氧化石墨烯-重组链球菌蛋白g非共价复合材料及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001]
本发明属于化学合成技术领域，涉及石墨烯复合材料制备技术及其在蛋白质富集中的应用，具体的说是一种基于氧化石墨烯-重组链球菌蛋白G非共价复合材料的制备及其功能化应用。
【背景技术】
[0002]传染病病原体本身作为抗原在生物机体内可产生相应特异的抗体，现有检测方法多是通过抗原-抗体间的特异识别来检测病原体的，如酶联免疫吸附技术、免疫荧光和免疫胶体金技术等。这些免疫学技术具有操作简便，结果易于分析等特点，然而免疫学检测方法的灵敏度相对较低，易造成结果的假阴性。为了提高免疫学检测方法对传染病病原体的检测灵敏度，通常采取通过对样品进行富集。对样品进行有效的前处理，可提高待检测样品中抗体的浓度，从而间接提高检测方法的灵敏度。目前针对抗体富集的商品化试剂多以琼脂糖、海藻糖为载体固载吸附抗体的重组链球菌蛋白G，如琼脂糖固载Protein G约为80ug/mL，其固载蛋白量较低。因此研制对目标蛋白固载量大的载体，并通过有效固载重组链球菌蛋白G，对于实现抗体富集具有重要意义。
[0003]石墨烯是一种仅有一个碳原子厚度的二维纳米材料，是碳原子以SP2杂化轨道组成的六角形蜂巢晶格的平面薄膜。2004年由Novoselov等用胶带层层剥离法从石墨中分离得到，其理论厚度仅为0.335 nm。单层石墨烯成为继碳纳米管之后的新型碳纳米材料，在物理、化学、材料、生物等众多领域掀起了巨大的研究热潮。石墨烯中无碳原子缺失，机械强度高、结构稳定、热稳定性好、化学稳定性高、比表面积大(2600 m2.g 1)，而且具有良好的生物相容性，使其容易吸附其他生物分子，特别是氧化石墨烯除拥有大比表面积外，在其表面还存在大量的含氧基团，使氧化石墨烯更适用于吸附拥有较多化学基团的生物分子，如蛋白质、核酸等。当石墨烯材料与其他材料相复合时，利用其他材料的相关性质，即可实现生物分子的富集。
【发明内容】
[0004]有鉴于此，本发明利用氧化石墨烯的高比表面积的特性，通过非共价结合的方法，将重组链球菌蛋白G (PG)固载到氧化石墨烯(GO)材料上，制备出具有抗体吸附生物活性的高容量抗体富集材料。具体技术方案如下。
[0005]本申请提供的氧化石墨烯-重组链球菌蛋白G非共价复合材料为重组链球菌蛋白G与氧化石墨烯的非共价结合物，所述氧化石墨烯与重组链球菌蛋白G的质量数之比为1:
2.5_3 ο
[0006]本申请中所述非共价复合材料的制备方法包括如下步骤:
I)活化氧化石墨烯(GO); 2)按照比例，将活化氧化石墨烯(GO)与重组链球菌蛋白G (PG)混合，并进行振荡孵育，离心后去上清，材料洗涤，所得材料即为氧化石墨烯-重组链球菌蛋白G非共价复合材14(GOiPG) O
[0007]进一步地，上述步骤I)中所述活化氧化石墨稀的步骤为:将氧化石墨稀重悬于去离子水中，室温超声将充分分散；按I份氧化石墨烯材料中同时加入8-12份N-羟基丁二酰亚胺(NHS)和2-4份1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)混匀后进行活化；洗涤材料后，即得活化的氧化石墨烯。
[0008]进一步地，本申请提供的氧化石墨稀-重组链球菌蛋白G非共价复合材料在抗体纯化、抗体富集、病原体检测和/或生物样品前处理过程领域中的应用。
[0009]本发明具有如下优点:
1.本发明了优化了氧化石墨烯材料对重组链球菌蛋白A的固载条件，保持了蛋白的活性，并且提高了蛋白的固载量；
2.该方法的制备步骤简便、易于推广、重现性好；
3.该方法制备氧化石墨烯-重组链球菌蛋白A复合材料易于大规模生产，成本低。
【附图说明】
[0010]图1.制备材料MALDI检测；
图2.制备材料抗体吸附检测。
【具体实施方式】
[0011 ] 下面结合实施例对本发明做进一步说明。
[0012]实施例1
(一)氧化石墨烯(GO)的活化
1.1mg GO重悬于ImL的去离子水中，室温超声3h，充分分散；
2.加入500mM2-(N-吗啉基)乙磺酸4-吗啉乙磺酸(pH6.1) (MES) 500 μ L，然后同时 16mg/ml NHS 500 μ L 和 4mg/ml EDC 500uL,混匀，室温快速搅拌 30min ;
3.材料用500mM(pH6.1) MES反复洗涤，除去残余的NHS和EDC，终体积为ImL ；
4.溶液即为活化的G0。
[0013](二)氧化石墨烯固载重组链球菌蛋白G
1.选择按照1:2.5的比例，将上述(一)制备的材料GO与PG混合，进行4°C振荡过夜孵育；
