专利名称：鉴定发热伴出疹症候群传染病相关病毒病原体的多重实时定量pcr的引物、探针及检测方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于检测和鉴定发热伴出疹症候群传染 病病毒病原体的引物、探针、试剂盒和检测方法。
背景技术：
发热伴出疹症候群传染病是指发热伴出疹，发热> 37. 5°C，持续一天以上，伴有全 身或局部皮肤或粘膜出疹。其病毒病原体主要包括肠道病毒(Enterovirus，EV)、风疹病毒 (Rubella virus,(Measles virus, MV(Dengue virus, DEV)>/jC 痘带状疱疹病毒(VZV)、人类DNA细小病毒(HPV B19)、肠道病毒71型(EV71 )、柯萨奇病毒 A16 型(Cox A16)等。发热伴出疹症候群一般以症状进行临床诊断。部分轻症和不典型病例则需进行微 生物学检查以求确诊，病毒分离、血清学诊断及病毒核酸检查是其确切的诊断方法。在实际 临床工作中，由于发热伴出疹症候群具有不同的毒力，且均具有一定的传染性。因而发热伴 出疹症候群的快速诊断就成为提高治疗效果和控制病毒扩散的关键。传统的分离培养及血 清学检测方法费时繁琐，导致检测不及时，灵敏度不够，因此迫切需要开发快速正确检测的 新技术以筛查可疑病例、控制疫情蔓延和及时给予对症治疗。分子生物学检测手段的介入， 使这种需要成为了可能。实时荧光定量PCR具有快速检测、减少污染、准确定量、灵敏度高 和特异性强的优点，多重定量PCR则可同时检测多种病毒病原，两者相结合的多重实时定 量 PCR (multiplex real-time quantitative polymerase chain reaction)集合了两者 的优点，更由于减少了酶和荧光染料或探针的使用量，降低了成本。故本研究建立了单管荧 光RT - PCR同时检测4种发热伴出疹症候群病毒病原体，两管即可全部检测以上8种发热 伴出疹症候群病毒病原体，并应用于临床标本的检测。
发明内容
为了克服现有技术缺陷，本发明提供了一种能用于检测和鉴定发热伴出疹症候群 传染病相关病毒病原体的多重实时定量PCR的引物。为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案
一种用于检测和鉴定发热伴出疹症候群传染病相关病毒病原体的多重实时定量PCR 的引物，检测和鉴定的对象包括水痘-带状疱疹病毒、人类小DNA病毒B19、肠道病毒、登革 热病毒、风疹病毒和麻疹病毒，所述肠道病毒包括肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型；
第1组引物用于检测和鉴定肠道病毒的通用引物核苷酸序列，其上游引物如SEQ ID NO 1所示核苷酸序列，其下游引物如SEQ ID NO 2所示核苷酸序列；
第2组引物用于检测和鉴定风疹病毒的通用引物核苷酸序列，其上游引物如SEQ ID NO 4所示核苷酸序列，其下游引物如SEQ ID NO 5所示核苷酸序列；
第3组引物用于检测和鉴定麻疹病毒的通用引物核苷酸序列，其上游引物如SEQ IDNO 7所示核苷酸序列，其下游引物如SEQ ID NO 8所示核苷酸序列；
第4组引物用于检测和鉴定登革病毒的通用引物核苷酸序列，其上游引物如SEQ ID NO 10所示核苷酸序列，其下游引物如SEQ ID NO 11所示核苷酸序列；
第5组引物用于检测和鉴定水痘-带状疱疹病毒的引物核苷酸序列，其上游引物如SEQ ID NO :13所示核苷酸序列，其下游引物如SEQ ID NO :14所示核苷酸序列；
第6组引物用于检测和鉴定人类小DNA病毒B19的引物核苷酸序列，其上游引物如SEQ ID NO: 16所示核苷酸序列，其下游引物如SEQ ID NO :17所示核苷酸序列；
第7组引物用于检测和鉴定肠道病毒中的肠道病毒71型的引物核苷酸序列，其上游引 物如SEQ ID NO 19所示核苷酸序列，其下游引物如SEQ ID NO 20所示核苷酸序列；
