专利名称：用于测定甲型h1n1流感病毒全基因序列的引物及测定方法
技术领域：
本发明涉及甲型Hmi流感病毒检测技术，具体地说，涉及一种用于测定甲型Hmi 流感病毒全基因序列的引物及其试剂盒。
背景技术：
流行性感冒(流感)是由流行性感冒病毒(流感病毒)的引起的呼吸系统传染病。流 感病毒属于正粘病毒科，是负单链RNA病毒。流感病毒根据核蛋白(Nucleoprotein，NP)和 基质蛋白(Matrix protein, MP)抗原性的不同分为甲、乙、丙三种分型，均可以感染人。其 中甲型流感病毒的变异能力最强，能引起流感季节性流行或流感大流行。乙型流感病毒变 异能力较弱，一般起流感季节性流行。丙型流感病毒抗原性比较稳定，较少引起流行。甲型流感病毒自1918年从鸟类进入人际传播，引起西班牙流感大流行。甲型流感 病毒通过抗原漂移和抗原转换发生变异，产生病毒变异株或新的病毒亚型，是甲型流感病 毒在人群引起季节性流行的流感大流行的主要原因。人际流行毒株和禽流感病毒通过抗原 转换发生重组，引起1957年和1968年两次流感大流行，分别把H2N2和H3N2两种流感病毒 亚型带入人群中。流感大流行使一种病毒亚型持续在人群中传播，引起季节性流感流行直 至下一次流感大流行。HlNl自1957年停止在人群中传播，1977年重新进入人际流行。H2N2 自1968年后不在人群中流行。目前Hmi和H3N2两种甲型流感病毒同时在人群中流行。甲型流感病毒的病毒体结构主要包括包膜和核衣壳。病毒体包膜上镶嵌着两种糖 蛋白血凝素(Hemagglutinin, HA)和神经氨酸酶(Neuraminidase, ΝΑ)。目前已鉴定了 16 种HA (Η1-Η16)和9种NA (Nl-N9)0甲型流感病毒通过HA和NA不同的组合方式而形成多 种亚型，如曾在人群中流行的Hmi、H2N2和H3N2。病毒核衣壳位于病毒体的核心，主要成分 是由病毒RNA和NP组成的核糖核蛋白(ribonucleoprotein，RNP)，在RNP上附着着RNA聚 合酶复合体蛋白(PB1，PB2和PA)。甲型流感病毒基因组包括8个基因片段，编码11种蛋白 质:ΗΑ, ΝΑ, NP, Ml, M2, PA, PBl, PB2, PB1-F2 和，PB2,以及两个非结构蛋白(nonstructural protein, NS) NSl, NS2 (NEP)02009年4月，从墨西哥和美国的流感患者身上鉴定一种新的猪源Hmi流感病毒。 随着新甲型Hmi在世界范围迅速传播，世界卫生组织(World health organization, WHO) 于2009年6月11日宣布将流感大流行警戒级别提升至最高级别6级，宣布流感疫情进入 全球大流行阶段。在流感大流行的初期进行病毒传播的密切监测，及时发现病例，迅速进行 鉴定，对减低流感大流行的危害具有十分重要的意义。根据流感流行的规律，新的流感变异株产生后，世界各国的人口聚居地都会先出 现输入性病例传入，继而相继蔓延为以本地感染为主的社区流行和地域大流行。在这次甲 型Hmi流感当中，包括我国在内的一些国家由于早期采取了严格的防控措施，有效推迟了 本土病例的传播，为药物储备和疫苗研发争取到了宝贵的时间。本研究组参与甲型Hmi流 感的广东省的密切监测。2009年5月18日成功对广东首例输入性甲型Hmi流感疑似病例进行第一时间核酸检测，确定传染源，对寻找、隔离密切接触者的工作赢得宝贵时间。但 是我们也发现根据WHO推荐的46对全基因测序引物(http://WWW. who. int/csr/disease/ swineflu/en/index. html )，出现三分之一以上的引物特异性差及灵敏度低的现象，严重影 响对甲型Him流感病毒全基因序列测定监控的进展。
发明内容
为了克服现有技术缺陷，本发明提供了一种能用于测定甲型Hmi流感病毒全基 因序列的引物。为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案
