真细菌和古细菌中。耐辐射异常球菌Rl(D. radiodurans Rl)含有2个HKT类蛋白，与植物Na+转运关系密切密切相关，对长期的干燥和强氧化胁迫具有极强的抗性。钾是植物体必需的营养元素之一，钠是植物生长的功能元素，对于大多数植物而言，少量有益，过量则会产生毒害。植物对它们的吸收主要靠其体内的通道蛋白和转运载体。植物HKT转运蛋白与真菌Trk转运蛋白、原核生物的KtrB和TrkH的K转运蛋白的联系紧密，真菌中Trk转运蛋白是低K浓度下主要的K吸收系统。大多数植物中都可能存在HKT转运蛋白，这个基因家族并不是很大，在拟南芥中该家族只有一个成员。序列分析推测，这个家族的转运蛋白可能由细菌的2次跨膜结构的K通道进化而来，形成现在的8次跨膜和4个圈的一孔结构蛋白。HKT家族基因主要分为2个亚家族，亚家族I成员是特异性的Na低亲合转运蛋白，大部分分布于根系中柱的细胞质膜上，尤其是木质部薄壁细胞膜上，负责从木质部汁液中重新获取Na而阻止其向地上部的运输；而亚家族2成员是K/Na高亲合转运蛋白，尤其在K缺乏条件下负责对Na的吸收从而促进作物的生长，主要分布于根系的皮层和内皮层细胞膜上。Deinococcus radiodurans (D. radiodurans)是至今已知生物中最高的福射抗性的生物之一。该菌具有对致死剂量的电离辐射、UV辐射以及DNA损伤试剂的极端抗性，能将电离辐射造成上百个DNA双链断裂的基因组完整恢复如初，且不发生突变的能力。1999年基因研究所(TIGR)完成和公布了 D. radiodurans基因组全序列(White 1999)。尽管耐辐射菌株与干旱胁迫抗性在进化上可能具有协同性，但目前未见耐福射异球菌Deinococcusradiodurans Rl中的trkB基因(DR1667，GeneID: 1799538)在增强植物耐盐性方面的功能的研究报道。
发明内容
本发明的目的是从D. radiodurans Rl基因组中发现能够增强植物对高盐的抗性基因。并将该基因转入植物，使转入该基因的植物获得耐盐的能力。本发明通过如下研究发现，首次发现，SEQ ID NO: I所示序列的Deinococcusradiodurans Rl的trkB基因(DR1667，GeneID: 1799538)具有抗盐胁迫的功能，可用于培育耐盐性状的植物I、获得含有D. radiodurans Rl trkB基因(DR1667)的重组工程菌株I)通过 PCR 从 D. radiodurans Rl (DSM 20539)菌株基因组扩增出 D. radioduransRltrkB基因(DR1667)，基因序列号为GeneID :1799538。其大小为1377bp，该基因编码456个氨基酸，将其克隆于载体pGEMT-easy上，构建了含有完整trkB基因的重组质粒pGEMT-trkB ；2)将trkB基因(DR1667)连接于pRADZ3穿梭质粒上，该质粒含有能在大肠杆菌和耐辐射异球菌中都起作用的groEL启动子，构建含有groEL启动子的完整trkB基因(DR1667)重组质粒 pRADZ3-trkB G ；3)将导入trkB基因(DR1667)的重组质粒pRADZ3-trkB G转入受体大肠杆菌JM109 中，获得工程菌株JM-trkB (详见实施例I)；2、含有D. radiodurans Rl trkB基因工程菌株的耐盐实验实验证实，经4M NaCl 冲击后，含有 D. radiodurans Rl trkB 基因(DR1667)的JM-trkB重组菌株生长状况良好，菌落数高于只含空质粒的JM-Z3菌株(见实施例2及图
4)。该工程菌株具有耐受4M NaCl冲击的能力。此实验表明D. radiodurans Rl trkB基因(DR1667)具有增强原核生物耐盐的能力。3、trkB基因(DR1667)在油菜中表达及转基因植株的耐盐抗性鉴定I)将D. radiodurans Rl trkB基因(DR1667)连接到植物表达载体pBI121中，构建具有trkB基因(DR1667)的重组质粒pBI121_trkB ；2)将pBI121-trkB重组质粒转化油菜中，获得了能够耐盐的转基因油菜植株；此实验表明D. radiodurans Rl trkB基因(DR1667)具有培育耐盐植物的用途(见实施例3及图5 6)。
