一种支原体培养鉴定及药敏检测板及对C⁺孔结果进行真伪鉴别的方法

专利名称：一种支原体培养鉴定及药敏检测板及对C⁺孔结果进行真伪鉴别的方法
技术领域：
本发明所涉及的是临床医学检验和体外诊断技术领域。具体的是ー种药敏试验板，本药敏试验板是在普通药敏试验板的基础上，增设了鉴别区，增加额外的鉴别试验，可在进行支原体药敏试验的同时，对C+孔结果进行真伪鉴别。具体鉴别方法是通过在支原体药敏试验板的基础上增加了培养结果性质的鉴别区，鉴别区内包被有非抗支原体类微生物的广谱抗生素药物，对阳性对照孔(C+孔)内容易导致假阳性、假阴性的杂菌进行抑制生长或者直接灭活，从而达到对培养结果的鉴别效果，具体包被的药物可以为β-内酰胺类药物、磺胺类药物、利福霉素类、万古霉素和抗真菌类等药物中的ー种或几种。
背景技术：
支原体(mycoplasma)是ー类缺乏细胞壁的原核细胞型微生物,是ー种不同与细 菌和真菌的另ー类微小病原体，大小一般在O. 3 O. 5um之间，是细胞外生存的最小微生物。从人体分离的16种支原体中，主要有5种对人有致病性，即肺炎支原体(M. pneumoniae,Mp)、解脲支原体(Ureaplasma urealyticum, Uu)、人型支原体(M. homins, Mh)、生埴支原体(M. genitalium,Mg)、穿透支原体(M. penetrans,Mpe)及发酵支原体(M. fermentans,Mf)。其中肺炎支原体(MP)是社区获得性肺炎的主要病原体，由它引起的肺炎称为肺炎支原体肺炎，其感染分布于全世界。人类对MP普遍易感，尤其是儿童组为发病高峰。解脲脲原体(UU)、人型支原体(MH)和生殖支原体(MG)等是性传播疾病的主要病原体，可引起非淋菌性尿道炎、男性前列腺炎、附睾炎、女性阴道炎、盆腔炎、宫颈炎等泌尿生殖道感染性疾病，是男女不孕、不育的主要病因。临床上，病原微生物的分离培养鉴定是感染性疾病确诊的“金标准”，但由于经典的液固双相培养法对支原体的培养检测繁琐、耗时长(长达7 30天)，无法适用于临床。近年单纯的液体培养基培养法大大地缩短了培养时间，使支原体的分离培养鉴定和药敏试验成为了可能，但是假阳性与假阴性的问题限制了支原体液体分离培养基和支原体药敏培养法在临床上的应用。支原体液体分离培养基对支原体培养鉴定的原理是通过支原体在液体培养基中生长代谢而产酸或产碱，进而使培养基中的指示剂变色，从而判断是否有支原体的生长。而支原体药敏培养法是在支原体液体分离培养基培养支原体的基础上，増加支原体对相关药物的敏感性测试。也就是说，支原体的液体分离培养基和药敏培养法，其最根本的原理是微生物的代谢产物使培养液的酸碱度(pH值)发生改变，并使其中的指示剂变色。可是代谢产物使培养液的酸碱度(pH值)发生改变，并使其中的指示剂变色，却不是支原体独有的特性。某些杂菌(如葡萄球菌、白色念珠菌等)在生长代谢过程中，也可能产酸或产碱，也能使指示剂变色。因此，通过颜色变化进行结果判断的支原体液体分离培养法和药敏培养法，虽然可通过指示剂变色来提示可能有支原体的生长，但有比较高的假阳性率；而市场上的某些品种，为了排除假阳性，设计为液体混浊为排除条件。这又使某些有支原体生长，尤其是某些合并有支原体生长者，被人为否定，造成假阴性。因此假阳性和假阴性问题，是干扰支原体液体分离培养基和支原体药敏培养法的结果判断的最主要因素，也是限制其在临床上应用的主要原因。本发明是在普通药敏试验板的基础上，增设鉴别区，增加额外的药敏鉴别试验，从而可以在进行支原体药敏培养的同时，对C+孔结果进行真伪鉴别。由于支原体是ー类缺乏细胞壁的原核细胞型微生物，没有细胞壁，因此对作用于细菌细胞壁的抗生素(如β_内酰胺类药物、万古霉素)完全不敏感，对多粘霉素、利福霉素类、磺胺类药物普遍耐药；而大多数产酸或产碱的细菌(如葡萄球菌等)对这几类药物，却具有较高的敏感性。因此可以用这几类药物进行额外的药敏鉴别试验，排除大多数产酸或产碱细菌所造成的假阳性与假阴性干扰。而抗真菌类药物，例如唑类或烷基胺类药物药物，主要通过抑制真菌细胞色素酶P450 (CYP) 14 α -脱甲基化酶，或抑制鲨烯环氧化酶，从而导致麦角烯醇耗竭，使真菌细胞膜 破裂和死亡，因此对真菌有高敏感性,而对支原体几乎无作用。因此增加抗真菌药物的药敏鉴别试验，可以排除真菌(尤其是白色念珠菌)所造成的假阳性与假阴性干扰。即在进行支原体药敏培养的同吋，增加对β-内酰胺类、磺胺类、利福霉素类、万古霉素和抗真菌类药物ー种或几种药物的额外的药敏试验，可对假阳性与假阴性的干扰进行鉴别。只有当支原体液体培养试验(C+孔)，与β-内酰胺类、磺胺类、利福霉素类、万古霉素和抗真菌类药物的药敏试验，均为阳性时，才为真性阳性。

