专利名称：检测沙门氏菌的聚丙烯酰胺凝胶芯片及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于致病菌检测技术领域，具体涉及基于mTi 基因沙门氏菌特异序列的用于沙门氏菌检测的聚丙烯酰胺凝胶芯片。
背景技术：
沙门氏菌是进出口食品中常见的致病菌，也是导致食物中毒和食源性疾病的主要病原菌，在我国占食物中毒的第一位。国外由于沙门氏菌造成的中毒事件也屡见不鲜，2008 年美国圣保罗沙门氏菌感染疫情爆发，沙门氏菌蔓延至23个州，2 人感染，其中造成一人死亡。我国国家质量监督检验检疫总局明确规定沙门氏菌为必检项目。因此准确、快速地检测食物及环境中的沙门氏菌，对于沙门氏菌防治具有十分重要的意义。现有技术中，通常使用PCR方法检测，但是需要对PCR产物进行后处理，极易导致 PCR产物污染，而且也有一定的非特异性扩增。基因芯片方法由于其具有检测效率高，快速， 简便，自动化程度高等优势已经成为分子检测中的主要方法之一，目前聚丙烯酰胺凝胶芯片检测技术已经比较成熟。本发明的芯片探针基于基因。基因即促旋酶(gyrase)的B亚单位基因，属于信息通路中与DNA复制、限制、修饰或修复有关的蛋白编码基因。^jri 基因序列全场约1. 2 1. 41Λ，平均碱基替换率为每100万年变化0. 79Π). 8%，比16S rDNA的每5000万年变化1%的速度快。另外，由于其作为蛋白编码蛋白，其所固有的遗传密码子的兼并性使得DNA序列可以发生较多的变异而不改变氨基酸序列，尤其是密码子的第三位碱基，这就使得mTi 基因序列在鉴定细菌近缘种方面，具有较高的分辨率。Lzumi等通过分析9株变形假单胞菌的WTi 基因序列，设计出特异性引物，并对肠道和肾脏样品进行PCR分析，结果表明，此种方法可以快速检测由变形假单胞菌引起的疾病。目前，^jri 基因序列分析在蛭弧菌属、芽孢杆菌属、巴氏肺炎球菌属和苯酚分解菌等相近菌株的快速检测中效果显著。
发明内容
技术问题
本发明提供了一对基于mTi 基因，能够快速检测沙门氏菌的聚丙烯酰胺凝胶芯片，此芯片能够高效、快速地检测出试样中含有的各种沙门氏菌。技术方案
一种检测沙门氏菌的聚丙烯酰胺凝胶芯片，包括固相载体和点载在固相载体上的一条寡聚核苷酸片段，序列为S-Acryl: 5' -TTTTTTTTCTGCTGGCAGAATAC-3’。所述及的寡聚核苷酸片段为基于沙门氏菌的^jri 基因专一序列，包括7种沙门氏菌的WTi 基因片段。所述及的沙门氏菌的mTi 基因片段由扩增mTi 基因通用引物扩增获得，序列为
TEMgyr-for: AACGCCGATCCACCCGAA
TEMgyr-rev: GAATCGCCTGGTTCTTGC，5，端 TAMRA 荧光标记。检测沙门氏菌的聚丙烯酰胺凝胶芯片在检测沙门氏菌第II Μ Salmonella sub-genus II (CMCC50215)、沙门氏菌第 III 亚属 Salmonella sub-genus III b (CMCC50381)、肠炎沙门氏菌 Salmonella en teri tidis (CMCC50335 )、肠炎沙门氏菌 danysz 1 納 Salmonella enteritidis var. danysz (CMCC50100)、鸡沙门氏 i Salmonella gallinarum (CMCC50770)和曼彻斯特沙门氏菌fehofleWa manchester (CMCC50380)中的应用。有益效果
与现有技术相比，本发明的芯片具有检测周期短、操作简单、结果可靠、灵敏度及自动化强高等优点，有助于对人和动物常见所有沙门氏菌病的早期临床诊断，并对于公共卫生， 畜牧兽医和口岸检疫中的致病性沙门氏菌的检出具有重要意义。
图1是应用本发明沙门氏菌PCR快速检测芯片的检测准确性结果图。
具体实施例方式
实施例