图I是含有D. radiodurans Rl trkB基因(DR1667)序列的PCR产物验证电泳图
-i'Tfe1曰；图2是含有D. radiodurans Rl trkB基因(DR1667)及groEL启动子的原核表达载体的构建验证电泳图谱；图3是在高浓度盐(4M NaCl)冲击前的含有空载体和含有D. radiodurans Rl trkB基因(DR1667)序列的原核表达载体的大肠杆菌的生长状况的菌落照片，其中a是含有空表达载体的大肠杆菌JM 109菌株；b是含有D. radiodurans Rl trkB基因(DR1667)表达载体的大肠杆菌重组菌株；图4是含有D. radiodurans Rl trkB基因(DR1667)的原核表达载体及空载体的大肠杆菌(E. coli)在含4M NaCl培养基中的生长情况的菌落照片，图中的菌株如下a是含有空表达载体的大肠杆菌JM 109菌株；b是含有D. radiodurans Rl trkB基因(DR1667)表达载体的大肠杆菌重组菌株。图5是在250mmol NaCl的培养基上培养15天后非转基因油菜，已萎蔫；
图6是在250mmol NaCl的培养基上培养15天后转基因油菜，转基因油菜能在含250mmol的NaCl的胁迫下正常生长。
具体实施例方式以下实施例中所举的质粒、菌株只用于对本发明作进一步详细说明，并不对本发明的实质内容加以限制。凡未注明具体实验条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条件，例如Sambrook等分子克隆实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所举的质粒、菌株来源如下克隆载体pGEMT-easy :为Promrga公司市售产品；穿梭质粒pRADZ3 :为本实验室保存；
植物表达载体pBI121 :为Clontech公司市售产品；大肠杆菌JM 109 :为北京全式金公司市售产品。根癌农杆菌EHA 105由本实验室保存。实施例I D. radiodurans Rl trkB基因(DR1667)序列在大肠杆菌中的表达根据已公布的D. radiodurans Rl基因组中的trkB基因(DR1667)序列设计I对PCR特异性引物Up 5' ATTAACTAGTATGACCCGGAACGCCGCGCT 3'Down 5' ACGCCATATGCTACCCCACCAGAATGTCGT3通过PCR方法从D. radiodurans Rl基因组DNA中扩增出目的基因序列。反应条件94°C IOmin, [94°C 30sec,60°C 30sec,72°C I. 5min]35 个循环，72 °C IOmin0 PCR 产物经胶回收后，克隆于载体pGEMT-easy上，命名为pGEMT_trkB，并测序验证；然后通过SpeI/NdeI双酶切获得含有粘性末端的trkB基因(DR1667)及含有启动子groEL的pRADZ3载体，将trkB基因(DR1667)连接于pRAD Z3载体上，构建大肠杆菌表达载体pRADZ3_trkB G，将该表达载体转化大肠杆菌JM109，经PCR、酶切，测序验证插入序列正确(见图1，2)，将该菌株命名为JM-trkB。将含有pRADZ3空质粒的E. coli JMl09命名为JM-Z3。实施例2含D. radiodurans Rl trkB基因(DR1667)重组菌株的耐盐实验一、实验方法I、将实施例I中获得的2个重组的大肠杆菌分别接种于20mL LB液体培养基(含Amp抗生素)中，摇瓶过夜培养后(37 °C)，再转接于IOOmL的LB液体培养基中，尽量保持接种量的一致，培养至0D_约0. 