发明内容
普通药敏试验板一般只有控制区、药敏试验区或加有培养基存放区2 3部分组成，本药敏试验板在此基础上，增设鉴别区。因此本药敏试验板有培养基存放区(I)、控制区(2)、鉴别区(3)和药敏试验区⑷四个区域組成。鉴别区(3)可设计为一组小孔(2 5孔)，孔内包被有C+孔鉴别试验所需的药物，通常为对支原体不敏感，而对细菌、真菌敏感的药物，如β -内酰胺类药物、磺胺类药物、利福霉素类、万古霉素和抗真菌类等药物中的ー种或几种。在进行支原体药敏试验的同吋，对控制区C+孔的试验结果进行鉴别。若是由其它杂菌(细菌或真菌)产生的干扰，可通过鉴别区的C+孔鉴别试验得以斟别若控制区(2)C+孔变色(阳性反应)，鉴别区(3)也全部变色，则表明真正有支原体感染；若控制区(2) C+孔变色(阳性反应)，而在鉴定区(3)只要一孔不变色(阴性)，则表明是由杂菌(细菌或真菌)产生的假阳性；若控制区(2)C+孔混浊，而在鉴别区(3)全部变色(阳性)，则表明是假阴性；若控制区(2) C+孔混浊，而在鉴别区(3)只要一孔不变色(阴性)，则表明是由杂菌(细菌或真菌)产生的干扰，是真阴性。本药敏试验板其它各部分具体作用是培养基存放区(I)用于存放分离培养支原体的液体培养基(或称试剂)小瓶，通常为ー较大的圆形孔，直径以能放入试剂小瓶为度。控制区(2)通常设计为两组小孔，分别进行阳性C+与阴性C_对照试验。药敏试验区(4)通常设计为2 5组小孔，分别包被有对支原体敏感的药物。具体參见附图。本发明进行支原体药敏检测时，按下述步骤进行
步骤I :取支原体液体培养基，按说明书配制成培养液，并将试剂小瓶存入培养基存放区(I);步骤2 :按规定取上述培养液适量，加入控制区(2)的检测孔C—中；步骤3 :将标本物，按规定投入培养基，按有关说明书操作规范制的含标本的培养液；步骤4 :取上步含标本的培养液10 100 μ L或规定体积，分别加入到控制区(2)的C+孔中和鉴别区(3)与药敏试验区(4)的所有药敏试验板孔中；步骤5 :根据有关说明书的规定，在药敏试验板的每个孔内滴加适量的矿物油、石蜡油或其它合适的物质，放止或減少液体的挥发；步骤6 :将药敏试验板置于35 38°C或规定温度的孵育箱或其它合适的孵器中培养;步骤7 :2 36小时内观察读取結果，检测标准简述如下(或按有关说明书判读)(I)若控制区(2)的C_孔变色，则表明试剂失效，试剂可能已被污染或在试验操作过程被污染，试验无效；(2)若控制区(2)的C+孔和C_孔均不变色，则表明无支原体生长，其余孔不再判读；(3)若控制区(2)的C_孔不变色，而C+孔变色，则继续判读鉴定区(3)a :若鉴别区(3)只要一孔不变色，则表明是其它杂菌产生的假阳性或假阴性，余孔不再判读；b :若鉴别区(3)全部变色，则表明有支原体感染，继续对药敏区(4)进行判读①药物高、中、低浓度孔均不变色，表示支原体对该列对应的药物敏感； ②药物高浓度孔不变色，而低浓度孔或中、低浓度孔均变色，表示支原体对该列对应的药物中等敏感；③药物高、中、低浓度孔均变色，表示支原体对该列对应的药物不敏感；


附图是示意图 实施例培养基存放区(I)为ー较大的圆形孔，直径足以能放入试剂小瓶。控制区(2)为上下两孔，上为C+小孔，下为C-孔。鉴别区(3)为并列两孔，分别包被有阿莫西林(AMO)和氟康唑(FLC)。药敏试验区(4)为两排16孔，分别包被有こ酰螺旋霉素(ACE)、罗红霉素(ROX)、阿奇霉素(AZI)、克林霉素(CLI)、多西环素(DOX)、左氧氟沙星(LEV)、加替沙星(GAT)、帕珠沙星(PAZ)共计八种抗菌素，其中上排为高浓度组，下排为低浓度组。以下结合本公司生产的肺炎支原体快检试剂盒(6小时培养法)，对本药敏检测板的操作方法进行阐述。当取肺炎支原体快检试剂盒(6小时培养法)中试剂，对肺炎支原体进行药敏检测吋，按下述步骤进行步骤I :取肺炎支原体快检试剂I支，存入培养基存放区(I);步骤2 :取上述试剂50 μ L，加入控制区⑵的检测孔C_中；
