专利名称：：肺炎型支原体药敏快速检测试剂及制备方法
技术领域：
：本发明涉及体外诊断试剂及制备方法，特别涉及因支原体引起的呼吸道及肺部疾病检测的药敏检测试剂及制备方法。
背景技术：
：肺炎型支原体是呼吸道和肺部感染性疾病的常见病原体，检出率占呼吸道感染人群的20%40%。肺炎支原体感染可引起上呼吸道感染及支原体肺炎，其用药方法与病毒性、细菌性感染均不同，不同个体感染的肺炎支原体对药物的敏感性也不同，肺炎支原体诊断加药敏的检测试剂，能保证肺炎支原体病早期诊断及科学用药，使患者得到及时有效治疗。目前国内外对支原体实验诊断技术较多，如特异性抗体检测技术、代谢抑制试验、SouthernBlot、PCR法等。抗体检测技术易出现交叉反应。代谢抑制试验，需加特异性抗体抑制支原体生长，技术较复杂，临床应用不多。SouthernBlot实验技术要求高，不易普遍开展，PCR法容易出现假阳性和假阴性，已被国家卫生部下令禁止用于临床检验。而培养法是根据支原体的生活特性而采用的特异培养基检测支原体的方法。该方法不仅能特异性地诊断支原体感染，还能和药敏板结合，对所感染的支原体进行药敏分析。目前各医院使用的支原体培养基有单一的解脲支原体培养基，单一的人型支原体培养基，和联合型支原体培养基。而且单一支原体培养基已有人申报了中国专利(申请号9611701.0)。联合型支原体培养基也有中国专利(申请号00113758.1)。以上支原体培养基均应用于尿道生殖道的支原体感染的诊断，而用于呼吸道和肺部支原体感染的肺炎支原体检测试剂已有商品问世，但未见专利文献报道。肺炎型支原体药敏检测试剂至今未见相关商品及专利文献报道。
发明内容本发明的目的在于提供一种肺炎型支原体药敏快速检测试剂及制备方法，该试剂能特异性地检出肺炎支原体的同时检测所感染的肺炎支原体对哪种常用药敏感，主要用于小儿科和呼吸科的呼吸道和肺部支原体感染的诊断及指导临床用药治疗，为肺炎支原体感染性疾病的及早诊断及有效治疗提供保证。为达到以上目的，本发明是采取如下技术方案予以实现的—种肺炎型支原体药敏快速检测试剂，包括肺炎支原体培养基和药敏板，其特征在于，所述肺炎支原体培养基按质量百分比包括下述组分基础培养基7090%;小牛血清1030%;酵母粉O.52.5%;葡萄糖O.10.5%;上述肺炎支原体培养基中还包括外加0.080.2ppm的酚红、1020万单位/100ml的青霉素；其中基础培养基按质量百分比包括下述组分4母液9699%氯化钠0.30.7%磷酸二氢钾0.10.3%蛋白胨0.33%其中母液为牛肉浸出液与猪胃或肺消化液按质量比4:66:4的混合溶液；所述药敏板是一块24孔培养板，标有112号，每号标有A、B两孔，其中111号孔分别包被有11种常规治疗支原体药物，这些药物从以下7大类药物中筛选出13内酰胺类、大环内酯类、氨基糖甙类、四环素类、林可霉素类、吕霉素类、喹诺酮类；每个号的A、B两孔分别包被同一种药的低、高两种不同浓度的药液，高浓度药液均为一次成人药量溶解到15ml缓冲液中，低浓度药液为高浓度药液再稀释1525倍，第12孔不包被药物，留作对照。—种上述肺炎型支原体药敏快速检测试剂的制备方法，包括下述步骤—、肺炎支原体培养基的制备(1)分别提取新鲜牛肉浸出液、猪胃或肺消化液，按质量比4:66:4的比例，将牛肉浸出液与猪胃或肺消化液的混合制得培养基母液；(2)将以上培养基母液与下列物质按质量百分比搅拌混合母液9699%氯化钠0.30.7%磷酸二氢钾0.10.3%蛋白胨0.33%待氯化钠、磷酸二氢钾和蛋白胨完全溶解后，煮沸过滤，取滤液，即制得基础培养液；(3)将基础培养基与下列物质按质量百分比搅拌混合均匀，基础培养基7090%小牛血清1030%酵母粉0.52.5%葡萄糖0.10.5%外加酚红0.080.2ppm，青霉素1020万单位/100ml，调节pH值为6.08.0，即制得肺炎支原体培养基。