一种用于测定甲型Hmi流感病毒全基因序列的引物，包含48对特异性引物，48对特异 性引物分成12组用于检测甲型Hmi流感病毒HA片段全基因编码序列，甲型Hmi流感病 毒HA片段全基因包括ΗΑ，ΝΑ, NP, Ml, M2，PA, PBl和PB2八个片段；
第1组用于检测和鉴定甲型Hmi流感病毒HA基因片段的引物核苷酸序列，其上游引 物如 SEQ ID NO 1, SEQ ID NO :3，SEQ ID NO :5，SEQ ID NO -J, SEQ ID NO :9，SEQ ID NO 11所示核苷酸序列，其下游引物相对应如SEQ ID NO 2, SEQ ID NO :4，SEQ ID NO :6，SEQ ID NO 8, SEQ ID NO :10，SEQ ID NO 12 所示核苷酸序列；
第2组用于检测和鉴定甲型Hmi流感病毒NP基因片段的引物核苷酸序列，其上游引 物如 SEQ ID NO 13, SEQ ID NO :15，SEQ ID NO :17，SEQ ID NO :19，SEQ ID NO 21 所示核 苷酸序列，其下游引物相对应如 SEQ ID NO 14, SEQ ID NO 16, SEQ ID NO 18, SEQ ID NO: 20，SEQ ID NO :22所示核苷酸序列；
第3组物用于检测和鉴定甲型Hmi流感病毒NA基因片段的引物核苷酸序列，其上游 引物如 SEQ ID NO 23, SEQ ID NO :25，SEQ ID NO :27，SEQ ID NO :29，SEQ ID NO 31 所示 核苷酸序列，其下游引物相对应如SEQ ID NO 24, SEQ ID NO 26, SEQ ID NO 28, SEQ ID NO 30, SEQ ID NO 32所示核苷酸序列；
第4组用于检测和鉴定甲型Hmi流感病毒M基因片段的引物核苷酸序列，其上游引物 如 SEQ ID NO 33, SEQ ID NO :35，SEQ ID NO :37，SEQ ID NO 39 所示核苷酸序列，其下游 引物相对应如 SEQ ID NO 34, SEQ ID NO :36，SEQ ID NO :38，SEQ ID NO 40 所示核苷酸序 列；
第5组用于检测和鉴定甲型Hmi流感病毒NS基因片段的引物核苷酸序列，其上游引 物如SEQ ID NO 41, SEQ ID NO :43，SEQ ID NO :45所示核苷酸序列，其下游引物相对应如 SEQ ID NO 42, SEQ ID NO :44，SEQ ID NO 46 所示核苷酸序列；
第6组用于检测和鉴定甲型Hmi流感病毒PB2基因片段的引物核苷酸序列，其上游引 物如 SEQ ID NO 47, SEQ ID NO 49，SEQ ID NO 51, SEQ ID NO 53，SEQ ID NO 55，SEQ ID NO 57, SEQ ID NO 59, SEQ ID N0:61，SEQ ID NO :63所示核苷酸序列，其下游引物相对应如 SEQ ID NO 48, SEQ ID NO :50，SEQ ID NO :52，SEQ ID NO :54，SEQ ID NO :56，SEQ ID NO 58，SEQ ID NO :60，SEQ ID NO :62，SEQ ID NO 64 所示核苷酸序列；
第7组用于检测和鉴定甲型Hmi流感病毒PBl基因片段的引物核苷酸序列，其上游引 物如 SEQ ID NO 65, SEQ ID NO :67，SEQ ID NO :69，SEQ ID NO -Jl, SEQ ID NO :73，SEQ ID NO 75, SEQ ID NO :77，SEQ ID NO :79所示核苷酸序列，其下游引物相对应如SEQ ID NO:ID NO :70，SEQ ID NO -J2, SEQ ID NO :74，SEQ ID NO :76，SEQ ID NO 78, SEQ ID NO 80所示核苷酸序列；
