专利名称：一种制备那西肽预混剂的方法
技术领域：
本发明属生物制药领域，涉及一种药用饲料添加剂的制备方法，具体涉及一种制备含硫多肽类抗生素那西肽预混剂的方法。
背景技术：
饲料安全是绿色环保食品的基本点，我国幅员辽阔，人口众多，随着改革开放的步伐加快，人民生活水平提高，畜禽水产的需求量也日益增多。另外我国是一个农业大国，禽畜产品出口量很大，但药物残留问题很严重，因此研究和开发绿色饲料添加剂对保障人民身体健康和发展我国农业经济十分必要。2001年7月农业部颁发了《饲料药物添加剂使用规范》的通知，并列出了33种符合规范的饲料药物添加剂，那西肽是其中之一。它是一种新型非吸收型的饲用抗生素。
新兽药那西肽(又名诺西肽，英文名Nosiheptide)是生物工程的产物，由Streptomyces actuosus发酵产生，为含硫多肽类抗生素，其结构为12种氨基酸及衍生物合成的多肽，分子量为1222。那西肽是一种黄色结晶，较难溶于水。其结构(Merck index，fourth edtion)见图7。分子中由五个噻唑环、一个吡啶环、一个吲哚环、一个苏氨酸和一个谷氨酸组成，侧链是一个脱氢丙氨酸。那西肽对革兰氏阳性菌有很强的抑制作用，其作用机理是抑制翻译过程中的延长因子Tu和G，抑制革兰氏阳性菌的生长。同时抑制鸟苷三、四磷酸酶的合成。
那西肽是国外1961年发现的化合物，70年代法国朗普洛克公司曾对其进行研究，80年代未由日本三菱公司开发成新型非吸收型的饲用抗生素，并于1987年12月25日被日本政府批准为法定的饲料添加剂，列入了日本饲料安全法，其商品名为PrilnofaX(Hess & Clark)。由于其在体内不残留的性质，目前被欧共体、北美、日本等国广泛使用那西肽作为饲料用添加剂具有以下特点1，动物专用抗生素，不引起交叉耐药。2，在动物体内不残留，不污染食品。3，添加量少(5-10ppm)，促生长效果明显(增重8-10％)。并提高饲料报酬。4，.应用范围广，可用于禽、畜、鱼等。
1988年上海医科大学对那西肽进行开发研究，1998年6月获农业部颁发那西肽新兽药证书(三类)(原料药和预混剂)。并经中国兽药监察所对那西肽样品的测试鉴定，产品质量与国外同类产品完全一致。2002年，浙江杭州汇能生物技术公司与复旦大学合作将那西肽产业化，其中，那西肽产生菌S.actuosus Z13，为生产菌种，商品名为“诺农”。目前年销售产值7000万。并在禽、畜和水产上广泛应用，获得良好的社会效益。但是综观国内外文献，尚未见有关那西肽预混剂制备方法的报道。
发明内容
本发明的的目的是提供一种制备那西肽预混剂的方法。尤其是制备含硫多肽类抗生素那西肽预混剂的方法。
本发明方法包括下述步骤1，基因工程制备那西肽产生菌Streptomyces actuosus本发明在已知的那西肽产生菌S.actuosusZ13的研究基础上，采用基因工程技术改变那西肽产生菌Z13的代谢，提高其产量。
首先，采用DNA重组技术，构建含透明颤菌血红蛋白(VHb)的基因vhb的重组DNA(基因工程操作见附图1，2)，通过转化和结合转移方法将含vhb基因的重组DNA转入Z13，获得工程链霉菌Streptomyces actuosus，(工程菌代号Z14，Z15)。在工业生产供氧不足的情况下，由于VHb蛋白的大量表达，提高了活跃链霉菌Streptomyces.actuosus Z14，Z15对氧的利用效率，使菌体生长旺盛，从而达到提高那西肽产率和降低生产成本的目的。
