一种传染病病原体全人源化抗体的制备方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物医药领域，特别是一种传染病病原体全人源化抗体的制备方法。
【背景技术】
[0002]传染病〔Infect1us Diseases〕是由各种病原体引起的能在人与人、动物与动物或人与动物之间相互传播的一类疾病。病原体中大部分是微生物，小部分为寄生虫，寄生虫引起者又称寄生虫病。有些传染病，防疫部门必须及时掌握其发病情况，及时采取对策，因此发现后应按规定时间及时向当地防疫部门报告，称为法定传染病。中国目前的法定传染病有甲、乙、丙3类，共39种。
[0003]传染病是一种可以从一个人或其他物种，经过各种途径传染给另一个人或物种的感染病。通常这种疾病可借由直接接触已感染之个体、感染者之体液及排泄物、感染者所污染到的物体，可以通过空气传播、水源传播、食物传播、接触传播、土壤传播、垂直传播等。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种制备可以有效治疗传染病的人源化抗体的制备方法，它针对上述情况，发明一种操作简便、成本低廉、高效的制备方法。
[0005]本发明的技术方案:一种制备可以有效治疗传染病的人源化抗体的方法，其特征在于它包括以下步骤:
[0006](I)收集大量传染病细胞样本及正常细胞样本，并通过同位素标记，多维液相色谱-质谱联用的方法分析在传染病细胞中特异表达的细胞因子，对这些蛋白进行分离纯化；
[0007](2)完成传染病细胞中特异表达的细胞因子人源化抗体的表达和纯化；
[0008]1、用分离纯化出来的细胞因子进行动物免疫。选择6-8周龄的雌性BALB/c小白
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[0009]按照每只鼠150ug的量，与等体积的完全弗氏佐剂混合乳化，乳浊液皮下多点注射。2-3周后加强免疫，抗原剂量同上，与弗氏不完全佐剂混合乳化，乳浊液皮下多点或腹腔内注射。
[0010]免疫7-15天后小白鼠尾静脉采血，收集血清。间接法ELISA测定血清中针对的抗体滴度。如果抗体滴度在1: 15000以上，可以在融合前三天加强免疫，150uL的PBS溶解50ug传染病细胞中特异表达的细胞因子腹腔内注射或静脉注射。否则，继续进行每两周一次免疫，直到达到较高的抗体滴度。
[0011]2、细胞融合和筛选。为了产生分泌治疗传染病细胞因子的人源化抗体的杂交瘤细胞，将对数生长期的骨髓瘤细胞与免疫小白鼠脾细胞的单细胞悬液混合，然后在聚乙二醇。
[0012](PEG)介导的条件下融合:脾细胞与骨髓瘤细胞在15: I的比例混合。将细胞的混合物用无血清MDM培养基洗涤至少3次。于37°C水浴中，向细胞团中逐滴加入50 % PEG，并轻轻摇动细胞沉淀，再经无血清的MDM培养基洗涤I次。用含有HAT的完全培养基重悬融合后的细胞团，轻轻吹打至细胞团散开，并按200ul/Well接种于96孔细胞培养板中。之后，每隔2-3天半量更换培养基，直到杂交瘤细胞克隆足够大可以筛选。间接法ELISA筛选分泌针对传染病细胞中特异表达的细胞因子的抗体阳性细胞孔。首次确定为阳性细胞孔，经过有限稀释法，至少亚克隆3次，保证阳性率在150%，获得可以稳定分泌传染病细胞中特异表达的细胞因子抗体的杂交瘤细胞株。
[0013]3、腹水制备:选择6-8周龄的BALB/c小白鼠，每只小白鼠腹腔注射0.5ml石蜡油，7-15天后注射杂交瘤细胞。注射细胞后15天左右收集腹水，protein G/A柱子纯化腹水，获得纯度较高的治疗传染病细胞因子的人源化抗体。
【具体实施方式】
[0014]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0015]以下将通过【具体实施方式】的形式再对本发明的上述内容做进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅局限于以下的【具体实施方式】，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
