专利名称：从石蜡包埋组织中提取总rna的方法
技术领域：
本发明涉及RNA提取方法，尤其是长时间福尔马林固定石蜡包埋组织中总RNA的提取方法。
背景技术：
福尔马林固定石蜡包埋组织(FFPE)是医疗机构最常用的保存病理组织的方法， 由于新鲜标本难以得到，为进行实体肿瘤分子生物学研究，对已有病例进行回顾性研究时只能从石蜡包埋组织中进行基因提取，因此石蜡包埋组织就成为来源最丰富的珍贵资源。 从石蜡包埋组织中提取DNA的方法已经成熟，但针对DNA的研究有时在某种程度上不能准确反映疾病相关基因转录过程中发生的改变，因此从病理学档案标本中提取足量且能有效扩增的RNA对基因组功能及多态性研究具有重要意义。但长期以来从石蜡包埋组织中提取RNA —直存在一些困难一方面，与DNA相比较，RNA很不稳定，容易受到环境温度、酸碱度等因素的影响，尤其是无处不在的RNA酶，在固定和包埋处理过程中很容易使得RNA分子被化学修饰或降解，不适宜进一步用于分子生物学研究；另一方面，固定剂所引起的组织蛋白质一 RNA的高度交联，使得RNA更难以提取。最近几年，国内外这方面出现诸多进展，但提取方法各异，所得RNA的产量及扩增效率也存在很大差别。文献中报道的提取方法，多为 Trizol裂解法，蛋白酶消化法或试剂盒提取法，但提取的RNA的浓度和纯度不理想，降解严重，只能进行小片段RNA扩增，更不能进一步很好的进行实时定量PCR(q RT-PCR)和基因芯片(microarray)的研究。并且现有技术所应用针对的对象，即FFPE样本多为1年内的样本，这也为临床研究的应用带来很大的限制。因此，需要研发更有效的能适用于更长时间保存的FFPE样本的RNA提取的方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可用于长时间保存的FFPE样本的RNA提取的方法，本发明是在试剂盒(RecoverAl 1 Total Nucleic Acid Isolation Kit，Ambion公司产品，货号AM1975)的基础上所提出的改进方法，该方法包括如下步骤①脱蜡将待处理的石蜡包埋组织切成厚度为20 μ m的组织片，取4片组织片置于无菌的1. 5ml离心管内，加入Iml 二甲苯，漩涡震荡混勻，50°C水浴3分钟，室温条件下， HOOOrpm离心4分钟，弃上清，重复操作1 3次；加Iml无水乙醇，混勻，室温条件下， HOOOrpm离心2 4分钟，弃上清，重复操作2次，所得样品室温空气干燥15 30分钟；②消化向步骤①所得样品中加入400ul消化缓冲液和4ul蛋白酶，55°C水浴 30 150分钟；③提取在480ul提取剂中加入IlOOul无水乙醇，加入离心管中，用吸头反复吹打直到组织没有成团，90%的组织碎裂，呈白色云雾状为止；准备一个带滤柱的收集管，加 700ul混合液，9000rpm离心30秒，再加剩余液体，再9000rpm离心30秒，弃滤液；加700ul 洗液l,9000rpm离心30秒，加500ul洗液2/3，9000rpm离心30秒，弃滤液，再9000rpm离心30秒，弃滤液；④纯化提前95°C水浴预热无核酸酶水，准备DNase混合液6ul IOxDNA酶缓冲液，4ul DNA酶，50ul无核酸酶水；加60ul DNA酶混合液到滤柱中央，室温静置30分钟，加 700ul洗液1室温静置30 60秒，9000rpm离心30秒，弃滤液，加500ul洗液2/3 9000rpm 离心30秒，弃滤液，再加500ul洗液2/3，9000rpm离心60秒，弃滤液；用新的收集管，加 60ul的预热的无核酸酶水，室温静置2 3分钟，12000rpm离心1分钟，反复收集一次。采用本发明的方法，可以提取出保存时间最长达6年的石蜡包埋保存的组织样品中的RNA，并成功的进行了后续的国际公认的分子生物学检测。而相关领域的现有研究多是针对保存期少于1年的样品。国内外均无文献报道在保存2 6年福尔马林固定石蜡包埋的组织中提取总RNA，进行mRNA及miRNA的q RT-PCR及microarray。经过核酸微量测试仪和国际公认的Agilent 2100bioanalyzer分析，提取的浓度在211_3116ng/ul，提取纯度A260/280 1. 75-2. 04，都非常理想，可以进一步进行mRNA及miRNA水平的qRT-PCR和 miRNA的microarray的高丰度基因的表达研究，这对于开展大量FFPE的基因研究提供了实验基础，具有广阔的应用价值。
