专利名称：一种应用淀粉生产乙醇的方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及一种将糖化酶、a淀粉酶和异淀粉酶重组于酿酒 酵母基因组，然后利用酿酒酵母基因组，直接利用淀粉为原料生产乙醇的方法。
背景技术：
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是最常应用的酒精生产菌，但是酿酒酵母 缺乏水解淀粉的酶类(a _淀粉酶和糖化酶)，不能直接利用淀粉；天然的淀粉质原料中，支 链淀粉的含量约占70% 95%。支链淀粉难于糖化，而异淀粉酶(亦称a-l，6-葡萄糖苷 酶，支链淀粉酶)能够水解支链淀粉分支点的a-l，6-葡萄糖苷键，催化支链淀粉、糖原及 某些分支糊精中的a-l，6糖苷键的断裂反应，而酿酒酵母也不能产生异淀粉酶。目前应用 淀粉生产乙醇是在应用酵母发酵淀粉之前或者在发酵过程中添加a -淀粉酶、糖化酶和异 淀粉酶，但是这些酶(a-淀粉酶、糖化酶和异淀粉酶)的生产需要人力、物力和耗能，导致 利用淀粉生产乙醇的生产成本过高，影响利用淀粉生产乙醇产业的发展。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的不足而提供一种应用淀粉生产乙醇的方法，为应
用淀粉生产乙醇提供一种用酿酒酵母工程菌同步转化支链淀粉为直链淀粉以及同步糖化
淀粉生产乙醇的方法。 本发明所采用的技术方案 —种应用淀粉生产乙醇的方法，其步骤如下 1、从大麦基因组中扩增a淀粉酶基因，从黑曲霉菌基因组中扩增糖化酶基因，从 解淀粉假单胞杆菌基因组中扩增异淀粉酶基因； 2、构建由酿酒酵母的磷酸甘油酸盐激酶基因启动子(pPGK)分别调控a淀粉酶基
因和糖化酶基因的酿酒酵母表达载体，构建由酿酒酵母的交配信息素启动子(pMF-a)调
控异淀粉酶基因的酿酒酵母表达载体，并将表达载体转化为酿酒酵母基因组(重组子)； 3、用PCR方法扩增目标基因验证重组子分别合成a淀粉酶、糖化酶和异淀粉酶
的基因特异引物，分别以重组子和没有转化这些基因的酿酒酵母(宿主菌)基因组DNA为
模板，进行PCR扩增；根据宿主菌没有扩增出目标大小的PCR扩增带而重组子能扩增出目标
大小的PCR扩增带证明所测的目标基因是已经重组于重组子的基因组； 4、用测定表达产物各种酶的活性的方法筛选出每种酶活力大于1. 2 ii /ml发酵液
的重组子为工程菌； 5、将淀粉蒸煮使糊化。 6、以糊化的淀粉为原料，应用所构建并筛选出的酿酒酵母工程菌于28-3(TC进行 发酵生产乙醇。 本发明采用了直接同步剪切淀粉支链和糖化淀粉的方式生产乙醇，省略了需要生 产成本较高的系列酶(异淀粉酶、a-淀粉酶和糖化酶)的生产过程，能够在较大的程度上
3降低利用淀粉生产乙醇的成本，为利用淀粉生产乙醇产业的发展提供可靠保证。
具体实施例方式
下面才用非限定性实施例对本发明作进一步说明。
实施例一 1.从大麦基因组中扩增a淀粉酶基因，从黑曲霉菌基因组中扩增糖化酶基因，从 解淀粉假单胞杆菌基因组中扩增异淀粉酶基因。 2.构建由酿酒酵母的磷酸甘油酸盐激酶基因启动子(pPGK)分别调控a淀粉酶基 因和糖化酶基因，由酿酒酵母的交配信息素启动子(pMF-a)调控异淀粉酶基因的酿酒酵 母表达载体。并将表达载体转化酿酒酵母基因组(重组子)； 3.用PCR方法扩增目标基因验证重组子合成a淀粉酶、糖化酶和异淀粉酶的基 因特异引物，分别以重组子和没有转化这些基因的酿酒酵母(宿主菌)基因组DNA为模板， 进行PCR扩增；根据宿主菌没有扩增出目标大小的PCR扩增带而重组子能扩增出目标大小 的PCR扩增带证明所测的目标基因是已经重组于重组子的基因组； 4、用测定表达产物各种酶的活性的方法筛选出每种酶活力> 1. 2ii /ml发酵液的