5左右(尽量保持OD6tltl值一致)。2、取IOmL的菌液离心后，在等体积的4M NaCl溶液中冲击2h，每个样品立即用无菌去离子水倍比稀释至10_4，取10 μ L点在LB固体培养基表面，经37°C培养16h，观察菌落形成情况并照相。二、实验结果图3 显示，4M NaCl 溶液冲击前，含有 H radiodurans Rl trkB 基因(DR1667)的JM-trkB菌株与含空质粒的JM-Z3菌株生长状态基本一致；4M NaCl溶液冲击后，含有D. radiodurans Rl trkB基因(DR1667)的JM-trkB重组菌株生长状况良好，菌落数多于只含空质粒的JM-Z3菌株(见图4)。三、实验结论D. radiodurans Rl trkB基因(DR1667)增强了原核生物耐盐的能力。实施例3 trkB基因(DR1667)在油菜中表达及转基因植株的耐盐性鉴定(一)农杆菌介导转化油菜实验I.根癌农杆菌EHA105感受态的制备I)挑取单菌落，接种于5mL YEB液体培养基(含利福平Rif 50mg/L), 28°C, 250 rpm振荡培养过夜；2)取2mL菌液，加入50mL YEB液体培养基(含Rif 50mg/L)中，28°C，250rpm振荡 培养至OD600约O. 6左右;3)将菌液转至50mL无菌离心管中，冰浴30min,5000Xg离心5min ；4)弃上清，沉淀用2mL 20mM CaCl2重悬，每份100 μ L分装到I. 5mL离心管中，液
氣中保存备用。2.重组质粒DNA转入农杆菌I)将约Iyg的pBI121-trkB质粒DNA分别加入到IOOyL EHA105感受态细胞中，混勻，冰浴5min ；2)将离心管置液氮中冷冻8min，迅速转至37° C水浴中温浴5min ；3)加入ImL YEB液体培养基，在28°C摇床上250rpm复苏4 5h ;4)取适量菌液涂布到含利福平(Rif) 50mg/L和卡那霉素(Kan) 100mg/L的YEB固体培养基上，置28°C培养24 48h。3.农杆菌质粒DNA的提取I)挑取菌落于含利福平(Rif) 50mg/L和卡那霉素(Kan) 100mg/L的YEB液体培养基中(YEB :胰蛋白胨5g/L，酵母提取物lg/L，蔗糖5g/L，硫酸镁0. 5g/L)，28。C，250rpm振荡培养20h ；2)取 I. 5mL 菌液离心后，弃上清，用 STE 溶液(Tris-HCI IOmM ρΗ8· O,NaCl IOmM,EDTA IOmM pH 8. 0)洗涤2次，弃上清，加入预冷的溶液I (50mM葡萄糖，25mM Tris-HClpH8. O7IOmM EDTA pH 8. O7RNase A 100 μ g/mL) 300 μ L，用移液器反复抽吸混匀，室温静置IOmin ；3)加入新鲜配置的溶液II (0. 2M NaOH, 1%SDS) 600 μ L，上下颠倒几次混匀；4)加入预冷的溶液III(5M乙酸钾pH 5. 2，冰醋酸IL 5mL，加水至100mL)450y L，充分混勻，冰浴5min,4° C 12000 Xg离心5min,上清加入0. 6倍体积的异丙醇沉淀；5)沉淀加 50 μ L TE (Tris-HCI IOmmoI/L, lmmol/L EDTA, pH 8. O)溶解后，经 PCR、Bam HI、Sac I双酶切验证。4.油菜无菌苗的准备及农杆菌介导的trkB基因(DR1667)遗传转化I)油菜无菌苗的培养甘蓝型油菜(Brassica napus L. ) (84100-18)种子在超净工作台上用灭菌水浸泡IOmin, 10%的NaClO灭菌12min,再用0. 1%的升萊溶液消毒7_8min,用灭菌水洗3_5遍，并把灭菌的油菜种子均匀地摆放在无激素的预培养基上(7.5%琼脂)。光照培养，4-5d龄油菜幼苗最适于遗传转化。
