专利名称：泌尿生殖道支原体药敏定量培养基及其制备方法
技术领域：
本发明涉及临床微生物培养和药敏试验，具体涉及泌尿生殖道支原体药敏定量培养基及其制备方法。
背景技术：
支原体是生殖道、呼吸道及细胞株感染的常见病原体，占整个感染病的30％-50％。从人类泌尿生殖道检出的支原体就有7种之多，包括人型支原体、解脲脲原体、生殖器支原体等。在性传播和泌尿生殖道疾病中，以支原体为病原体的检出率占性病人群的40％-70％。支原体感染可导致尿生殖道炎、前列腺炎、盆腔炎、男性不育、女性不孕、绒毛膜炎和低出生体重儿等疾病。
我国泌尿生殖道感染的发病率居高不下，由解脲脲原体(U.u)和人型支原体(M.h)引起的尿道炎、盆腔炎等各种泌尿生殖道感染占总发病率1/3以上，在我国已经法定为性传播疾病(中华人民共和国卫生部性病防治病理办法，1991年8月12日)。解脲脲原体可引起泌尿生殖道感染，并被认为是非淋球菌性尿道炎中仅次于衣原体(占50％)的重要病原体。由于80％孕妇的生殖道内带有解脲脲原体，可通过胎盘感染胎儿而导致早产、死胎，或在分娩时感染新生儿，引起呼吸道感染。此外，解脲脲原体还可引起不孕症。解脲脲原体(M.urealyticum)为脲原体属中唯一的一个种，因生长需要尿素而得名。菌落微小，直径仅有15～25μm，须在低倍显微镜下观察，故旧称T株(tinystrain)。菌落表面有粗糙颗粒，在合适条件下可转成典型的荷包蛋样菌落。生长需要胆固醇和尿素，分解尿素为其代谢特征，产生氨氮，使培养基pH上升，导致自身死亡。
由于抗菌药物广泛应用，解脲脲原体(U.u)和人型支原体(M.h)的耐药性不断增加。耐药率高可能与不规范应用抗生素或者不经正规治疗或者地区差异有关。随着耐药株的增多和新抗菌药物的不断出现，对泌尿生殖道支原体感染的患者，选择合理有效的治疗方案和药物非常重要。其主要措施是进行药物敏感试验，密切注意泌尿生殖道支原体的耐药性发展，根据药敏试验提供的依据有目的的选择敏感药物治疗。
国内外对支原体诊断技术的研究主要有特异性抗体检测技术、代谢抑制试验、Southern Bolt、PCR法及培养法。抗体检测技术易出现交叉反应。代谢抑制试验，需加特异性抗体抑制支原体的生长，临床应用不多。Southern Blot实验技术要求较高，不易普遍开展。PCR法容易出现假阴性和假阳性。培养法现为国内医院普遍采用的支原体检测手段，此法根据支原体的生活习性而采用特异性培养基、选择性培养从而实现检测目的。国内各医院常用的培养法检测试剂有单一支原体培养基，如单一解脲脲原体培养基或单一人型支原体培养基；联合型支原体培养基，能在一种试剂中同时检出几种支原体(专利号CN96117201.0)，但是支原体培养缺乏稳定性，计数方法复杂且重复性差，在临床常规诊断中难以应用(BA.Forbes等主编Bailey&Scott’sDia-gnosticMicrobiology，10thed，1998，P776-774)。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种泌尿生殖道支原体药敏定量培养基及其制备方法，使样品中支原体能稳定存活并建立简便可靠的计数方法，能在一个反应孔中鉴别解脲脲原体(U.u)和人型支原体(M.h)，同时在含一定量抗生素的其它孔中判别抗生素是耐药还是敏感。
本发明提供的一种泌尿生殖道支原体药敏定量培养基包括1.运输培养基(每1000ml)水 800-1000mlPPLO 15-30g1N HCL 5-10ml氨苄青霉素钠盐 0.01-0.03g多粘菌素E 0.01-0.03g磺胺甲基异恶唑(SMZ)0.1-1ml甲氧苄胺嘧啶(TMP) 0.1-1ml2.生长培养基(每1000ml)水 150-300ml酵母粉 15.5-18gL-精氨酸 25-30gL-半胱氨酸盐酸盐 0.3-1g尿素 10-14g1％酚红11-13ml2N HCL 30-55ml氨苄青霉素 2-6g多粘菌素E 0.3-0.5gSMZ3-7mlTMP3-7ml马血清 500-750ml3.完全培养基(每1000ml)水 600-900mlPPLO 10-15g1N HCL 3-10ml2N HCL 10-30ml酵母粉 2-8gL-精氨酸 7-10gL-半胱氨酸盐酸盐 0.1-1g尿素 1-5g1％酚红2-5ml