第二，本发明采用基因工程技术，构建含S-腺苷甲硫氨酸合成酶SAMs的基因sam的重组DNA(基因工程操作见附图3，4)，通过转化和结合转移方法将含sam基因的重组DNA转入Z13，获得工程链霉菌Streptomyces actuosus工程菌(工程菌代号Z16，Z17)。通过SAMs蛋白的表达，改变了活跃链霉菌Streptomyces.actuosus Z13的硫代谢，提高了S-腺苷甲硫氨酸的产量，从而达到提高那西肽产量的目的。
第三，本发明采用基因工程技术构建含vhb和sam两个基因的重组DNA，(基因工程操作见附图5，6)，通过转化和结合转移方法将含vhb和sam两个基因的重组DNA转入Z13，获得工程链霉菌Streptomyces actuosus(工程菌代号Z18，Z19)，通过VHb和SAMs蛋白的表达改变活跃链霉菌的代谢，达到提高那西肽产量的目的。
2.那西肽发酵；那西肽发酵培养基由黄豆粉、葡萄糖、无机盐等组成，控制最佳温度为26-30℃，pH为中性，发酵周期为9-10天。
3，分离提取那西肽采用溶媒法将菌体内的那西肽提取，发酵液量取体积数，加入等体积酒精，均浆、离心、收集上清、浓缩、用正丁醇萃取、浓缩蒸干、加入二氧六环溶解，再加入水沉淀那西肽、沉淀的那西肽用水洗，且烘干。用HPLC测定含量和按兽药典检测生物活性。
4制备那西肽预混剂取那西肽，加入淀粉、黄豆饼粉、米糠粉、玉米粉、麸皮、大米蛋白粉、石粉(CaCO3)、沸石粉等辅料，逐级稀释，混合拌匀、做成0.25％-10％不同规格的预混剂。用HPLC测定含量和按药典检测生物活性。
图.1vhb转化表达质粒构建图2，含vhb整合载体的构建图.3含sam转化表达质粒构建图4，含sam整合载体的构建图5，含vhb和sam转化载体的构建图6，含vhb和sam整合载体的构建图7，那西肽结构图。
具体实施例方式
实施例1那西肽产生菌Z13接种于种子罐，生长40-48小时，按5％接种量接入30吨发酵罐，以1∶1通气量，控制温度为28-30℃，搅拌160-180转/分其中根据pH和糖含量、菌体形态补料，培养9天，出料20吨，每升发酵单位达2.3克。经提取获那西肽23.46公斤(纯度85％)；加入加入淀粉、黄豆饼粉、米糠粉、玉米粉、麸皮、大米蛋白粉、石粉(CaCO3)、沸石粉等辅料，逐级稀释，混合拌匀，得预混剂7.98吨(0.25％规格)。
实施例2，那西肽产生菌Z14接种于种子罐，生长40-48小时，按5％接种量接入30吨发酵罐，以1∶0.5通气量，控制温度为28-30℃，搅拌160-180转/分，其中根据pH和糖含量、菌体形态补料，培养9天，出料20吨，每升发酵单位达3.2克。经提取获那西肽32.6公斤(纯度85％)；加入淀粉、黄豆饼粉、麸皮、米糠粉、大米蛋白粉、石粉(CaCO3)、沸石粉等，逐级稀释，混合拌匀，得预混剂11.08吨(0.25％规格)。
实施例3，那西肽产生菌Z15接种于种子罐，生长40-48小时，按5％接种量接入30吨发酵罐，以1∶0.5通气量，控制温度为28-30℃，搅拌160-180转/分，其中根据pH和糖含量、菌体形态补料，培养9天，出料21吨，每升发酵单位达4.2克。经提取获那西肽44.982公斤(纯度85％)；加入淀粉、黄豆饼粉、米糠粉、麸皮、玉米粉、石粉(CaCO3)、沸石粉等，逐级稀释，混合拌匀，得预混剂(0.5％规格)7.65吨。