第8组引物用于检测和鉴定肠道病毒中的柯萨奇病毒A16型的引物核苷酸序列，其上 游引物如SEQ ID NO :22所示核苷酸序列，其下游引物如SEQ ID NO :23所示核苷酸序列。本发明的第二个目的是提供一种用于检测和鉴定发热伴出疹症候群传染病相关 病毒病原体的多重实时定量PCR的探针，检测和鉴定的对象包括水痘-带状疱疹病毒、人类 小DNA病毒B19、肠道病毒、登革热病毒、风疹病毒和麻疹病毒，所述肠道病毒包括肠道病毒 71型和柯萨奇病毒A16型；
第1组引物用于检测和鉴定肠道病毒的探针核苷酸序列，其特征在于如SEQ ID NO 3 所示核苷酸序列，该序列5’端荧光标记为Cy5，3’端荧光标记为BHQ3。第2组引物用于检测和鉴定风疹病毒的探针核苷酸序列，其特征在于如SEQ ID NO 6所示核苷酸序列，该序列5’端荧光标记为R0X，3’端荧光标记为BHQ2。第3组引物用于检测和鉴定麻疹病毒的探针核苷酸序列，其特征在于如SEQ ID NO 9所示核苷酸序列，该序列5，端荧光标记为HEX，3，端荧光标记为BHQ1。第4组引物用于检测和鉴定登革病毒的探针核苷酸序列，其特征在于如SEQ ID NO 12所示核苷酸序列，该序列5’端荧光标记为FAM，3’端荧光标记为MGB。第5组引物用于检测和鉴定水痘-带状疱疹病毒的探针核苷酸序列，其特征在于 如SEQ ID NO 15所示核苷酸序列，该序列5’端荧光标记为FAM，3’端荧光标记为TAMRA。第6组引物用于检测和鉴定人类小DNA病毒B19的探针核苷酸序列，其特征在于 如SEQ ID NO 18所示核苷酸序列，该序列5，端荧光标记为HEX，3，端荧光标记为BHQ1。第7组引物用于检测和鉴定肠道病毒中的肠道病毒71型的探针核苷酸序列，其特 征在于如SEQ ID NO 21所示核苷酸序列，该序列5’端荧光标记为R0X，3’端荧光标记为 BHQ2。第8组引物用于检测和鉴定肠道病毒中的柯萨奇病毒A16型的探针核苷酸序列， 其特征在于如SEQ ID NO : 所示核苷酸序列，该序列5’端荧光标记为Cy5，3’端荧光标记 为 BHQ3。本发明的第三个目的是提供一种用于检测和鉴定发热伴出疹症候群传染病相关 病毒病原体的多重实时荧光定量PCR检测方法，其使用上述引物和探针进行组合PCR扩增， 其有如下检测组合A组合第1组至第4组引物和探针组合同时使用可一次性检测鉴定出 所述四种病毒的一种或几种；B组合第5组至第10组引物和探针组合同时使用可一次性 检测鉴定出所述四种病毒的一种或几种。用A组合或/和B组合2管实时荧光定量PCR可 检测及鉴定出8种病毒。
采用多重实时荧光定量PCR技术扩增样品的核酸片段，PCR总体系中添加各种引 物浓度为0.2 ymol/1，PCR总体系中添加各种探针量为0. 1 μ mol/Ι ；其他试剂可使用常 规的的实时定量PCR反应混合液，包括Taq酶，逆转录酶，一步法RT-PCR反应缓冲液；PCR运 行条件为逆转录50°C，30min,预变性95°C 5min,变性95°C 15s，退火55°C lmin,回到步 骤3，重复循环45次；在退火步骤内进行单点荧光采集。本发明用2管实时荧光定量PCR可检测及鉴定出8种病毒，如第1组至第4组引 物和探针组合同时使用可一次性检测鉴定出四种病毒的一种或几种，第5组至第10组引物 和探针组合同时使用可一次性检测鉴定出四种病毒的一种或几种。本发明的具体原理是利用一对待测病毒病原体核酸序列的特异性引物和探针，采 用一步法实时荧光定量RT-PCR试剂盒，通过PCR技术实现靶核酸序列片段的扩增。所使用 的探针为两端分别标记荧光报告基团和荧光淬灭基团的寡核苷酸。当探针完整时，报告基 团发出的荧光被淬灭基团吸收，在PCR扩增过程中，DNA聚合酶的5’端外切酶活性将特异 结合在靶核苷酸片段上的荧光探针酶切降解，使报告基团的荧光信号可以被检测，荧光信 号量的变化与扩增产物量成正比，从而可以通过荧光强弱来判断待测样本中靶核苷酸序列 的存在。本发明将多重PCR与Tagman荧光探针技术结合起来，即在一次检测过程中，可对 多种可能引发的病原体进行同时检测，达到快速诊断、指导治疗的目的，从而克服常规PCR 的局限性解决了临床上的检测通量的瓶颈问题，缩短了工作时间，较少了原料耗损，并且具 有敏感性、特异性更强，有效解决了 PCR污染等问题，自动化程度更高等特点。荧光探针定 量PCR检测技术巧妙的利用了 PCR技术DNA高效扩增、探针技术高特异性和光谱技术的敏 感性及定量分析的优点。同时克服了传统PCR技术易污染、假阳性率高且不能定量的缺点， 称为目前最先进的检测技术。本发明的优点如下
