和多核巧酸W分离形式提供，例如，纯化至 同质。
[0137] 本发明也包括多肤，其包括下述氨基酸序列，或供选择地由下述氨基酸序列组成， 所述氨基酸序列与沈QIDN0:l、2、4、5、7、8、10、ll、13、14、16、17、19、20、22、23、25、26、28 或29中任一条的多肤，或运样的多肤的部分具有至少约70%、至少约75%、至少约80%、至 少约85%、至少约90%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%、至少约99% 或100 %，或其值的任何范围的同一性，其中所述部分可包含至少30个氨基酸、至少50个氨 基酸、至少100个氨基酸、至少150个氨基酸、至少200个氨基酸、至少250个氨基酸、至少 300个氨基酸或至少350个氨基酸。
[0138] 本发明也包括运样的多肤，其包括下述氨基酸序列，或供选择地由下述氨基酸序 列组成，所述氨基酸序列与沈QIDN0:l、2、4、5、7、8、10、ll、13、14、16、17、19、20、22、23、 25、26、28或29中任一条的多肤，或运样的多肤的部分具有约70 %至100 %、约75%至 100%、约80%至100%、约85%至100%、约90%至100%、约95%至100%的同一性，其中 所述部分可包含至少30个氨基酸、至少50个氨基酸、至少100个氨基酸、至少150个氨基 酸、至少200个氨基酸、至少250个氨基酸、至少300个氨基酸或至少350个氨基酸。
[0139]本发明进一步设及沈Q ID N0:l、2、4、5、7、8、10、ll、13、14、16、17、19、20、22、23、 25、26、28或29中任一条的多肤的结构域、片段、变体、衍生物或类似物。
[0140] 本发明的多肤的片段或部分可用于通过肤合成产生相应的全长多肤，因此，片段 可用作产生全长多肤的中间体。
[0141] 本发明的B化多肤的片段可包括灰腐质霉、魏氏假丝酵母、棘抱曲霉、米曲霉、斜 邸青霉、球毛壳菌、瘤胃真菌、汉逊德己利酵母、马克斯克鲁维酵母或致病疫霉BGL多肤的 结构域、蛋白水解片段和缺失片段。片段W可任选地保持B化蛋白的特定生物活性。示例 性片段包括实施例1中描述的那些。多肤片段进一步包括包含B化蛋白催化活性的多肤的 任何部分。 阳 14：2]沈Q ID N0:l、2、4、5、7、8、10、ll、13、14、16、17、19、20、22、23、25、26、28 或 29 中 任一条的多肤的变体、衍生物或类似物可W是运样的变体、衍生物或类似物：（i)其中一个 或多个氨基酸残基用保守或非保守氨基酸残基置换并且运样的置换的氨基酸残基可W是 或不是由遗传密码编码的氨基酸残基，或（ii)其中一个或多个氨基酸残基包括取代基，或 (iii)其中成熟的多肤与另一化合物，如提高多肤半衰期的化合物（例如，聚乙二醇）融合， 或（iv)其中另外的氨基酸与成熟的多肤融合，用于纯化多肤，或（V)其中多肤的片段是可 溶性的，即，不是膜结合的，但是仍将配体与膜结合的受体结合。运样的变体、衍生物和类似 物根据本文的教导被视为在本领域技术人员的范围内。 阳143]本发明的多肤进一步包括多肤的变体。多肤的"变体"可W是保守变体，或等位基 因变体。如本文所使用的，保守变体是指氨基酸序列中的改变未不利影响蛋白质的生物功 能。当改变的序列阻止或破坏与蛋白质相关的生物功能时，认为置换、插入或缺失不利影响 蛋白质。例如，蛋白质的总体电荷、结构或疏水-亲水特性可被改变而未不利影响生物活 性。因此，可改变氨基酸序列，例如使得肤更加疏水或亲水，而不会不利地影响蛋白质的生 物活性。