[0016]实施例1:传染病细胞中特异表达的细胞因子的获得通过同位素标记、多维液相色谱-质谱联用的方法分析200多个传染病细胞样本与200多个正常细胞样本，找出5-8个在传染病细胞中特异表达的细胞因子，分离纯化出这几个细胞因子；
[0017]实施例2:传染病细胞中特异表达的细胞因子人源化抗体的表达
[0018]1、用分离纯化出来的细胞因子进行动物免疫。
[0019]选择6-8周龄的雌性BALB/c小白鼠。按照每只鼠150ug的量，与等体积的完全弗氏佐剂混合乳化，乳浊液皮下多点注射。2-3周后加强免疫，抗原剂量同上，与弗氏不完全佐剂混合乳化，乳浊液皮下多点或腹腔内注射。免疫7-15天后小白鼠尾静脉采血，收集血清。间接法ELISA测定血清中针对的抗体滴度。如果抗体滴度在1:1w以上，可以在融合前三天加强免疫，150 μ L的PBS溶解50ug传染病细胞中特异表达的细胞因子腹腔内注射或静脉注射。否则，继续进行每两周一次免疫，直到达到较高的抗体滴度。
[0020]2、细胞融合和筛选。
[0021]为了产生分泌传染病细胞中特异表达的细胞因子的人源化抗体的杂交瘤细胞，将对数生长期的骨髓瘤细胞与免疫小白鼠脾细胞的单细胞悬液混合，然后在聚乙二醇(PEG)介导的条件下融合:脾细胞与骨髓瘤细胞在15: I的比例混合。将细胞的混合物用无血清HffiM培养基洗涤至少3次。于37°C水浴中，向细胞团中逐滴加入50% PEG，并轻轻摇动细胞沉淀，再经无血清的MDM培养基洗涤I次。用含有HAT的完全培养基重悬融合后的细胞团，轻轻吹打至细胞团散开，并按200ul/well接种于96孔细胞培养板中。之后，每隔2_3天半量更换培养基，直到杂交瘤细胞克隆足够大可以筛选。间接法ELISA筛选分泌针对传染病细胞中特异表达的细胞因子的抗体阳性细胞孔。首次确定为阳性细胞孔，经过有限稀释法，至少亚克隆3次，保证阳性率在150%，获得可以稳定分泌传染病细胞中特异表达的细胞因子抗体的杂交瘤细胞株。
[0022]实施例3:传染病细胞中特异表达的细胞因子的人源化抗体的纯化选择6-8周龄的BALB/c小白鼠，每只小白鼠腹腔注射0.5ml石蜡油，7_15天后注射杂交瘤细胞。注射细胞后15天左右收集腹水，protein G/A柱子纯化腹水，获得纯度较高的传染病细胞中特异表达的细胞因子的人源化抗体。
[0023]本发明方案所公开的技术手段不仅限于上述实施方式所公开的技术手段，还包括由以上技术特征任意组合所组成的技术方案。
【主权项】
1.一种传染病病原体全人源化抗体的制备方法，其特征在于它包括以下步骤:(I)传染病中特异表达细胞因子的分离纯化；(2)传染病中特异表达细胞因子的人源化抗体的表达；(3)传染病中特异表达细胞因子人源化抗体的纯化，通过同位素标记、多维液相色谱-质谱联用的方法找出在传染病细胞中特异表达的细胞因子。2.根据权利要求1所述的一种制备传染病病原体全人源化抗体的制备方法，其特征在于，用在传染病细胞中特异表达的细胞因子对小白鼠进行免疫，如果抗体滴度在I: 8000-1: 12000以上时，可将免疫小白鼠脾细胞与对数生长期的骨髓瘤细胞融合并筛选。3.根据权利要求1所述的一种制备传染病病原体全人源化抗体的制备方法，其特征在于向小白鼠腹腔注射杂交瘤细胞，注射细胞后8-12天收集腹水，protein G/A柱子纯化腹水，获得治疗传染病的人源化抗体。
【专利摘要】本发明公开了一种制备传染病病原体全人源化抗体的制备方法，其特征在于，通过同位素标记，多维液相色谱-质谱联用的方法分析在传染病细胞中特异表达的细胞因子，对这些蛋白进行分离纯化；用分离纯化出来的传染病细胞中特异表达的细胞因子对6-8周龄的雌性BALB/c小白鼠进行免疫，如果抗体滴度在1∶15000以上时，可将免疫小白鼠脾细胞的单细胞悬液与对数生长期的骨髓瘤细胞融合并筛选，得到分泌传染病细胞中特异表达的细胞因子的人源化抗体的杂交瘤细胞；向6-8周龄的BALB/c小白鼠腹腔注射杂交瘤细胞，注射细胞后15天左右收集腹水，protein？G/A柱子纯化腹水，获得纯度较高的治疗传染病细胞因子的人源化抗体。
【IPC分类】C07K16/24
【公开号】CN105218671
【申请号】CN201510649970
【发明人】李艳华, 张振刚
【申请人】李艳华
【公开日】2016年1月6日
【申请日】2015年9月29日