1.检测速递快，效率高，可根据需要，随机两重、三重或多重组合同时检测多种致病病 原体，也可以检测单个病原体。2.灵敏度高，可检测到病毒的最小浓度为10-llpM，高于经典的病原分离法的敏 感性
3.特异性强，由于扩增过程中的引物和检测过程中探针双重作用，再次保证了病原体 检测的特异性
4.操作简单，结果稳定，整个过程只需要
5.适用于早期诊断，适用于不明原因发热引起的重大传染疾病的早期快速检测，多种 病原体的随机组合检测以及大量样品的检测。6.适用范围广，取样简单。样品中DNA、肝素、EDTA、柠檬酸盐、血红蛋白、白蛋白 和脂质等的污染将不会对结果造成影响，因而适用于各种待测样品如咽喉拭子、血液等。
图1利用A组合引物和探针进行Real-timePCR检测肠道病毒的荧光扩增曲线 图，Ct值为9. 35 ；以及阴性对照组扩增曲线图。图2利用A组合引物和探针进行Real-timePCR检测风疹病毒的荧光扩增曲线图，Ct值为16. 65 ；以及阴性对照组扩增曲线图。图3利用A组合引物和探针进行Real-time PCR检测麻疹病毒的荧光扩增曲线 图，Ct值为21. 18 ；以及阴性对照组扩增曲线图。图4利用A组合引物和探针进行Real-time PCR检测登革病毒的荧光扩增曲线 图，Ct值为18. 96 ；以及阴性对照组扩增曲线图。图5利用B组合引物和探针进行Real-time PCR检测水痘-带状疱疹病毒的荧 光扩增曲线图，Ct值为10.21 ；以及阴性对照组扩增曲线图。图6利用B组合引物和探针进行Real-time PCR检测人类小DNA病毒B19的荧光 扩增曲线图，Ct值为13.31 ；以及阴性对照组扩增曲线图。图7利用B组合引物和探针进行Real-time PCR检测肠道病毒中的肠道病毒71 型的荧光扩增曲线图，Ct值为8. 96 ；以及阴性对照组扩增曲线图。图8利用B组合引物和探针进行Real-time PCR检测肠道病毒中的柯萨奇病毒 A16型的荧光扩增曲线图，Ct值为10. 99 ；以及阴性对照组扩增曲线图。
具体实施例方式为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这 些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。本领域的技术人员可以对其进行各种改造和修改，这些等价形式同样落入本发明 的保护范围。下面实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商 所建议的条件。实施例1 引物和探针的设计
通过分别对所有已知的病毒的基因序列进行比对分析，选择高度保守的区段，设计多 对引物和探针，引物长度一般为20碱基左右。最优引物探针序列组合如下
分析上述病毒特异性基因的信息，经序列分析软件DNASTAR进行引物间/内二聚体的 排除，并经BLAST验证引物的特异性与相近病原体的同源性，设计出针对上述病原体检测 的引物和探针。
实施例2 =PCR反应体系的构建与优化 1.标本中总核酸的提取
各毒株由本实验室所保存提供。同时，对肠道病毒、风疹病毒、麻疹病毒、登革病毒、水 痘带状疱疹病毒、人类DNA细小病毒、肠道病毒71型、柯萨奇病毒A16型病毒进行病毒效价 滴定(TCID5cZml) ,TCID5tl即是组织细胞培养半数感染剂量，各组病毒株均去1 TCID5(1/ml的
病毒量。利用灭活的病毒作为待测样品，采用QIAGen RNeasy Mini Kit (Qiagen, Chatsworth, CA ,catalog #74104)试剂盒抽提核酸。操作按照说明书进行。提取过程及
主要参数