[0144]"等位基因变体"是指生物体的染色体上占据给定基因座的可选形式的基因。 GenesII，Lewin,B.，ed.，JohnWiley&Sons，化WYork(1985)。可使用本领域已知的诱变 技术产生非天然存在的变体。等位基因变体，尽管具有与上面叙述的那些稍微不同的氨基 酸序列，但是仍将具有与灰腐质霉、魏氏假丝酵母、棘抱曲霉、米曲霉、斜邸青霉、球毛壳菌、 瘤胃真菌、汉逊德己利酵母、马克斯克鲁维酵母或致病疫霉B化蛋白相关的相同或类似的 生物功能。
[0145] 等位基因变体、保守置换变体和B化蛋白家族的成员具有的氨基酸序列与SEQID NO:1、2、4、5、7、8、10、11、13、14、16、17、19、20、22、23、25、26、28 或 29 任一条中阐释的灰腐 质霉、魏氏假丝酵母、棘抱曲霉、米曲霉、斜邸青霉、球毛壳菌、瘤胃真菌、汉逊德己利酵母、 马克斯克鲁维酵母或致病疫霉B化氨基酸序列具有至少75 %、至少80 %、至少90 %、至少 95 %、至少96 %、至少97 %、至少98 %、至少99 %，或其值的任何范围的氨基酸序列同一性。 就运样的序列而言，同一性或同源性在本文中定义为：在比对序列和如果必要引入空隙W 实现最大同源性百分比之后，并且不将任何保守置换视为序列同一性的一部分，候选序列 中与已知肤相同的氨基酸残基的百分比。N末端、C末端，或内部延伸、缺失或插入肤序列不 应解释为影响同源性。 阳146] 因此，本发明的蛋白质和肤包括运样的分子，其包括SEQIDN0:l、2、4、5、7、8、10、11、13、14、16、17、19、20、22、23、25、26、28或29中任一条的氨基酸序列或其具有灰腐质霉、 魏氏假丝酵母、棘抱曲霉、米曲霉、斜邸青霉、球毛壳菌、瘤胃真菌、汉逊德己利酵母、马克斯 克鲁维酵母或致病疫霉BGL多肤序列的至少约3、4、5、6、10、15、20、25、30、35、50、100、150、 200、250、300、350或更多个，或其值的任何范围的氨基酸残基的连续序列的片段；运样的 序列的氨基酸序列变体，其中至少一个氨基酸残基已经插入公开序列的N末端或C末端或 之中；公开序列的氨基酸序列变体，或如上定义的已经被另一个残基置换的它们的片段。考 虑的变体进一步包括包含由例如，同源重组、位点引导的诱变或PCR诱变引起的预定的突 变的那些，和其他生物体对应的蛋白质，蛋白质家族的等位基因或其他天然存在的变体；和 其中蛋白质已经通过置换、化学、酶或其他适当的方式用除天然存在的氨基酸W外的部分 (例如，可检测的部分，如酶或放射性同位素）被共价修饰的衍生物。 阳147]使用蛋白质工程和重组DNA技术的已知方法，可产生变体，W改善或改变B化多肤 的性质。例如，一个或多个氨基酸可从分泌的蛋白质的N-末端或C-末端缺失，而不显著丧 失生物功能。
[0148]因此，本发明进一步包括显示实质生物活性的灰腐质霉、魏氏假丝酵母、棘抱曲 霉、米曲霉、斜邸青霉、球毛壳菌、瘤胃真菌、汉逊德己利酵母、马克斯克鲁维酵母或致病疫 霉B化多肤变体。运样的变体包括根据本领域已知的一般原则选择的缺失、插入、倒位、重 复和置换从而对活性具有很少的影响。
[0149] 技术人员充分认识到较不可能或不可能明显影响蛋白质功能的氨基酸置换（例 如，用第二脂肪族氨基酸替换一个脂肪族氨基酸），如下面进一步描述。 阳150] 例如，Bowie等，Science, 247:1306-1310,1990提供了关于如何制备表型沉默氨 基酸置换的指导，其中作者指出研究氨基酸序列对改变的耐受存在两个主要策略。 阳151] 第一策略利用通过进化过程中的自然选择的氨基酸置换的耐受。通过比较不同物 种中的氨基酸序列，可识别保守氨基酸。运些保守氨基酸可能对于蛋白质功能是重要的。相 反，其中置换已经通过自然选择耐受的氨基酸位置显示运些位置对于蛋白质功能不是关键 的。因此，可修饰耐受氨基酸置换的位置，而同时仍保持蛋白质的生物活性。