第8组用于检测和鉴定甲型Hmi流感病毒PA基因片段的引物核苷酸序列，其上游引 物如 SEQ ID NO 81, SEQ ID NO :83，SEQ ID NO :85，SEQ ID NO :87，SEQ ID NO :89，SEQ ID NO 91, SEQ ID NO :93，SEQ ID NO :95所示核苷酸序列，其下游引物相对应如SEQ ID NO: 82，SEQ ID NO :84，SEQ ID NO :86，SEQ ID NO :88，SEQ ID NO :90，SEQ ID NO :92，SEQ ID NO 94, SEQ ID NO 96所示核苷酸序列。本发明的另一个目的是提供甲型Hmi流感病毒全基因序列的测定方法，其采用 常规PCR技术扩增样品的核酸片段，PCR总体系中添加各种引物浓度为0. 2 μ mol/1 ；其他 试剂可使用常规的的实时定量PCR反应混合液，包括Taq酶，逆转录酶，一步法RT-PCR反应 缓冲液；PCR运行条件为95 °C预变性，5 min ；95 °C变性，30 s ；55 °C退火，30 s ；72 V 延伸，60 s;回到步骤2，重复循环30次；72 °C,10 min。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果
本发明利用一对待测甲型流感病毒病原体核酸序列的特异性、高效性及重叠性高的引 物，通过常规PCR技术实现靶核酸序列片段的扩增，再进行分小片段测序而高效率的测定 甲型流感病毒全基因组。优点如下
1.操作简单，结果稳定，48个PCR反应过程均在同一条件下进行，效率高，可根据需要。2.灵敏度高，48个PCR反应均能高效进行。3.特异性强，48个PCR反应产物均为单条泳带。4.适用范围广，取样简单。样品中DNA、肝素、EDTA、柠檬酸盐、血红蛋白、白蛋白 和脂质等的污染将不会对结果造成影响，因而适用于各种待测样品如咽喉拭子、血液等。下面将结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
图1.使用本发明引物对1株甲型流感病毒全基因分段PCR的琼脂糖凝胶电泳图。
具体实施例方式为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这 些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。本领域的技术人员可以对其进行各种改造和修改，这些等价形式同样落入本发明 的保护范围。下面实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商 所建议的条件。实施例1 引物和探针的设计
通过分别对所有GenBank数据库中已知100株甲型Hmi病毒株的基因序列进行比对 分析，选择高度保守的区段，设计48对引物和探针，如SEQ ID NO:广96所述。引物设计的 原则如下
(1)引物长度约20-23nt，GC含量在45%_55%之间。
(2) PCR扩增长度一般在400-600 bp之间。(3)对于同一个模板片段，设计引物使每个位点有2-3个PCR扩增片段覆盖，以避 免PCR反应发生点突变影响结果判读。
分析上述病毒特异性基因的信息，经序列分析软件DNASTAR进行引物间/内二聚体的 排除，并经BLAST验证引物的特异性与相近病原体的同源性，设计出针对上述病原体检测 的引物和探针。实施例2 =PCR反应体系的构建与优化 1.样本采集
本实验室于2009年5月17日及5月观日采集三例疑似病例样本，包括广东省首例输 入性甲型Hmi疑似病例以及我国第1例和第2例甲型Hmi 二代疑似病例戴某和薛某的鼻 /咽拭子标本。2.鼻/咽拭子标本RNA的提取
使用 QIAmp MiniElute Virus Spin Kit (Qiagen, Chatsworth, CA)提取鼻 / 咽拭子 标本的RNA，操作按照说明书进行