氨苄青霉素 0.5-1g多粘菌素E 0.1-0.5gSMZ1-2mlTMP1-2ml马血清 200-300ml支原体液体记数法的建立取U.u或M.h或其它支原体菌液，用本发明中的完全培养基或其它相应生长培养基作10倍系列稀释，选择3个稀释度，各取0.1ml接种1.0ml完全培养基或其它相应生长培养基，一式三份，36±1℃培养4天，记录每一个稀释度的三管中显示生长的管数(3、2、1或0)得到一组3个数字，查阅附表1，得出支原体最可能数，再乘上实际选用的三个连续稀释度与表中稀释度相差的倍数，即为支原体每ml最可能ccu数。
在U.u≥104/ml判别孔中加入0.01～0.05mol/ml，最适0.02mol/ml PH6.3Na2HPO4-KH2PO4缓冲对.控制U.u生长速率，使在24h判别结果时只有U.u≥104ccu/ml的样品才能呈现阳性结果，用一个反应孔就较可靠的区分出样品中的U.u量是否达到感染的水平。
一种泌尿生殖道支原体药敏定量培养基的制备方法，包括如下步骤1.运输培养基制备(1)称取支原体PPLO培养基于粉15-30g，加入800-1000ml纯化水，再加入5-10ml 1N的HCL，调PH至6.2～6.3，加热溶解分装，121℃、20min高压灭菌；(2)称取0.01-0.03g氨苄青霉素和0.01-0.03g多粘菌素E，加入5-15ml无菌水，溶解后加入上述培养基。
(3)称SMZ(磺胺甲基异恶唑)20-60mg，溶于1-7ml甲醇。称TMP(甲氧苄胺嘧啶)5-20mg溶于1-5ml DMSO(二甲亚砜)。在上述培养基中加入TMP溶液和SMZ溶液各0.1-1ml。
(4)将培养基分装高压灭菌螺口瓶，2～8℃保存；每1000毫升运输培养基中配对增加SMZ 5～30mg和TMP 1～10mg，SMZ最适15mg，TMP最适3mg。
2.生长培养基制备(1)称25-30g L-精氨酸、0.3-1g L-半胱氨酸盐酸盐、10-14g尿素，加入100ml灭菌纯化水和10-40ml 2N的HCL溶解，0.22μm滤膜无菌过滤。
(2)称15.5-18g酵母抽提物，加100-150ml纯化水，121℃、20min，高压灭菌后和上述溶液混合。
(3)加入马血清500-750ml和1％酚红11-13ml，摇匀。
(4)称2-6g氨苄青霉素和0.3-0.5g多粘菌素E，加5-15ml无菌水，溶解后加入上述培养基。
(5)加入TMP及SMZ溶液各3-7ml。
(6)最后加入30-55ml左右2N的HCl，摇匀，调PH至6.2～6.9。
(7)将1-10ml西林瓶与丁基胶塞纯化水洗涤，烘干，121℃、20min，高压灭菌，分装西林瓶。
(8)将预冻好的培养基抽真空干燥，真空冻干20-30hr，排气，2-8℃保存。
3.完全培养基制备将2份上述运输培养基加入到1份(冻干前体积)上述生长培养基冻干品中即为完全培养基。
支原体运输培养基含有营养丰富的支原体营养成分(PPLO)和抑制泌尿生殖道可能存在的各种其它细菌的抑菌物质，抑菌物质决不能对支原体有任何伤害，常用的是氨苄青霉素和多粘菌素，但仅用这二种抗生素不能使运输培养基在2～8℃维持18个月不长杂菌，在运输培养基中配对加入磺胺甲基异恶唑(SMZ)和甲氧苄胺嘧啶(TMP)增加其功能的稳定性，改进后的运输培养基在2～8℃18个月以下功能不变。使用本发明的运输培养基104-5ccu/ml的解脲脲原体(U.u)和人型支原体(M.h)在该运输培养基中置36±1℃8小时再测定仍≥104ccu/ml，0.5×10-3麦氏单位大肠杆菌和金黄色葡萄球菌以1/20体积加入运输培养基，36±1℃培养18小时生长良好，不见任何泌尿道中可能存在的杂菌以及污染菌有浑浊生长。
具体实施例方式