二、药敏板的制备(1)将24孔培养板每两孔标一个孔号，孔号从1标至12，每号的两孔分别记为A、B孔，经粗洗、精洗、4(TC恒温烤干备用；(2)从以下7大类药物P内酰胺类、大环内酯类、氨基糖甙类、四环素类、林可霉素类、吕霉素类、喹诺酮类中筛选出11种常规治疗支原体药物；(3)每种药按成人每次药量溶解到15ml缓冲液中，待药完全溶解后，离心提取上清，再配成两种浓度高浓度药液为一次成人药量15ml，低浓度药液为高浓度药液再稀释1525倍，(4)用加样器分别吸取各药物的低、高浓度药液，分加到药敏板1-11号各自的A、B两孔内，静置30分钟后，吸出弃去。上述方案中，所述111号孔分别包被11种药物及A、B两孔低、高浓度药液的浓度如下表所示药物名称低浓度药液(mg/ml)高浓度药液(mg/ml)盐酸多西环素0.6—-1.09.0'12.0四环素1.6—-2.016.0'30.0克拉霉素0.4--0.86.25'14.0交沙霉素0.3--0.64.0'8.0盐酸米诺环素0.3--0.64.0'8.0阿奇霉素1.4--1.814.0'28.0司帕沙星0.8--1.29.0'17.0红霉素1.4--1.816.0'28.0盐酸洛美沙星1.0--3.017.0'35.0氯氟沙星1.0--3.017.0'35.0盐酸左氧氟沙星0.8—-1.412.0'20.0。本发明的优点是性能稳定，判断标准直观，特异性强，不需特殊设备，24小时可报结果。本试剂已在两家医院进行临床试验，观察200多例病例，得到较好结果，同步盲法批内批间反应结果的符合率达100%，说明试剂性能稳定。按药敏反应结果指导临床用药，显效和有效率达98%以上。说明该试剂对临床用药有直接指导作用，为肺炎型支原体感染型疾病的早期诊断及有效治疗提供了保证。具体实施例方式以下结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。—种肺炎型支原体药敏快速检测试剂，包括肺炎支原体培养基和药敏板，肺炎支原体培养基包括下述组分基础培养基、小牛血清、酵母粉、葡萄糖。外加微量酚红和青霉素。具体实施例参见表l。表l肺炎支原体培养基组成质量百分比％<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>表1中，基础培养基包括下述组分母液、氯化钠、磷酸二氢钾、蛋白胨。具体实施例(代号为基1基4)参见表2。表2基础培养基组成质量百分比％<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>表2中母液(代号为母1母4)为牛肉浸出液与猪胃或肺消化液按质量比4:66:4的混合溶液。具体如表3所示。表3母液组成质量百分比％<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>本发明的肺炎型支原体药敏快速检测试剂的药敏板是24孔培养板，标有112号，每号标有A、B两孔，共24孔。其中111号孔分别包被有11种药，每个号的A、B两孔分别包被同一种药的不同浓度药液量。第12号A、B两孔不包被药物，留作对照。各孔所包被的药物从以下7大类药物中筛选出，S卩13内酰胺类、大环内酯类、氨基糖甙类、四环素类、林可霉素类、吕霉素类、喹诺酮类，如何筛选根据当时市场流通情况而定。本发明药敏板具体实施例如表4所示。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>2.