重组子为工程菌； 5.将淀粉蒸煮使糊化。 6.以糊化的淀粉为原料，应用所构建并筛选出的酿酒酵母工程菌于2『C进行发
酵生产乙醇。 实施例二 1.从大麦基因组中扩增a淀粉酶基因，从黑曲霉菌基因组中扩增糖化酶基因，从 解淀粉假单胞杆菌基因组中扩增异淀粉酶基因。 2.构建由酿酒酵母的磷酸甘油酸盐激酶基因启动子(pPGK)分别调控a淀粉酶基 因和糖化酶基因，由酿酒酵母的交配信息素启动子(pMF-a)调控异淀粉酶基因的酿酒酵 母表达载体。并将表达载体转化酿酒酵母基因组(重组子)； 3.用PCR方法扩增目标基因验证重组子合成a淀粉酶、糖化酶和异淀粉酶的基 因特异引物，分别以重组子和没有转化这些基因的酿酒酵母(宿主菌)基因组DNA为模板， 进行PCR扩增；根据宿主菌没有扩增出目标大小的PCR扩增带而重组子能扩增出目标大小 的PCR扩增带证明所测的目标基因是已经重组于重组子的基因组； 4、用测定表达产物各种酶的活性的方法筛选出每种酶活力> 1. 2ii /ml发酵液的
重组子为工程菌； 5.将淀粉蒸煮使糊化。 6.以糊化的淀粉为原料，应用应用所构建并筛选出的酿酒酵母工程菌于3(TC进 行发酵生产乙醇。
权利要求
一种应用淀粉生产乙醇的方法，其特征在于，其步骤如下1)、从大麦基因组中扩增α淀粉酶基因，从黑曲霉菌基因组中扩增糖化酶基因，从解淀粉假单胞杆菌基因组中扩增异淀粉酶基因；2)、构建由酿酒酵母的磷酸甘油酸盐激酶基因启动子分别调控α淀粉酶基因和糖化酶基因的酿酒酵母表达载体，构建由酿酒酵母的交配信息素启动子调控异淀粉酶基因的酿酒酵母表达载体，并将表达载体转化为酿酒酵母基因组；3)、用PCR方法扩增目标基因验证重组子分别合成α淀粉酶、糖化酶和异淀粉酶的基因特异引物，分别以重组子和没有转化这些基因的酿酒酵母基因组DNA为模板，进行PCR扩增；根据宿主菌没有扩增出目标大小的PCR扩增带而重组子能扩增出目标大小的PCR扩增带证明所测的目标基因是已经重组于重组子的基因组；4)、用测定表达产物各种酶的活性的方法筛选出每种酶活力大于1.2μ/ml发酵液的重组子为工程菌；5)、将淀粉蒸煮使糊化；6)、以糊化的淀粉为原料，应用所构建并筛选出的酿酒酵母工程菌于28-30℃进行发酵生产乙醇。
全文摘要
本发明公开了一种应用淀粉生产乙醇的方法，属于生物技术领域，首先从大麦基因组中扩增α淀粉酶基因，从黑曲霉菌基因组中扩增糖化酶基因，从解淀粉假单胞杆菌基因组中扩增异淀粉酶基因；利用α淀粉酶基因、糖化酶基因和异淀粉酶基因构建成酿酒酵母工程菌；将淀粉蒸煮使糊化后，以糊化的淀粉为原料，应用所构建并筛选出的酿酒酵母工程菌于28-30℃进行发酵生产乙醇。本发明采用了构建酿酒酵母工程菌而同步剪切淀粉支链，以及同步糖化淀粉生产乙醇的方法，省略了需要生产成本高的系列酶的生产，能够较大程度地降低利用淀粉生产乙醇的成本，解决应用淀粉生产乙醇的高成本问题，有利于促进应用淀粉生产乙醇产业的发展。
文档编号C12R1/865GK101717795SQ20091025389
公开日2010年6月2日 申请日期2009年11月30日 优先权日2009年11月30日
发明者刘振旺, 张泽华, 张添元, 张爱联, 易小平, 罗进贤, 谭燕华 申请人:中国热带农业科学院热带生物技术研究所