实施例1运输培养基制备称取PPLO培养基20g，加入980ml纯化水，再加入约8.0ml1N的HCL，调PH至6.2～6.3，稍微加热溶解，分装盐水瓶或三角烧瓶，121℃、20min高压灭菌；称取0.0215g氨苄青霉素和0.0215g多粘菌素E，加入10ml无菌水，溶解后加入上述培养基。称SMZ50mg，溶于1ml甲醇。称TMP10mg溶于1mlDMSO。在上述培养基中加入TMP溶液和SMZ溶液各0.3ml将5ml螺口瓶及盖纯化水洗涤，烘干，121℃、20min，高压灭菌；将培养基分装螺口瓶，2.0ml/瓶，拧上盖子，颠倒放置，应无渗漏，贴标签，2～8℃保存。
抑菌能力测试在血平皿上分别培养大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，36±1℃18h，在无菌生理盐水中制备其0.5麦氏单位悬液，分别作103稀释，各取0.1ml加入储存不同日期的运输培养基2.0ml/瓶，置36±1℃培养8小时，观察是否长菌。以不加SMZ-TMP的运输培养基为对照。
运输培养基存放2～8℃
存活能力测试取已定量、用储存不同日期的本运输培养基新稀释成的104-5ccu/ml U.u和M.h的支原体菌液，置36±1℃8小时，立刻在支原体试剂盒上测定，以现配的运输培养基为对照测定。
测试试剂盒为Mycoview，对照试剂测定所有结果也是+实施例2生长培养基制备称27.8g L-精氨酸、0.9g L-半胱氨酸盐酸盐、10.92g尿素，加入100ml灭菌纯化水和20ml 2N的HCL溶解，0.22μm滤膜无菌过滤。
称17.5g酵母抽提物，加130ml纯化水，121℃、20min，高压灭菌后和上述溶液混合。加入马血清700ml和1％酚红12.9ml，摇匀。称2.52g氨苄青霉素和0.336g多粘菌素E，加10ml无菌水，溶解后加入上述培养基。最后加入TMP(100mg/ml)及SMZ(500mg/ml)溶液各3.4ml。加入33ml左右2N的HCl，摇匀，调PH至6.2～6.3。将5ml西林瓶与丁基胶塞纯化水洗涤，烘干，121℃、20min，高压灭菌，将培养基分装西林瓶，0.65ml/瓶。将分装好培养基的西林瓶放入真空干燥机(-30～-40℃)预冻至温度平衡(1-2小时)，冻干机中预冻好的培养基，真空冻干24hr以上，冻干结束，自动压盖，排气(极缓慢！)取出轧盖，贴标签，2~8℃保存。完全培养基制备2ml本发明中的运输培养基加入到1瓶0.65ml生长培养基冻干品中即为完全培养基。
支原体MPN计数法取法国Ivagen公司提供的传统A7琼脂法定量104ccu/ml U.u，在生理盐水中作十倍系列稀释后，接种培养瓶，每个稀释度接种3瓶，每瓶含完全培养基1ml，每瓶接种0.1ml；一般需要选择接种3～5个稀释度。
然后放36±1℃培养4天观察结果，结果如下待计数支原体的稀释度
+支原体生长，培养瓶变色0支原体不生长，培养瓶未变色根据本发明和结果示例可知其结果为3，3，1(如样品稀释选10-3～10-5)或3，1，0(如样品稀释选10-4～10-6)。查阅所附支原体MPN检索表后得知其ccu/ml数为4.6×104/ml或4.3×104/ml附表 测定支原体最可能数(MPN)检索表
续附表 测定支原体最可能数(MPN)检索表
实施例3U.u生长速率控制——U.u≥104ccu/ml定量及鉴别反应孔的制备称取272mgNa2HPO4和82mgKH2PO4溶与100ml蒸馏水，加入林可霉素盐酸盐使其终浓度为16μg/ml，在反应条第2孔(U.u鉴别定量孔)中加入50μl，37℃18小时-24小时干燥。
分别加103和104-5ccu/ml U.u样品0.2ml进入2ml实施例1的运输培养基中混匀，倒入实施例2的冻干的生长培养基瓶中，复溶混匀后各加入U.u鉴别和定量反应孔中，上面滴加无菌石蜡油1滴，置36±1℃培养24小时，结果是104-5ccu/ml的U.u样品呈红色为阳性，103ccu/ml的U.u样品仍呈黄色为阴性。任何浓度的M.h样品在上述测定中均不变色，呈阴性。