步骤3 :取咽拭子一枚，必要时用生理盐水湿润，在患者咽部捻转数圈(采集尽量多的分泌物)，取出咽拭子，立即接种，或置于密闭试管内，适时接种。接种时，将咽拭子于试剂瓶内搅动数次，靠瓶壁挤尽残留液,弃去咽拭子,试剂瓶中即为含标本的混合培养液。步骤4 :取上步含标本的混合培养液50 μ L，分别加入到控制区(2)的C+孔中和鉴别区(3)与药敏试验区(4)的所有药敏试验板孔中；步骤5 :在药敏试验板的每个孔内滴加矿物油I滴，放止挥发液体；步骤6 :将药敏试验板置于37 土 1°C孵育箱培养；步骤7 :6 12小时内观察读取結果，检测标准如下(I)若控制区⑵的C_孔变为黄色，则表明试剂失效，试剂可能已被污染或在试验操作过程被污染，试验无效；
(2)若控制区(2)的C+孔和C_孔均不变色，仍为红色或粉红色，则表明无支原体生长，其余孔不再判读；(3)若控制区(2)的C_孔仍为红色，而C+孔变为黄色或混浊，则继续判读鉴定区
(3)a :若鉴别区(3)阿莫西林(AMO)孔不变色，仍为红色或粉红色，则表明是由革兰氏阳性菌引起的假阳性；b :若鉴别区(3)氟康唑(FLC)孔不变色，仍为红色或粉红色，则表明是由真菌(尤其是白色念珠菌)引起的假阳性；c :若鉴别区(3)全部变色，则表明有支原体感染，尤其是当C+孔变为黄色混浊，而阿莫西林(AMO)孔或氟康唑(FLC)孔变为清亮黄色者，可进ー步提示支原体合并有细菌或真菌感染。此时继续对药敏区(4)进行判读①若药物高、低浓度孔均不变色，表示支原体对该列对应的药物敏感；如对于最后一列(帕珠沙星列)高低浓度孔均为红色或粉红色，则表示肺炎支原体对帕珠沙星敏感。②若药物高浓度孔不变色，而低浓度孔变为黄色，表示肺炎支原体对该列对应的药物中等敏感(中介)；③若药物高、低浓度孔均变为黄色，表示肺炎支原体对该列对应的药物不敏感(耐药)。
权利要求
1.本发明涉及的药敏试验板，是在普通药敏试验板的基础上，增设鉴别区，增加额外的鉴别试验，可以在进行支原体药敏培养的同时，对C+孔的结果进行真伪鉴别。
2.权利要求I所述的药敏试验板，其特征在于由培养基存放区(I)、控制区(2)、鉴别区(3)和药敏试验区(4)四区域组成，但培养基存放区(I)可省略。
3.本发明所述的对C+孔的结果进行真伪鉴别的方法，是在药敏试验板的鉴别区(3)内包被对其它细菌或真菌抑制、杀灭作用强，而对支原体作用弱的药物，具体可以为β_内酰胺类药物、磺胺类药物、利福霉素类、万古霉素和抗真菌类等药物中的ー种或几种。
4.权利要求I所述的支原体，主要有肺炎支原体、解脲脲原体、人型支原体和生殖支原体等，但不仅限于此。
5.在权利要求I所述的试验板中，所包被的对C+孔结果进行鉴别的物质为非抗支原体类或弱抗支原体类药物。主要是β_内酰胺类药物、磺胺类药物、利福霉素类、万古霉素和抗真菌类药物,但不仅限于此。
全文摘要
本发明公开了一种支原体药敏试验板，是在普通药敏试验板的基础上，增设鉴别区，可在进行支原体培养及药敏试验的同时，对C+孔的结果进行真伪鉴别。本发明同时还公开了一种对支原体阳性对照孔(C+孔)的结果进行真伪鉴别的方法，是通过在支原体药敏试验板的基础上增加了培养结果性质的鉴别区，鉴别区内包被有非抗支原体类微生物的广谱抗生素药物，对阳性对照孔(C+孔)内容易导致假阳性、假阴性的杂菌进行抑制生长或者直接灭活，从而达到对培养结果的鉴别效果，具体包被的药物可以为β-内酰胺类药物、磺胺类药物、利福霉素类、万古霉素和抗真菌类等药物中的一种或几种。
文档编号C12M1/34GK102676378SQ20111005966
公开日2012年9月19日 申请日期2011年3月14日 优先权日2011年3月14日
发明者岳力群, 杨会宣 申请人:武汉菁华时间科技有限公司