基础培养基的制备。分别用以上培养基母液，按表2组成配制代号为基1基4基础培养基每一种基础培养基都是将固体化学物质氯化钠、磷酸二氢钾和蛋白胨加入母液中，完全溶解后，煮沸过滤，取滤液即得。3.肺炎支原体检培养基的制备。分别用以上四种基础培养基按表1组成搅拌混合均匀，即制成实施例14的肺炎支原体检测用培养基。其中调控肺炎支原体检测用培养基的pH值为6.08.0。二、药敏板的制备〈一>药敏板处理1.从有资质单位购进24孔培养板。2.将24孔培养板每两孔标一个孔号，孔号从1标至12，每号的两孔分别记为A、B孔，然后粗洗、精洗、4(TC恒温烤干，备用。〈二>药液制备1.从有资质单位购进有药准字文号的11种常规治疗支原体药物。2.缓冲液制备取氯化钠3.55.5g，磷化二氢钾15g溶解到1000ml蒸馏水中，调pH值为68。3.每种药按成人每次药量(表4所示各药B孔高浓度药液的浓度范围)溶解到15ml缓冲液中，待药完全溶解后，离心提取上清，再配成两种浓度药液。高浓度药液的浓度均为一次成人药量，低浓度药液的浓度为高浓度药液再稀释1525倍。药物种类及每种药物的两种浓度如表4所示。〈三〉药敏板包被用加样器分别吸取各种药的不同浓度药液，加到药敏板1-11号的A、B孔内静置30分钟后，吸出弃去。药敏板各孔所包被药物各称及浓度如表4所示。将以上制备完成的肺炎型支原体培养基分装后和药敏板组合即成肺炎型支原体药敏检测试剂。它是一种用液体培养基培养方法对肺炎支原体感染进行诊断和药敏分析的试剂。该试剂有利于肺炎型支原体生长。并含有为肺炎型支原体分解利用为能源的葡萄糖，葡萄糖分解时产生H+，使培养基变酸性，并使培养基的酚红指示剂从红色变成黄色因而被检出。培养基被接种标本后，分别加到药敏板各孔进行培养，如果对照孔(第12号孔)呈阳性反应，说明标本为肺炎支原体阳性，此时可对药敏进行分析。如果某种药物低浓度、高浓度均能抑制肺炎型支原体生长，相应药敏板的A、B两孔培养基均呈阴性反应，说明肺炎型支原体对该药高度敏感。如果某种药高浓度能抑制肺炎支原体生长，但低浓不能，药敏板上与该药对应的A孔呈阳性反应B孔呈阴性反应，说明肺炎型支原体对该药中度敏感。如果某种药高浓度、低浓度均不能抑制肺炎型支原体生长，药敏板上与该药对应的A、B两孔均呈阳性反应，说明肺炎型支原体对该药产生耐药。权利要求一种肺炎型支原体药敏快速检测试剂，包括肺炎支原体培养基和药敏板，其特征在于，所述肺炎支原体培养基按质量百分比包括下述组分基础培养基70～90％；小牛血清10～30％；酵母粉0.5～2.5％；葡萄糖0.1～0.5％；上述肺炎支原体培养基中还包括外加0.08～0.2ppm的酚红、10～20万单位/100ml的青霉素；上述肺炎支原体培养基中，基础培养基按质量百分比包括下述组分母液96～99％氯化钠0.3～0.7％磷酸二氢钾0.1～0.3％蛋白胨0.3～3％其中母液为牛肉浸出液与猪胃或肺消化液按质量比4∶6～6∶4的混合的混合溶液；所述药敏板是一块24孔培养板，标有1～12号，每号标有A、B两孔，其中1～11号孔分别包被有11种常规治疗支原体药物，这些药物从以下7大类药物中筛选出β内酰胺类、大环内酯类、氨基糖甙类、四环素类、林可霉素类、吕霉素类、喹诺酮类；每个号的A、B两孔分别包被同一种药的低、高两种不同浓度的药液，高浓度药液均为一次成人药量溶解到1～5ml缓冲液中，低浓度药液为高浓度药液再稀释15～25倍，第12孔不包被药物，留作对照。2.