实施例4运输培养基制备称取PPLO培养基30g，加入1000ml纯化水，再加入约10.0ml1N的HCL，调PH至6.2～6.3，稍微加热溶解，分装盐水瓶或三角烧瓶，121℃、20min高压灭菌；称取0.03g氨苄青霉素和0.03g多粘菌素E，加入15ml无菌水，溶解后加入上述培养基。称SMZ50mg，溶于1ml甲醇。称TMP10mg溶于1ml DMSO。在上述培养基中加入TMP溶液和SMZ溶液各1ml，将螺口瓶及盖纯化水洗涤，烘干，121℃、20min，高压灭菌；将培养基分装螺口瓶，2.0ml/瓶，拧上盖子，颠倒放置，应无渗漏，贴标签，2～8℃保存。
实施例5生长培养基制备称30g L-精氨酸、1g L-半胱氨酸盐酸盐、14g尿素，加入100ml灭菌纯化水和40ml 2N的HCL溶解，0.22μm滤膜无菌过滤。
称18g酵母抽提物，加130ml纯化水，121℃、20min，高压灭菌后和上述溶液混合。加入马血清750ml和1％酚红13ml，摇匀。称6g氨苄青霉素和0.5g多粘菌素E，加15ml无菌水，溶解后加入上述培养基。最后加入TMP(100mg/ml)及SMZ(500mg/ml)溶液各7ml。加入55ml左右2N的HCl，摇匀，调PH至6.2～6.3。将西林瓶与丁基胶塞纯化水洗涤，烘干，121℃、20min，高压灭菌，将培养基分装西林瓶，0.65ml/瓶。将分装好培养基的西林瓶放入真空干燥机(-30～-40℃)预冻至温度平衡(1-2小时)，冻干机中预冻好的培养基，真空冻干24hr以上，冻干结束，自动压盖，排气(极缓慢！)取出轧盖，贴标签，2～8℃保存。
实施例6运输培养基制备称取PPLO培养基15g，加入800ml纯化水，再加入约5.0ml1N的HCL，调PH至6.2～6.3，稍微加热溶解，分装盐水瓶或三角烧瓶，121℃、20min高压灭菌；称取0.01g氨苄青霉素和0.01g多粘菌素E，加入15ml无菌水，溶解后加入上述培养基。称SMZ 50mg，溶于1ml甲醇。称TMP10mg溶于1ml DMSO。在上述培养基中加入TMP溶液和SMZ溶液各0.1ml，将螺口瓶及盖纯化水洗涤，烘干，121℃、20min，高压灭菌；将培养基分装螺口瓶，2.0ml/瓶，拧上盖子，颠倒放置，应无渗漏，贴标签，2～8℃保存。
实施例7生长培养基制备称25g L-精氨酸、0.3g L-半胱氨酸盐酸盐、10g尿素，加入100ml灭菌纯化水和30ml 2N的HCL溶解，0.22μm滤膜无菌过滤。
称15.5g酵母抽提物，加150ml纯化水，121℃、20min，高压灭菌后和上述溶液混合。加入马血清500ml和1％酚红11ml，摇匀。称2g氨苄青霉素和0.3g多粘菌素E，加10ml无菌水，溶解后加入上述培养基。最后加入TMP(100mg/ml)及SMZ(500mg/ml)溶液各3ml。加入30ml左右2N的HCl，摇匀，调PH至6.2～6.3。将西林瓶与丁基胶塞纯化水洗涤，烘干，121℃、20min，高压灭菌，将培养基分装西林瓶，0.65ml/瓶。将分装好培养基的西林瓶放入真空干燥机(-30～-40℃)预冻至温度平衡(1-2小时)，冻干机中预冻好的培养基，真空冻干24hr以上，冻干结束，自动压盖，排气(极缓慢！)取出轧盖，贴标签，2~8℃保存。
以下是该试剂盒在法国由Ivagen公司请法国医院做的临床报告。
《泌尿生殖道病原性支原体药敏定量培养板》临床报告临床测试时间2003年9月-2004年2月地点法国RAMBOUILLET and VERSAILLES医院主持人常规检验科主任 J.Pollet博士微生物实验室主任 J.C.Ghnassia博士方法将试剂盒与黄金标准A7琼脂平皿培养法作平行比较。
试剂盒批号EV1203，有效期至2004年11月。
试剂盒组成反应板条 20个液体运输培养基20瓶冻干生长培养基20瓶石蜡油2瓶拭子 20根塑料插条架1只临床样品收集500份样品，测试493份，大部分拭子是病人泌尿道拭子，男性30％，女性70％。少部分样品(30％)是临床分离株。
结果见附图
敏感度165/175＝94.2％特异性300/318＝94.3％试剂盒与A7黄金标准之间的相关94.3％阳性判别值104ccu/ml容易使用中译文略测试原理中译文略结论1)在鉴定和计数U.u和M.h上效果显著。
2)我们未发现试剂盒与A7琼脂平皿培养法之间有重要的不符合。
权利要求