实施例4，那西肽产生菌Z16接种于种子罐，生长40-48小时，按5％接种量接入50吨发酵罐，以1∶0.8通气量，控制温度为28-30℃，搅拌160转/分，其中根据pH和糖含量、菌体形态补料，培养9天，出料35吨，每升发酵单位达4.5克。经提取获那西肽80.33公斤(纯度85％)；加入米糠粉、麸皮、玉米粉、大米蛋白粉、石粉(CaCO3)、沸石粉等，逐级稀释，混合拌匀，得预混剂(0.5％规格)13.656吨。
实施例5，那西肽产生菌Z19接种于种子罐，生长40-48小时，按5％接种量接入50吨发酵罐，以1∶0.5通气量，控制温度为28-30℃，搅拌160转/分，其中根据pH和糖含量、菌体形态补料，培养9天，出料35吨，每升发酵单位达5.0克。经提取获那西肽89.25公斤(纯度85％)；加入米糠粉、麸皮、玉米粉、大米蛋白粉、石粉(CaCO3)、沸石粉等，逐级稀释，混合拌匀，得预混剂(5％规格)1.517吨。
权利要求
1.一种制备那西肽预混剂的方法，其特征是包括下述步骤1)基因工程制备那西肽产生菌；2)那西肽发酵；3)分离提取那西肽；4)取上述那西肽，加入辅料，逐级稀释，混合拌匀、制备那西肽预混剂。
2.按权利要求1所述的制备那西肽预混剂的方法，其特征是所述的步骤1中采用DNA重组技术，构建含透明颤菌血红蛋白的基因vhb的重组DNA，通过转化和结合转移将含vhb基因的重组DNA转入Z13，获得工程链霉菌Z14，Z15；构建含S-腺苷甲硫氨酸合成酶SAMs的基因sam的重组DNA，通过转化和结合转移将含sam基因的重组DNA转入Z13，获得工程链霉菌Z16，Z17；建含vhb和sam两个基因的重组DNA，通过转化和结合转移将含vhb和sam两个基因的重组DNA转入Z13，获得工程链霉菌Z18，Z19。
3.按权利要求1所述的制备那西肽预混剂的方法，其特征是所述的步骤2其中那西肽发酵培养基含黄豆粉、葡萄糖和无机盐成份，控制温度为26-30℃，pH为中性，发酵周期为9-10天。
4.按权利要求1所述的制备那西肽预混剂的方法，其特征是所述的步骤3其中采用溶媒法提取菌体内的那西肽，发酵液量取体积数，加入等体积酒精，均浆、离心、收集上清、浓缩、用正丁醇萃取、浓缩蒸干、加入二氧六环溶解，再加入水沉淀那西肽，水洗沉淀物，烘干，测定含量和检测生物活性。
5.按权利要求1所述的制备那西肽预混剂的方法，其特征是所述的步骤4其中那西肽的含量为0.25％-10％，所述辅料包括淀粉、黄豆饼粉、米糠粉、玉米粉、麸皮、大米蛋白粉、CaCO3和沸石粉。
全文摘要
本发明属生物制药领域，涉及一种药用饲料添加剂的制备方法，具体涉及一种制备含硫多肽类抗生素那西肽预混剂的方法。本发明通过基因工程制备那西肽产生菌，进行那西肽发酵，分离提取后加入辅料，逐级稀释，混合拌匀、制备那西肽预混剂。检测结果表明本方法能提高活跃链霉菌对氧的利用效率，使菌体生长旺盛，从而达到提高那西肽产率和降低生产成本的目的。
文档编号C12P21/02GK1899599SQ20051002787
公开日2007年1月24日 申请日期2005年7月19日 优先权日2005年7月19日
发明者周珮, 陈贵才, 冯美卿, 李继扬, 万睿, 文勇 申请人:复旦大学