(1)第一次使用此试剂盒时，在AWl和AW2缓冲液中按照试剂瓶上提示体积加入100% 乙醇，19 ml Affl中加入25 ml无水乙醇，13 ml Affl中加30 ml无水乙醇；在AL中加入观μ g/ml carrier RNA0(2)取 25 μ 1 Qiagen Protease 放入 1. 5 ml 离心管中。(3)在生物安全柜内从标本中取出200 μ 1加入此管中，充分混勻。(4)在每管分别加入200 μ 1 AL (内需要提前加入沘μ g/ml carrier RNA)，充 分混勻振荡15 s。56 °C孵育15 min。短暂离心，将管盖上的液体离到管底。(5)加入250 μ 1无水乙醇，充分混勻振荡15 s，室温(15 25°C )裂解5 min。短 暂离心，将管盖上的液体离到管底。(6)将上述裂解液加入QIAamp MinElute离心柱上，8000 rpm，室温离心1 min， 弃收集管中的离心液。滤柱仍放回收集管上，将步骤③剩余的混合液全部吸入滤柱中，离心 后弃离心液。(7)于滤柱中加入 500 μ 1 AWl 液，12000 rpm, 8000 rpm，室温离心 1 min，弃收
集管中的离心液。(8)从试剂盒中取一支干净的2 ml收集管，将离心后的滤柱移到新的收集管上， 于滤柱中加入500 μ 1 AW2液，8000 rpm，室温离心1 min。将滤柱移到一个干净的收集管 中，加入500 μ 1无水乙醇，8000 rpm，室温离心1 min。(9)将滤柱移到一个干净的收集管中，14 000 rpm，室温离心3 min。将滤柱放室 温精置3 min以干燥滤膜。(10)将滤柱放在1.5 ml Eppendorf管上，向滤柱中加入100 μ 1的AVE或 RNase-free Water，室温静置1 min。14 000 rpm室温离心1 min，收集离心液即为提取的 核酸。可立即用于检测或-70 °C保存。2、RNA纯度和浓度检测
取2 μ RNA溶液，以核酸蛋白定量仪(NanoDrop 1000, Thermo)分别测定并计算出 其洸0 nm和沘0 nm波长的吸光度值A260与A280的比值及RNA浓度，1. 8彡A260/A280 (2. 0表明纯度符合要求。各组RNA所测得的浓度和纯度均符合要求。3、Real-time RT—PCR 反应体系
(1)待测组探针法Real-time PCR反应体系在原试剂盒(QIAGEN One step RT-PCR Kit，Qiagen, Chatsworth, CA，catalog #210212)说明书要求的基础上作适当的修改，如 表1。阴性对照组探针法Real-time PCR反应体系如表2。表 权利要求
1.一种鉴定发热伴出疹症候群传染病相关病毒病原体的多重实时荧光定量PCR引物， 其特征在于，鉴定的对象包括水痘-带状疱疹病毒、人类小DNA病毒B19、肠道病毒、登革热 病毒、风疹病毒和麻疹病毒，所述肠道病毒包括肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型；第1组引物用于检测和鉴定肠道病毒的通用引物核苷酸序列，其上游引物如SEQ ID NO 1所示核苷酸序列，其下游引物如SEQ ID NO 2所示核苷酸序列；第2组引物用于检测和鉴定风疹病毒的通用引物核苷酸序列，其上游引物如SEQ ID NO 4所示核苷酸序列，其下游引物如SEQ ID NO 5所示核苷酸序列；第3组引物用于检测和鉴定麻疹病毒的通用引物核苷酸序列，其上游引物如SEQ ID NO 7所示核苷酸序列，其下游引物如SEQ ID NO 8所示核苷酸序列；第4组引物用于检测和鉴定登革病毒的通用引物核苷酸序列，其上游引物如SEQ ID NO 10所示核苷酸序列，其下游引物如SEQ ID NO 11所示核苷酸序列；第5组引物用于检测和鉴定水痘-带状疱疹病毒的引物核苷酸序列，其上游引物如SEQ ID NO 13所示核苷酸序列，其下游引物如SEQ ID NO 14所示核苷酸序列；第6组引物用于检测和鉴定人类小DNA病毒B19的引物核苷酸序列，其上游引物如SEQ ID NO :16所示核苷酸序列，其下游引物如SEQ ID NO :17所示核苷酸序列；第7组引物用于检测和鉴定肠道病毒中的肠道病毒71型的引物核苷酸序列，其上游引 物如SEQ ID NO 19所示核苷酸序列，其下游引物如SEQ ID NO 20所示核苷酸序列；第8组引物用于检测和鉴定肠道病毒中的柯萨奇病毒A16型的引物核苷酸序列，其上 游引物如SEQ ID NO :22所示核苷酸序列，其下游引物如SEQ ID NO :23所示核苷酸序列。