1.一种泌尿生殖道支原体药敏定量培养基，其特征是培养基包括(1).运输培养基(每1000ml)水 800-1000mlPPLO15-30g1N HCL 5-10ml氨苄青霉素钠盐 0.01-0.03g多粘菌素E 0.01-0.03gSMZ 0.1-1mlTMP 0.1-1ml(2)生长培养基(每1000ml)水 150-300ml酵母粉 15.5-18gL-精氨酸25-30gL-半胱氨酸盐酸盐0.3-1g尿素10-14g1％酚红 11-13ml2N HCL 30-55ml氨苄青霉素 2-6g多粘菌素E 0.3-0.5gSMZ 3-7mlTMP 3-7ml马血清 500-750ml(3)完全培养基(每1000ml)水 600-900mlPPLO10-15g1N HCL 3-10ml2N HCL 10-30ml酵母粉 2-8gL-精氨酸7-10gL-半胱氨酸盐酸盐0.1-1g尿素1-5g1％酚红 2-5ml氨苄青霉素 0.5-1g多粘菌素E 0.1-0.5gSMZ 1-2mlTMP 1-2ml马血清 200-300ml
2.如权利要求1所述的一种泌尿生殖道支原体药敏定量培养基，其特征是每1000毫升运输培养基中配对增加SMZ 5～30mg和TMP 1～10mg。
3.如权利要求2所述的一种泌尿生殖道支原体药敏定量培养基，其特征是SMZ为15mg，TMP为3mg。
4.如权利要求1所述的一种泌尿生殖道支原体药敏定量培养基，其特征是完全培养基在支原体液体记数定量法的应用。
5.一种泌尿生殖道支原体药敏定量培养基及其制备方法，包括如下步骤A.运输培养基制备(1)称取支原体PPLO培养基干粉15-30g，加入800-1000ml纯化水，再加入5-10ml 1N的HCL，调PH至6.2～6.3，加热溶解分装，高压灭菌；(2)称取0.01-0.03g氨苄青霉素和0.01-0.03g多粘菌素E，加入5-15ml无菌水，溶解加入上述培养基；(3)称SMZ 20-60mg，溶于1-7ml甲醇。称TMP 5-20mg溶于1-5ml二甲亚砜，在上述培养基中加入TMP溶液和SMZ溶液各0.1-1ml；(4)将培养基分装高压灭菌螺口瓶，2～8℃保存；B.生长培养基制备(1)称25-30g L-精氨酸、0.3-1g L-半胱氨酸盐酸盐、10-14g尿素，加入100ml灭菌纯化水和10-40ml 2N的HCL溶解，0.22μm滤膜无菌过滤；(2)称15.5-18g酵母抽提物，加100-150ml纯化水，高压灭菌后和上述溶液混合；(3)加入马血清500-750ml和1％酚红11-13ml，摇匀；(4)称2-6g氨苄青霉素和0.3-0.5g多粘菌素E，加5-15ml无菌水，溶解后加入上述培养基；(5)加入TMP及SMZ溶液各3-7ml；(6)最后加入30-50ml左右2N的HCl，摇匀，调PH至6.2～6.9；(7)将1-10ml西林瓶与丁基胶塞纯化水洗涤，烘干，高压灭菌，分装，放入冷冻干燥机(-30--40℃)预冻至温度平衡1-2小时；(8)将预冻好的培养基真空干燥，真空冻干20-30hr排气，2-8℃保存；C.完全培养基制备将2份上述运输培养基加入到1份(冻干前体积)上述生长培养基冻干品中。
6.如权利要求5所述的一种泌尿生殖道支原体药敏定量培养基及其制备方法，其特征是所述的运输培养基SMZ 45-50mg，TMP 10-15mg。
全文摘要
本发明涉及临床微生物培养和药敏试验，具体涉及泌尿生殖道支原体药敏定量培养基及其制备方法。支原体培养基包括(1)运输培养基(2)生长培养基(3)完全培养基，主要有支原体PPLO，精氨酸，L－半胱氨酸盐酸盐，尿素，氨苄青霉素，多粘菌素E，SMZ和TMP等组成，该培养基使样品中支原体能稳定存活并建立简便可靠的计数方法，能在一个反应孔中鉴别解脲脲原体(U.u)和人型支原体(M.h)，同时在含一定量抗生素的其它孔中判别抗生素是耐药还是敏感。
文档编号C12Q1/04GK1710094SQ20051002746
公开日2005年12月21日 申请日期2005年7月4日 优先权日2005年7月4日
发明者徐建新 申请人:上海奥普生物医药有限公司