[0152]第二策略使用基因工程，在克隆基因的特定位置引入氨基酸改变，W确定对于蛋 白质功能关键的区域。例如，可使用位点引导的诱变或丙氨酸-扫描诱变（在分子中的每个 残基处引入单个丙氨酸突变）。参见，例如，化nnin曲am等，Science, 244:1081-1085,1989。 然后可测试所得突变体分子的生物活性。 阳153]如作者指出的，运两个策略已经掲示蛋白质通常令人吃惊地耐受氨基酸置换。作 者进一步显示哪些氨基酸改变在蛋白质的某些氨基酸位置中可能是允许的。例如，大部分 掩埋（在蛋白质的四级结构中）的氨基酸残基需要非极性侧链，而表面侧链的少数特征一 般是保守的。而且，耐受的保守氨基酸置换设及脂肪族或疏水的氨基酸Ala、Val、Leu和Ile 的替换；径基残基Ser和化r的替换；酸性残基Asp和Glu的替换；酷胺残基Asn和Gln的 替换，碱性残基Lys、Arg和化S的替换；芳族残基化e、Tyr和T巧的替换，和小尺寸氨基酸 Ala、Ser、T虹、Met和Gly的替换。
[0154] 术语"衍生物"和"类似物"指与灰腐质霉、魏氏假丝酵母、棘抱曲霉、米曲霉、斜邸 青霉、球毛壳菌、瘤胃真菌、汉逊德己利酵母、马克斯克鲁维酵母或致病疫霉B化多肤不同， 但是保持其基本特性的多肤。一般而言，衍生物和类似物总体上非常类似，并且，在许多区 域中，与灰腐质霉、魏氏假丝酵母、棘抱曲霉、米曲霉、斜邸青霉、球毛壳菌、瘤胃真菌、汉逊 德己利酵母、马克斯克鲁维酵母或致病疫霉BGL多肤相同。当提及本发明的灰腐质霉、魏氏 假丝酵母、棘抱曲霉、米曲霉、斜邸青霉、球毛壳菌、瘤胃真菌、汉逊德己利酵母、马克斯克鲁 维酵母，和致病疫霉B化多肤时，术语"衍生物"和"类似物"包括保持相应的天然多肤的至 少一些活性的多肤。
[0155] 本发明的灰腐质霉、魏氏假丝酵母、棘抱曲霉、米曲霉、斜邸青霉、球毛壳菌、瘤胃 真菌、汉逊德己利酵母、马克斯克鲁维酵母，和致病疫霉B化多肤的衍生物是已经被改变W 显示天然多肤上没有出现的另外特征的多肤。衍生物可通过置换、化学、酶，或其他适当的 方式用除天然存在的氨基酸W外的部分（例如，可检测的部分，如酶或放射性同位素）共价 修饰。衍生物的实例包括融合蛋白。
[0156] 类似物是本发明的灰腐质霉、魏氏假丝酵母、棘抱曲霉、米曲霉、斜邸青霉、球毛壳 菌、瘤胃真菌、汉逊德己利酵母、马克斯克鲁维酵母或致病疫霉BGL多肤的另一种形式。"类 似物"也保持如感兴趣的多肤基本上相同的生物功能或活性，即，用作0-葡糖巧酶。类似 物包括可通过原蛋白部分的切割W产生活性成熟多肤来激活的原蛋白。 阳157] 本发明的多肤可W是重组多肤、天然多肤或合成多肤。 阳158]B化融合多肤
[0159] 本发明也包括包含两个或更多个多肤的融合蛋白。例如，融合蛋白可W是灰腐质 霉、魏氏假丝酵母、棘抱曲霉、米曲霉、斜邸青霉、球毛壳菌、瘤胃真菌、汉逊德己利酵母、马 克斯克鲁维酵母或致病疫霉B化和第二肤的融合体。B化和第二肤可直接或间接，例如，通 过连接体序列融合。融合蛋白可包括例如，B化的N-末端的第二肤和/或异源纤维素酶 C-末端的第二肤。因此，在某些实施方案中，本发明的多肤包括第一多肤和第二多肤，其中 第一多肤包括灰腐质霉、魏氏假丝酵母、棘抱曲霉、米曲霉、斜邸青霉、球毛壳菌、瘤胃真菌、 汉逊德己利酵母、马克斯克鲁维酵母或致病疫霉B化多肤。