现采用该芯片，对7株常见沙门氏菌进行检测，同时以6株粪便中常见的其它致病菌株做为对照，来验证本发明快速检测芯片的准确性及灵敏度。一、检测样品制备
菌株沙门氏菌第II 亚属Salmonella sub-genus II (CMCC50215)、沙门氏菌第 III 亚属 Salmonella sub-genus III b (CMCC50381)、肠炎沙门氏菌 Salmonella en teri tidis (CMCC50335 )、肠炎沙门氏菌 danysz 变种 Salmonella en teri tidis var. danysz (CMCC50100 )、鸡沙门氏菌 Salmonella gal linarum (CMCC50770 )、山夫登堡沙门氏 1 Salmonella senftenberg (CMCC 50210)和曼彻斯特沙门氏菌manchester (CMCC50380)。大肠杆i Escherichia coli (ATCC 25922)、粪链球 M Streptococcus faecal is (CMCC 32223)、阴沟肠杆菌你iero 力 acier cloacae (CMCC 45301)、产气肠杆 1 Enterobacter aerogenes (CMCC 45103)、弗劳地枸橼酸杆菌 CYiro Bacter freumdii (CMCC48001)和弗氏志贺菌沢Wa flexneri (CMCC 51229)0以上标准菌株均采购于中国医学微生物菌种保藏中心。培养条件37°C培养Mh。PCR扩增菌株中^jri 基因片段 UPCR反应体系(50μυ
权利要求
1.一种检测沙门氏菌的聚丙烯酰胺凝胶芯片，包括固相载体，其特征在于包括点载在固相载体上的一条寡聚核苷酸片段，序列为S-Acryl 5，-TTTTTTTTCTGCTGGCAGAATAC-3，。
2.根据权利要求1所述的检测沙门氏菌的聚丙烯酰胺凝胶芯片，其特征在于所述及的寡聚核苷酸片段为基于沙门氏菌的^Fi基因专一序列，包括7种沙门氏菌的^jri 基因片段。
3.根据权利要求2所述的检测沙门氏菌的聚丙烯酰胺凝胶芯片，其特征在于所述及的沙门氏菌的^jri 基因片段由扩增^jri 基因通用引物扩增获得，序列为TEMgyr-for: AACGCCGATCCACCCGAATEMgyr-rev: GAATCGCCTGGTTCTTGC，5，端 TAMRA 荧光标记。
4.上述任一权利要求所述检测沙门氏菌的聚丙烯酰胺凝胶芯片在检测沙门氏菌第II HSalmonella sub-genus //(CMCC50215)、沙门氏菌第 III HSalmonella sub-genus III b (CMCC50381)、肠炎沙门氏菌 fehofleWa enter it idis (CMCC503;35)、肠炎沙门氏菌 danysz 7^Salmonella enter it idis var. ￡/3/775^( CMCC50100)、鸡沙门氏菌 fe/fflofli^/a gallinarum (CMCC50770)和曼彻斯特沙门氏菌fehofleWa manchester (CMCC50380)中的应用。
全文摘要
本发明公开了一种检测沙门氏菌的聚丙烯酰胺凝胶芯片及其应用，包括固相载体和点载在固相载体上的一条寡聚核苷酸，序列为S-Acryl:5′-TTTTTTTTCTGCTGGCAGAATAC-3′。所述及的寡聚核苷酸为基于沙门氏菌的gyrB基因属专一序列，包括7种沙门氏菌的gyrB基因片段。可用于检测沙门氏菌。本发明的基因芯片具有检测周期短、操作简单、结果可靠、自动化程度高等优点，易于推广应用。
文档编号C12Q1/10GK102181525SQ201110058829
公开日2011年9月14日 申请日期2011年3月11日 优先权日2011年3月11日
发明者叶旭红, 林先贵, 王一明 申请人:中国科学院南京土壤研究所