2.16400Xg/10min离心后去上清，加入500mM (pH6.1)MES洗涤三次，所得材料即为氧化石墨烯-重组链球菌蛋白G (GOiPG)非共价复合材料。
[0014](三)固载材料蛋白性质检测
制得的材料进行MALDI检测，结果如图1所示:图A为G00PG，图B为PG，PG分子量为31KD，在15527处为PG峰，其余为杂峰。说明材料上固载的蛋白是PG。
[0015](四)固载材料功能检测
将制备的GOOPG非共价复合材料经牛血清白蛋白封闭后，与异硫氰酸荧光素(FITC)标记的免疫球蛋白G (IgG)孵育2h，通过倒置荧光显微镜观察，如图2所示，A图为白光场，不规则状物质即为GO-PG复合材料，B图为相应位置的绿色荧光场，在400倍视野下通过左右对比可见，GOOPG非共价复合材料周边有明显的荧光表达，说明FITC标记的IgG被吸附在材料上，提示GOOPG非共价复合材料上蛋白G的活性保持良好。
[0016]实施例2
氧化石墨烯(GO)的活化方案中，NHS浓度改为24mg/ml，其他同实施例1，可制备得GOOPG非共价复合材料。
[0017]实施例3
氧化石墨烯(GO)的活化方案中，NHS浓度改为20mg/ml，其他同实施例1，可制备得GOOPG非共价复合材料。
[0018]实施例4
氧化石墨烯(GO)的活化方案中，EDC浓度改为8mg/ml，其他同实施例1，可制备得GOOPG非共价复合材料。
[0019]实施例5
氧化石墨烯(GO)的活化方案中，EDC浓度改为6mg/ml，其他同实施例1，可制备得GOOPG非共价复合材料。
[0020]实施例6
氧化石墨烯固载重组链球菌蛋白G方案中，比例调整为1:3，其他同实施例1，可制备得GOiPG非共价复合材料。
[0021]实施例7
氧化石墨烯固载重组链球菌蛋白G方案中，比例调整为1:2.8，其他同实施例1，可制备得GOOPG非共价复合材料。
[0022]实施例8
GOOPG材料蛋白G固载量分析。在实施例1的固载条件下，利用BCA蛋白定量原理，测定材料GO与PG混合孵育后不同时间上清的蛋白G含量，可间接测得材料蛋白G的固载量为 3.38mg/mg0
[0023]实施例9
GOiPG材料蛋白G固载量分析。在实施例2-实施例7的固载条件下，利用BCA蛋白定量原理，测定材料GO与PG混合孵育后不同时间上清的蛋白G含量，可间接测得材料蛋白G的固载量在lmg/mg-4mg/mg之间，与商品试剂琼脂糖固载ProteinG 80ug/mL比较，其固载量大大提尚。
[0024]以上所述，仅为本发明的【具体实施方式】，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应所述以权利要求的保护范围为准。
【主权项】
1.氧化石墨烯-重组链球菌蛋白G非共价复合材料，其特征在于，所述复合材料为重组链球菌蛋白G与氧化石墨烯的非共价结合物，所述氧化石墨烯与重组链球菌蛋白G的质量数之比为1:2.5-3ο2.一种权利要求1所述的非共价复合材料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤: O活化氧化石墨烯； 2)按照比例，将活化氧化石墨烯与重组链球菌蛋白G混合，并进行振荡孵育，离心后去上清，材料洗涤，所得材料即为氧化石墨烯-重组链球菌蛋白G非共价复合材料。3.跟据权利要求2所述的非共价复合材料的制备方法，其特征在于，步骤I)所述活化氧化石墨烯的步骤为:将氧化石墨烯重悬于去离子水中，室温超声将充分分散；按I份氧化石墨烯材料中同时加入8-12份N-羟基丁二酰亚胺和2-4份1-(3- 二甲氨基丙基)_3_乙基碳二亚胺盐酸盐混匀后进行活化；洗涤材料后，即得活化的氧化石墨烯。4.一种权利要求1所述的氧化石墨烯-重组链球菌蛋白G非共价复合材料在抗体纯化、抗体富集、病原体检测和/或生物样品前处理过程中的应用。
【专利摘要】本发明涉及一种氧化石墨烯-重组链球菌蛋白G非共价复合物材料及其制备方法和应用。本申请利用氧化石墨烯的高比表面积的特性，通过非共价结合的方法，将重组链球菌蛋白G固载到氧化石墨烯材料上，制备出具有抗体吸附生物活性的高容量抗体富集材料。制得的氧化石墨烯-重组链球菌蛋白G非共价复合材料可用于抗体纯化、抗体富集、病原体检测、生物样品前处理等领域。
【IPC分类】B01J20/30, B01J20/24
【公开号】CN105148867
【申请号】CN201510582222
【发明人】李云峰
【申请人】李云峰
【公开日】2015年12月16日
【申请日】2015年9月15日