(1)第一次使用此试剂盒时，在AWl和AW2缓冲液中按照试剂瓶上提示体积加入100% 乙醇，19 ml Affl中加入25 ml无水乙醇，13 ml Affl中加30 ml无水乙醇；在AL中加入28 μ g/ml carrier RNA。(2)取 25 μ 1 Qiagen Protease 放入 1. 5 ml 离心管中。(3)在生物安全柜内将呼吸道样本(鼻拭子和咽拭子)取200 μ 1加入此管中，充 分混勻。若标本不足200 μ 1，则用生理盐水补足至终体积为225 μ L·(4)在每管分别加入200 μ 1 AL (内需要提前加入沘μ g/ml carrier RNA)，充 分混勻振荡15 s。56°C孵育15 min0短暂离心，将管盖上的液体离到管底。(5)加入250 μ 1无水乙醇，充分混勻振荡15 s，室温(15_25°C )裂解5 min。短 暂离心，将管盖上的液体离到管底。(6)将上述裂解液加入QIAamp MinElute离心柱上，6000 g(8000 rpm)，室温离心 1 min，弃收集管中的离心液。滤柱仍放回收集管上，将步骤3)剩余的混合液全部吸入滤柱 中，离心后弃离心液。(7)于滤柱中加入500 μ 1 AWl液，6000 g (8000 rpm)，室温离心1 min，弃收集
管中的离心液。(8)从试剂盒中取一支干净的2 ml收集管，将离心后的滤柱移到新的收集管上，于 滤柱中加入500 μ 1 AW2液，6000 g(8000 rpm)，室温离心1 min。将滤柱移到一个干净的 收集管中，加入500 μ 1无水乙醇，6000 g (8000 rpm)，室温离心1 min。(9)将滤柱移到一个干净的收集管中，20000 g (14000 rpm)，室温离心3 min。离 心后将滤柱放在56°C，3 min以干燥滤膜。(10)将滤柱放在1. 5 ml Eppendorf管上，向滤柱中加入20-150 μ 1的AVE液，室 温静置1 min。20000 g (14000 rpm)室温离心1 min，收集离心液即为提取的核酸。提取 的核酸溶液分装三份至0. 2 ml PCR管中，一份用于检测，其他保存，用于后续的研究。(Il)RNA纯度和浓度检测取2 μ 1 RNA溶液，以核酸蛋白定量仪(NanoDrop
权利要求
1.一种用于测定甲型Hmi流感病毒全基因序列的引物，其特征在于，包含48对特异性 引物，48对特异性引物分成12组用于检测甲型Hmi流感病毒HA片段全基因编码序列，甲 型Hmi流感病毒HA片段全基因包括ΗΑ，ΝΑ, NP, Ml, M2，PA, PBl和PB2八个片段；第1组用于检测和鉴定甲型Hmi流感病毒HA基因片段的引物核苷酸序列，其上游引 物如 SEQ ID NO 1, SEQ ID NO :3，SEQ ID NO :5，SEQ ID NO -J, SEQ ID NO :9，SEQ ID NO 11所示核苷酸序列，其下游引物相对应如SEQ ID NO 2, SEQ ID NO :4，SEQ ID NO :6，SEQ ID NO 8, SEQ ID NO :10，SEQ ID NO 12 所示核苷酸序列；第2组用于检测和鉴定甲型Hmi流感病毒NP基因片段的引物核苷酸序列，其上游引 物如 SEQ ID NO 13, SEQ ID NO :15，SEQ ID NO :17，SEQ ID NO :19，SEQ ID NO 21 所示核 苷酸序列，其下游引物相对应如 SEQ ID NO 14, SEQ ID NO 16, SEQ ID NO 18, SEQ ID NO: 20，SEQ ID NO :22所示核苷酸序列；第3组物用于检测和鉴定甲型Hmi流感病毒NA基因片段的引物核苷酸序列，其上游 引物如 SEQ ID NO 23, SEQ ID NO :25，SEQ ID NO :27，SEQ ID NO :29，SEQ ID NO 31 所示 核苷酸序列，其下游引物相对应如SEQ ID NO 24, SEQ ID NO 26, SEQ ID NO 28, SEQ ID NO 30, SEQ ID NO 