[0160] 根据本发明，融合蛋白可包括第一和第二多肤，其中第一多肤包括灰腐质霉、魏氏 假丝酵母、棘抱曲霉、米曲霉、斜邸青霉、球毛壳菌、瘤胃真菌、汉逊德己利酵母、马克斯克鲁 维酵母或致病疫霉B化多肤，第二多肤包括信号序列。信号序列可来自任何生物体。例如， 在一些实施方案中，第二多肤是酿酒酵母（S.cerevisiae)多肤。在一个具体的实施方案 中，酿酒酵母多肤是酿酒酵母a交配因子信号序列。在一些实施方案中，信号序列包括SEQ IDN0:2、5、8、ll、17、20、23、26或29中任一条的氨基酸序列，或本文所述的其任何片段或 变体。 阳161] 根据另一个实施方案，融合蛋白可包括第一和第二多肤，其中第一多肤包括灰腐 质霉、魏氏假丝酵母、棘抱曲霉、米曲霉、斜邸青霉、球毛壳菌、瘤胃真菌、汉逊德己利酵母、 马克斯克鲁维酵母或致病疫霉B化多肤，第二多肤包括用于帮助纯化或鉴定报告肤的多 肤。用于帮助纯化或鉴定报告肤的多肤可W是，例如，HIS标签、GST标签、HA标签、FLAG标 签、MYC标签或巧光蛋白。
[0162] 在某些其他实施方案中，第一多肤和第二多肤经连接体序列融合。在一些实施方 案中，连接体序列可包括序列：GGSPPS(SEQIDN0:41)。在其他实施方案中，连接体序列可 通过本文进一步描述的本发明的密码子优化的多核巧酸编码。
[0163] 在融合蛋白的进一步实施方案中，第一和第二多肤是相同定向的，或第二多肤与 第一多肤相反定向。在另外的实施方案中，第一多肤是第二多肤的N-末端或C-末端。在 某些其他实施方案中，第一多肤和/或第二多肤由密码子优化的多核巧酸编码，例如，针对 酿酒酵母密码子优化的多核巧酸。 阳164] 载体和宿主细胞
[01化]本发明也设及包括本发明的多核巧酸的载体、用本发明的载体基因工程化的宿主 细胞和通过重组技术产生本发明的多肤。
[0166] 宿主细胞用本发明的载体基因工程化（转导或转化或转染），所述载体可W是例 如克隆载体或表达载体。载体可W例如为质粒、病毒颗粒、隧菌体等的形式。可在常规的营 养培养基中培养工程化的宿主细胞，所述培养基适当地为激活启动子、选择转化株或扩增 本发明的基因而改良。培养条件，比如溫度、抑等是先前用于为了表达而选择的宿主细胞 的那些，并且对本领域普通技术人员显而易见。 阳167] 本发明的多核巧酸可用于通过重组技术产生多肤。因此，例如，多核巧酸可包括在 用于表达多肤的多种表达载体中的任一种中。运样的载体包括染色体、非染色体和合成DNA序列，例如，SV40的衍生物、细菌质粒和酵母质粒。运样的载体也包括"自杀载体"，其不能 自我复制但是可在插入宿主染色体之后复制。也可使用其他载体。
[0168] 适当的DNA序列可通过各种方法插入载体。一般而言，DNA序列通过本领域已知 的方法插入适当的限制内切核酸酶位点（或多个位点）。运样的方法和其他方法被视为在 本领域技术人员的范围内。 阳169] 表达载体中的DNA序列与适当的表达控制序列（或多个表达控制序列）（启动子） 可操作地连接，W引导mRNA合成。运样的启动子的代表性实例如下：
[0170]表3:启动子阳 171]
阳172] 另外，已知大肠杆菌巧.coli)启动子，如lac或trp控制基因在原核或低等真核 细胞中的表达。表达载体也可包含用于翻译启动和转录终止子的核糖体结合位点。载体也 可包括用于扩增表达的适当的序列，或可包括另外的调节区域。载体也可包括肠激酶位点， 其用于连接至C-末端标签W允许在蛋白质纯化之后切割祀蛋白质。
[0173]另外，表达载体可包含一个或多个可选择的标记基因，W提供用于选择转化的宿 主细胞的表型特点，如URA3、HIS3、LEU2、TRP1、LYS2或ADE2,真核细胞培养物的二氨叶酸还 原酶或新霉素（G418)抗性或博来霉素抗性，或大肠杆菌中的氯霉素、甲讽霉素、链霉素、四 环素、卡那霉素、潮霉素、腐草霉素或氨节西林抗性。