如权利要求1所述的肺炎型支原体药敏快速检测试剂，其特征在于，所述111号孔分别包被11种药物及A、B两孔低、高浓度药液的浓度如下表所示药物名称盐酸多西环素四环素交沙霉素盐酸米诺环素司帕沙星盐酸洛美沙星盐酸左氧氟沙星低浓度药液(mg/ml)0.61.01.62.016.00.40.86.250.30.64.0-0.30.64.0-1.41.814.00.81.29.01.41.816.01.03.017.01.03.017.00.81.412.0高浓度药液(mg/ml)9.012.0-30.0-14.08.08.0-28.017.0-28.0-35.0-35.0-20.0。3.—种权利要求1所述肺炎型支原体药敏快速检测试剂的制备方法，包括下述步骤一、肺炎支原体培养基的制备(i)分别提取新鲜牛肉浸出液、猪胃或肺消化液，按质量比4:66:4的比例，将牛肉浸出液与猪胃或肺消化液的混合制得培养基母液；(2)将以上培养基母液与下列物质按质量百分比搅拌混合母液9699%氯化钠0.30.7%磷酸二氢钾0.10.3%蛋白胨0.33%待氯化钠、磷酸二氢钾和蛋白胨完全溶解后，煮沸过滤，取滤液，即制得基础培养液；(3)将基础培养基与下列物质按质量百分比搅拌混合均匀，基础培养基7090%小牛血清1030%酵母粉0.52.5%葡萄糖0.10.5%外加酚红0.080.2ppm，青霉素1020万单位/100ml，调节pH值为6.08.0，即制得肺炎支原体培养基；二、药敏板的制备(1)将24孔培养板每两孔标一个孔号，孔号从1标至12，每号的两孔分别记为A、B孔，经粗洗、精洗、4(TC恒温烤干备用；(2)从以下7大类药物13内酰胺类、大环内酯类、氨基糖甙类、四环素类、林可霉素类、吕霉素类、喹诺酮类中筛选出11种常规治疗支原体药物；(3)每种药按成人每次药量溶解到l5ml缓冲液中，待药完全溶解后，离心提取上清，再配成两种浓度高浓度药液为一次成人药量15ml，低浓度药液为高浓度药液再稀释1525倍；(4)用加样器分别吸取各药物的低、高浓度药液，分加到药敏板1-11号各自的A、B两孔内，静置30分钟后，吸出弃去。4.如权利要求3所述肺炎型支原体药敏快速检测试剂的制备方法，其特征在于，所述111号孔分别包被11种药物及A、B两孔低、高浓度药液的浓度如下表所示药物名称低浓度药液(mg/ml)高浓度药液(mg/ml)盐酸多西环素0.6—-1.09.0'12.0四环素1.6—-2.016.0'30.0克拉霉素0.4--0.86.25'14.0交沙霉素0.3--0.64.0'8.0盐酸米诺环素0.3--0.64.0'8.0阿奇霉素1.4--1.814.0'28.0司帕沙星0.8--1.29.0'17.0红霉素1.4--1.816.0'28.0盐酸洛美沙星1.0--3.017.0'35.0氯氟沙星1.0--3.017.0'35.0盐酸左氧氟沙星0.8-一1.412.0'20.0。全文摘要本发明公开了一种肺炎型支原体药敏快速检测试剂及制备方法，由肺炎型支原体培养基和药敏板两部分组成。肺炎型支原体培养基由新鲜牛血清、新鲜酵母液、葡萄糖、酚红和抑菌剂组成。通过控制培养液中pH值、葡萄糖及酚红的浓度，提高试剂反应速度。药敏板是24孔培养板，标有1～12号，每个号标有A、B两孔，共24孔。1～11号分别包被11种药物，每个号的A、B两孔分别包被同一种药的高、低浓度药液。本发明性能稳定，判断标准直观、反应快，24小时可报结果。不仅能快速检出肺炎支原体，而且能检出所感染肺炎支原体对哪种药物敏感，对用药治疗有直接指导作用。为肺炎支原体感染病的快速诊断有效治疗提供保证。文档编号C12Q1/18GK101748187SQ20091025457公开日2010年6月23日申请日期2009年12月29日优先权日2009年12月29日发明者黄威权,黄新凤申请人:黄威权