2)预培养用75%的酒精和高温消毒灭菌的剪刀剪掉子叶和生长点，剪取油菜无菌苗紧邻生长点下约O. 5cm长的下胚轴，置于预培养基(MS+6-BA 2mg/L+2, 4_D lmg/L+AgN03 2. 5mg/L+AS 19. 62mg/L)上，光照预培养2d。3)农杆菌的培养在50mL LB液体培养基(含卡那霉素100mg/L、利福平50mg/L)中加入O. ImLlea-EHA 105菌液，28°C下220rpm振荡培养16h左右，室温下4000 Xg离心lOmin，弃上清液，菌体用灭菌的MS液体培养基(含AS 100 μ mol/L)悬浮，稀释到原体积的5_20倍，在28°C下220rpm振荡培养lh，使菌液的0D_达O. 5左右。4)共培养把预培养2d的下胚轴放入菌液中浸染lmin，用药勺捞出下胚轴，放在灭菌的吸水 纸上，吸干下胚轴上的多余菌液，再放到覆盖有灭菌滤纸的预培养基上，用封口膜封好培养皿，25° C左右，于暗处共培养约2d (暗培养)。5)诱导培养把共培养2d的下胚轴放到诱导培养基(MS+6-BA 2mg/L+AgN03 2.5mg/L)上，用封口膜封好培养皿，25。C左右光照培养，每2周继代I次，直至长出膨大的愈伤组织。6)选择培养把膨大的愈伤组织转移到筛选培养基(MS+6-BA 2mg/L+AgN03 2. 5mg/L+Kan100mg/L)上，用封口膜封好培养皿，25° C左右光照培养，每2周继代I次，直至长出苗。7)生根培养当幼芽长到l-2cm高时，把它们从愈伤组织上分离，转移到生根培养基上(1/2MS+NAA 0. 5mg/L+Kan 25mg/L)进行生根培养。在抗生素筛选条件下，约87%的芽在2周后形成根。8)炼苗和移栽生根后的幼苗长到5-6cm高时，半敞开培养瓶盖子，进行炼苗；待幼苗适应外界环境以后，转移到室内灭菌的蛭石中栽种培养，并用1/2MS培养液浇灌。当幼苗生长至7-9cm时，将幼苗移植到泥土中生长，然后再进行下一步实验。(二)含trkB基因(DR1667)序列转基因油菜的耐盐性鉴定I、实验目的鉴于该核苷酸序列已被证明在大肠杆菌中对盐胁迫具有抗性，进一步对转基因植株进行抗旱性鉴定。2、实验方法对苗期的转基因油菜植株和非转基因油菜植株均分别一次性浇足含250NaCl的营养液后不再浇水，15天后观察对比两种油菜植株的生长情况。3、实验结果从图5可观察到,在250mmol NaCl的培养基上培养15天后，非转基因油菜已萎蔫;从图6可观察到，在250mmol NaCl的培养基上培养15天后，转基因油菜在250mmol的NaCl胁迫下仍可正常生长。
4、实验结论上述所有结果均表明，所克隆的trkB基因(DR1667)具有对盐胁迫的抗性，可用于利用转基因技术控制植 物对盐胁迫的研究和产业化中。
权利要求
1.SEQ ID NO: I所示序列的基因培育耐盐植物的用途。
2.含SEQID NO: I所示序列的基因的重组质粒。
3.权利要求2所述重组质粒培育耐盐植物的用途。
4.权利要求3所述的用途，所述重组质粒是能在大肠杆菌表达的质粒。
5.权利要求3所述的用途，所述重组质粒是能在植物中表达的质粒。
6.权利要求2所述的重组质粒转化的宿主细胞培育耐盐植物的用途。
7.权利要求6所述的用途，所述宿主细胞包括原核细胞和真核细胞。
8.含SEQID NO: I所示序列的基因的重组工程菌株。
9.权利要求8所述的重组工程菌株培育耐盐植物的用途。
10.权利要求1、3 7、9中任一所述的用途，所述植物是油菜。
全文摘要
本发明发现耐辐射异球菌Deinococcus radiodurans R1中的trkB基因(DR1667)具有增强原核生物及植物的抗逆能力。本发明构建了包含上述基因的重组载体，把它们分别导入原核及真核宿主细胞。实验证明，trkB基因(DR1667)在原核宿主细胞和油菜中表达后，均能增强其耐盐抗性。
文档编号C12R1/19GK102807991SQ20121029161
公开日2012年12月5日 申请日期2012年8月15日 优先权日2012年8月15日
发明者林敏 , 王劲, 左开井, 陈明, 张维, 平淑珍, 陆伟, 燕永亮 申请人:中国农业科学院生物技术研究所