32所示核苷酸序列；第4组用于检测和鉴定甲型Hmi流感病毒M基因片段的引物核苷酸序列，其上游引物 如 SEQ ID NO 33, SEQ ID NO :35，SEQ ID NO :37，SEQ ID NO 39 所示核苷酸序列，其下游 引物相对应如 SEQ ID NO 34, SEQ ID NO :36，SEQ ID NO :38，SEQ ID NO 40 所示核苷酸序 列；第5组用于检测和鉴定甲型Hmi流感病毒NS基因片段的引物核苷酸序列，其上游引 物如SEQ ID NO 41, SEQ ID NO :43，SEQ ID NO 45所示核苷酸序列，其下游引物相对应如 SEQ ID NO 42, SEQ ID NO :44，SEQ ID NO 46 所示核苷酸序列；第6组用于检测和鉴定甲型Hmi流感病毒PB2基因片段的引物核苷酸序列，其上游引 物如 SEQ ID NO 47, SEQ ID NO :49，SEQ ID NO :51，SEQ ID NO :53，SEQ ID NO :55，SEQ ID NO 57, SEQ ID NO 59, SEQ ID N0:61，SEQ ID NO :63所示核苷酸序列，其下游引物相对应如 SEQ ID NO 48, SEQ ID NO :50，SEQ ID NO :52，SEQ ID NO :54，SEQ ID NO :56，SEQ ID NO 58，SEQ ID NO :60，SEQ ID NO :62，SEQ ID NO 64 所示核苷酸序列；第7组用于检测和鉴定甲型Hmi流感病毒PBl基因片段的引物核苷酸序列，其上游引 物如 SEQ ID NO 65, SEQ ID NO 67，SEQ ID NO 69，SEQ ID NO 71, SEQ ID NO 73，SEQ ID NO 75, SEQ ID NO :77，SEQ ID NO :79所示核苷酸序列，其下游引物相对应如SEQ ID NO: 66，SEQ ID NO :68，SEQ ID NO :70，SEQ ID NO -J2, SEQ ID NO :74，SEQ ID NO :76，SEQ ID NO 78, SEQ ID NO 80所示核苷酸序列；第8组用于检测和鉴定甲型Hmi流感病毒PA基因片段的引物核苷酸序列，其上游引 物如 SEQ ID NO 81, SEQ ID NO :83，SEQ ID NO :85，SEQ ID NO :87，SEQ ID NO :89，SEQ ID NO 91, SEQ ID NO :93，SEQ ID NO :95所示核苷酸序列，其下游引物相对应如SEQ ID NO: 82，SEQ ID NO :84，SEQ ID NO :86，SEQ ID NO :88，SEQ ID NO :90，SEQ ID NO :92，SEQ ID NO 94, SEQ ID NO 96所示核苷酸序列。
2.—种甲型Hmi流感病毒全基因序列的测定方法，其特征在于，采用常规PCR技术扩 增样品的核酸片段，PCR总体系中添加各种引物浓度为0.2 ymol/l，PCR运行条件为95°C预变性，5 min ；95 °C变性，30 s ；55 °C退火，30 s ；72 °C延伸，60 s;回到步骤2，重复循 环 30 次；72 °C,10 min。
全文摘要
本发明公开了用于测定甲型H1N1流感病毒全基因序列的引物及测定方法。本发明涉及48对特异性强、灵敏度高、稳定性好的引物，通过48个常规PCR反应对甲型H1N1流感病毒8个片段基因序列测定，包括HA，NA，NP，M1，M2，PA，PB1，PB2片段。利用这48进行检测的方法操作简单，耗时短，特异性强，灵敏度高，适用于甲型H1N1流感病毒鉴定及流行病学调查研究等。
文档编号C12Q1/68GK102140544SQ20111005895
公开日2011年8月3日 申请日期2011年3月11日 优先权日2011年3月11日
发明者何振健, 吴珏珩, 张定梅, 徐霖, 曹开源, 朱勋, 李蔓英, 李隽 , 杨纨, 袁洁, 黎孟枫 申请人:中山大学