[0174] 包含如本文的适当的DNA序列W及适当的启动子或控制序列的载体可用于转化 适当的宿主，W使得宿主表达蛋白质。
[01巧]因此，在某些方面中，本发明设及包含上述构建体的宿主细胞。宿主细胞可W是高 等真核细胞，如哺乳动物细胞，或低等真核细胞，如酵母细胞，例如，酿酒酵母或宿主细胞可 W是原核细胞，如细菌细胞。 阳176] 适当的宿主的代表性实例包括例如细菌细胞，如大肠杆菌、链霉菌 (Streptomyces)、鼠伤寒沙口氏菌（Salmonellatyphimurium)、嗜热性或中溫细菌；真菌细 胞，如酵母；和植物细胞等。适当宿主的选择根据本文的教导被视为在本领域技术人员的范 围内。
[0177]适当的真菌宿主包括酵母。在本发明的某些方面中，酵母是酿酒酵母、己氏酵 母（也称为卡氏酵母（Saccharomycescarlsbergensis))、贝酵母、乳酸克鲁维酵母、马 克斯克鲁维酵母、粟酒裂殖酵母、白色假丝酵母、毕赤酵母、树干毕赤酵母、解脂耶氏酵母、 多形汉逊酵母、红法夫酵母、产航假丝酵母、耐盐酵母、汉逊德己利酵母、多形德己利酵母 或西方许旺酵母。在一些实施方案中，宿主细胞可W是产油酵母细胞。在一些具体的实 施方案中，产油酵母细胞是布拉氏霉菌属度Iakeslea)、假丝酵母属（Candida)、隐球菌属 (Cryptococ州S)、小克银汉霉属（Cunnin曲amelia)、油脂酵母属（Lipomyces)、被抱霉属 (Mortierella)、毛霉属（Mucor)、须霉属（Phycomces)、腐霉属（Pythium)、红冬抱酵母属 (Miodosporidium)、红酵母属（Miodotorula)、丝抱酵母属（Trichosporon)或耶罗威亚酵 母属（Yarrowia)细胞。 阳17引根据本文所述的方法，酵母菌株可被修饰，例如W改善生长、选择和/或稳定性。 因此，例如，酿酒酵母、己氏酵母（也称为卡氏酵母）、贝酵母、乳酸克鲁维酵母、马克斯克鲁 维酵母、粟酒裂殖酵母、白色假丝酵母、毕赤酵母、树干毕赤酵母、解脂耶氏酵母、多形汉逊 酵母、红法夫酵母、产航假丝酵母、耐盐酵母、汉逊德己利酵母、多形德己利酵母或西方许旺 酵母可包括缺失、插入和/或重排并且仍视为是酿酒酵母、己氏酵母（也称为卡氏酵母）、贝 酵母、乳酸克鲁维酵母、马克斯克鲁维酵母、粟酒裂殖酵母、白色假丝酵母、毕赤酵母、树干 毕赤酵母、解脂耶氏酵母、多形汉逊酵母、红法夫酵母、产航假丝酵母、耐盐酵母、汉逊德己 利酵母、多形德己利酵母或西方许旺酵母。上述的酵母细胞的衍生物，即，已经被充分改变 W改变基因组至其是不同物种的程度的酵母也可根据本方法使用。因此，本文所述的宿主 细胞包括酿酒酵母、己氏酵母（也称为卡氏酵母）、贝酵母、乳酸克鲁维酵母、马克斯克鲁维 酵母、粟酒裂殖酵母、白色假丝酵母、毕赤酵母、树干毕赤酵母、解脂耶氏酵母、多形汉逊酵 母、红法夫酵母、产航假丝酵母、耐盐酵母、汉逊德己利酵母、多形德己利酵母和西方许旺酵 母的衍生物。
[0179] 更具体地，本发明也包括重组构建体，其包括如上面大体描述的一个或多个序列。 构建体包括已经W正向或反向定向插入本发明序列的载体，如质粒或病毒载体。在该实施 方案的一个方面，构建体进一步包括可操作地连接至序列的调节序列，包括，例如，启动子。 大量的适合的载体和启动子是本领域技术人员已知的，并且是商业上可得的。W实例的方 式提供下述载体。