2.一种鉴定发热伴出疹症候群传染病相关病毒病原体的多重实时荧光定量PCR探针， 其特征在于，鉴定的对象包括水痘-带状疱疹病毒、人类小DNA病毒B19、肠道病毒、登革热 病毒、风疹病毒和麻疹病毒，所述肠道病毒包括肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型；第1组引物用于检测和鉴定肠道病毒的探针核苷酸序列，其特征在于如SEQ ID NO 3 所示核苷酸序列，该序列5’端荧光标记为Cy5，3’端荧光标记为BHQ3 ；第2组引物用于检测和鉴定风疹病毒的探针核苷酸序列，其特征在于如SEQ ID NO 6 所示核苷酸序列，该序列5’端荧光标记为R0X，3’端荧光标记为BHQ2 ；第3组引物用于检测和鉴定麻疹病毒的探针核苷酸序列，其特征在于如SEQ ID NO 9 所示核苷酸序列，该序列5’端荧光标记为HEX，3’端荧光标记为BHQl ；第4组引物用于检测和鉴定登革病毒的探针核苷酸序列，其特征在于如SEQ ID NO 12 所示核苷酸序列，该序列5’端荧光标记为FAM，3’端荧光标记为MGB ；第5组引物用于检测和鉴定水痘-带状疱疹病毒的探针核苷酸序列，其特征在于如SEQ ID NO 15所示核苷酸序列，该序列5’端荧光标记为FAM，3’端荧光标记为TAMRA ；第6组引物用于检测和鉴定人类小DNA病毒B19的探针核苷酸序列，其特征在于如SEQ ID NO 18所示核苷酸序列，该序列5，端荧光标记为HEX，3，端荧光标记为BHQl ；第7组引物用于检测和鉴定肠道病毒中的肠道病毒71型的探针核苷酸序列，其特征在 于如SEQ ID NO 21所示核苷酸序列，该序列5’端荧光标记为R0X，3’端荧光标记为BHQ2 ； 第8组引物用于检测和鉴定肠道病毒中的柯萨奇病毒A16型的探针核苷酸序列，其特 征在于如SEQ ID NO 所示核苷酸序列，该序列5’端荧光标记为Cy5，3’端荧光标记为 BHQ3。
3.一种鉴定发热伴出疹症候群传染病相关病毒病原体的多重实时荧光定量PCR检测 方法，其特征在于，使用权利要求1所述引物和权利要求2所述探针进行组合扩增，包括如 下组合A组合第1组至第4组引物和探针组合同时使用可一次性检测鉴定出所述四种病毒 的一种或几种；B组合第5组至第10组引物和探针组合同时使用可一次性检测鉴定出所 述四种病毒的一种或几种；用A组合或/和B组合2管实时荧光定量PCR可检测及鉴定出 8种病毒。
4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，采用多重实时荧光定量PCR技术扩增 样品的核酸片段，PCR总体系中添加各种引物浓度为0. 2 μ mol/1, PCR总体系中添加各种 探针量为0. 1 μ mol/1，PCR运行条件为逆转录50°C，30min，预变性95°C 5min，变性95°C 15s，退火55°C lmin,回到步骤3，重复循环45次；在退火步骤内进行单点荧光采集。
全文摘要
本发明公开了鉴定发热伴出疹症候群传染病相关病毒病原体的多重实时定量PCR的引物、探针及检测方法。包括对水痘-带状疱疹病毒、人类小DNA病毒B19、肠道病毒(肠道病毒71型和柯萨奇病毒A16型)、登革热病毒、风疹病毒和麻疹病毒的的多重实时荧光定量PCR检测。可通过两管多重PCR反应对多种类型标本中人的以上八种病毒同时进行定性或定量检测，本检测方法操作简单，耗时短，灵敏度高，特异性强，适用于现场检测、早期诊断和流行病学检测研究等，对发热伴出疹症候群起到辅助和鉴别诊断作用。
文档编号C12Q1/68GK102140543SQ201110058948
公开日2011年8月3日 申请日期2011年3月11日 优先权日2011年3月11日
发明者何振健, 吴珏珩, 张定梅, 张赫男, 徐霖, 曹开源, 朱勋, 李隽 , 杨纨, 袁洁, 黎孟枫 申请人:中山大学