[0180] 酵母：酵母载体基于它们在酵母中的复制模式，包括五种一般类型的载体： YIp(酵母整合质粒）、Y化（酵母复制质粒）、YCp(具有引入着丝粒（CEN)元件的酵母复制 质粒）、YEp(酵母附加体质粒）和YLp(酵母线性质粒）。除了YLp质粒W外，所有运些质 粒可保持在大肠杆菌W及酿酒酵母中并且因此也被称为酵母穿梭载体。在某些方面中，运 些质粒包含两种类型的可选择的基因：质粒编码的药物抗性基因和克隆的酵母基因，其中 药物抗性基因通常用于在细菌细胞中选择，并且克隆的酵母基因用于在酵母中选择。药物 抗性基因包括氨节西林、卡那霉素、四环素、新霉素和甲喀横隆。克隆的酵母基因包括HIS3、 LEU2、LYS2、TRP1、URA3、TRP1和SMR1。pYAC载体也可用于克隆大片段的外源DNA至人工线 性染色体上。 阳181] 在本发明的某些方面中，使用YCp质粒，其由于引入着丝粒元件而具有高频率的 转化和增加的稳定性。在本发明的某些其他方面，使用Y邱质粒，其在酵母中提供高水平的 基因表达。在本发明的另外的方面，使用Y化质粒。
[0182] 在某些实施方案中，载体包括（1)第一多核巧酸，其中第一多核巧酸编码灰腐质 霉、魏氏假丝酵母、棘抱曲霉、米曲霉、斜邸青霉、球毛壳菌、瘤胃真菌、汉逊德己利酵母、马 克斯克鲁维酵母或致病疫霉BGL或其结构域、片段、变体或衍生物；和（2)第二多核巧酸， 其中第二多核巧酸编码灰腐质霉、魏氏假丝酵母、棘抱曲霉、米曲霉、斜邸青霉、球毛壳菌、 瘤胃真菌、汉逊德己利酵母、马克斯克鲁维酵母或致病疫霉BGL或其结构域、片段、变体或 衍生物。 阳183] 在进一步的实施方案中，第一和第二多核巧酸是相同定向的，或第二多核巧酸与 第一多核巧酸相反定向。在另外的实施方案中，第一多核巧酸是第二多核巧酸的N-末端或C-末端。在某些其他实施方案中，第一多核巧酸和/或第二多核巧酸由密码子优化的多核 巧酸，例如，针对酿酒酵母密码子优化的多核巧酸编码。
[0184] 在具体的实施方案中，本发明的载体是选自下述的质粒：pMU3557、PMU3558、 PMU3559、PMU3560、PMU3561、PMU3562、PMU3563、PMU3564、PMU3565，或pMU3566(SEQID N0:31-40)。运些质粒的描述见实施例1和图1-10。但是，可使用任何其他质粒或载体，只 要它们在宿主中可复制和有活力。
[01化]启动子区域可选自任何期望的基因。具体列举的酵母启动子包括ENOl启动子、 PGKl启动子、TEFl启动子和HXT7启动子。具体列举的细菌启动子包括lacI、lacZ、T3、T7、 甜*、^?3、化和付9。真核启动子包括立早〔1￥、服￥胸巧激酶、早期和晚期5￥40、来自逆转 录病毒的LTR和小鼠金属硫蛋白-1。适当的载体和启动子的选择全落在本领域普通技术人 员的水平内。
[0186] 将构建体引入宿主酵母细胞，例如，酿酒酵母，可通过乙酸裡转化、原生质球转 化或通过电穿孔的转化实现，如例如在化rrentProtocolsinMolecularBiology， 13. 7. 1-13. 7. 10 中描述。
[0187] 将构建体引入其他宿主细胞可通过憐酸巧转染、DEAE-葡聚糖介导的转染或电穿 孔实现。参见例如，Davis等，BasicMethodsinMolecularBiology, 1986。
[0188] 宿主细胞中的构建体可WW常规方式使用，W产生由重组序列编码的基因产物。 供选择地，本发明的多肤可通过常规的肤合成仪合成产生。
[0189] 在产生适当的宿主细胞和宿主细胞生长至适当的细胞密度之后，通过适当的方式 (例如，溫度变化或化学诱导）诱导选择的启动子并且再培养细胞一段时间。
[0190] 通常通过离屯、收获细胞，通过物理或化学方式破坏细胞，并且保留所得粗提取物 用于进一步纯化。 阳191]可通过任何方便的方法破坏在