本发明附图6幅，图1是本发明的方法提取的人卵巢癌的福尔马林固定石蜡包埋组织的RNA琼脂糖电泳结果，图中数字分别表示样品标号。图2是本发明的方法提取的人卵巢癌的福尔马林固定石蜡包埋组织的RNA质量分析图谱，其中图2(A)是标准品1的分析结果图谱，Ladder :RNA范围:218 ；RNA浓度:150ng/ul ；图2(B)和图2(C)分别是21号、12号样本的分析结果图谱，参照标准品1 ；图2 (D)是标准品2的分析结果图谱，Ladder =RNA范围223. 7 ；RNA浓度:150ng/ ul ；图2(E)是14号样本的分析结果图谱，参照标准品2 ；图2 (F)是标准品3的分析结果图谱，Ladder =RNA范围J81. 3 ；RNA浓度150ng/ ul ； 2 (G),2 (H),2 (I),2 (J)和2 (K)分别是22、24、四、34和40号样本的分析结果图谱，参照标准品3。附图3是本发明的方法提取的人卵巢癌的福尔马林固定石蜡包埋组织的RNA用于 miRNA基因芯片(Microarray)实验结果谱图。附图4是miRNA的表达在不同卵巢癌样本中的microarray结果的可信度图谱。附图5是本发明的方法提取的1年期以内的人卵巢癌的福尔马林固定石蜡包埋组织的RNA用于mRNA q RT-PCR检测结果谱图，其中图5(A)是内参基因GAPDH的扩增曲线，图5 (B)是目的基因STMNl的扩增曲线，图5 (C)是内参基因GAPDH的融解曲线，图5 (D)是目的基因STMNl的融解曲线。
附图6是本发明的方法提取的6年期以内的人卵巢癌的福尔马林固定石蜡包埋组织的RNA用于miRNA q RT-PCR检测结果谱图，其中图6 (A)是内参miRNA U6的扩增曲线，图6 (B)是目的miRNA的扩增曲线。
具体实施例方式美国Ambion公司的核酸提取试剂盒，Recoveral 1 Total Nucleic AcidIsolation Kit (货号AM1975)是本领域技术人员常用的工具试剂盒。本申请的发明人在研究中发现，该试剂盒在用于石蜡包埋组织样品RNA提取中存在一定的局限，在应用于保存期较长的样品时，提取的RNA的浓度和纯度不够理想。并且，在试剂盒的具体应用过程中，发明人发现该试剂盒的方法还有诸多可改进之处，基于此，提供本发明的包括脱蜡、消化、提取和纯化等步骤的RNA提取方法，具体包括如下步骤①脱蜡将待处理的石蜡包埋组织切成厚度为20 μ m的组织片，取4片组织片置于无菌的1. 5ml离心管内，加入Iml 二甲苯，漩涡震荡混勻，50°C水浴3分钟，室温条件下， HOOOrpm离心4分钟，弃上清，重复操作1 3次；加Iml无水乙醇，混勻，室温条件下， HOOOrpm离心2 4分钟，弃上清，重复操作2次，所得样品室温空气干燥15 30分钟；上述步骤①中，所述采用二甲苯对待处理的石蜡包埋组织进行脱蜡的操作，即“将待处理的石蜡包埋组织切成厚度为20 μ m的组织片，取4片组织片置于无菌的1. 5ml离心管内，加入Iml 二甲苯，漩涡震荡混勻，50°C水浴3分钟，室温条件下，HOOOrpm离心4分钟， 弃上清”可根据样品的石蜡含量调整次数石蜡含量高于50%时，重复操作3次；石蜡含量 30 50%时，重复操作2次；石蜡含量低于30%时，操作1次。该步骤在试剂盒方法的基础上对脱蜡次数进行了细化，是样品的更高效和有效。上述步骤①中，用无水乙醇处理样品后，可用吸头挤压组织，尽量吸净组织中的乙醇，在此改进条件下处理所得样品在下一步操作中所需干燥时间15 30分钟，比试剂盒方法所需的45min更短，并且提高了干燥的效果，进而缩短下一步消化的时间。②消化向步骤①所得样品中加入400ul消化缓冲液和4ul蛋白酶，55°C水浴 30 150分钟；上述步骤②中，消化缓冲液的用量、消化温度和消化时间均经过发明人摸索改进， 提高消化的效果，尤其针对保存期限较长的样品，改进效果尤其明显。③提取在480ul提取剂中加入IlOOul无水乙醇，加入离心管中，用吸头反复吹打直到组织没有成团，90%的组织碎裂，呈白色云雾状为止；准备一个带滤柱的收集管，加 700ul混合液，9000rpm离心30秒，再加剩余液体，再9000rpm离心30秒，弃滤液；加700ul 洗液l,9000rpm离心30秒，加500ul洗液2/3，9000rpm离心30秒，弃滤液，再9000rpm离心30秒，弃滤液；该步骤中的离心转数均较试剂盒降低，可以更好的保护滤柱。④纯化95°C水浴预热无核酸酶水，准备DNase混合液6ul IOx DNA酶缓冲液， 4ul DNA酶，50ul无核酸酶水；加60ul DNA酶混合液到滤柱中央，室温静置30分钟，加 700ul洗液1室温静置30 60秒，9000rpm离心30秒，弃滤液，加500ul洗液2/39000rpm离心30秒，弃滤液，再加500ul洗液2/3，9000rpm离心60秒，弃滤液；用新的收集管，加60ul的预热的无核酸酶水，室温静置2 3分钟，12000rpm离心1分钟，反复收集一次。上述步骤④中，95°C水浴预热无核酸酶水是试剂盒方法中没有的步骤，可以增加 RNA的提取浓度。此步骤中离心转数也有所降低，更好地保护滤柱，保证滤过效果。上述本方法中所述及的Recoverall Total Nucleic Acid Isolation Kit，购自美国Ambion公司，货号AM1975。本发明的上述方法中步骤②所述的消化缓冲液和蛋白酶，步骤③所述及的提取剂、带滤柱的收集管以及步骤④所述及的IOx DNA酶缓冲液，DNA 酶，洗液1和洗液2/3均为试剂盒中提供，所对应的试剂盒中相应产品分别是提取齐[J :isolation additive ；IOx DNA 酶缓冲液IOxDNase buffer ；DNA 酶Dnase;洗液1 :washl ；洗液2/3 :wash2/3。上述本发明的方法所述的无核酸酶水，Thermo kientific产品，购自Hyclone，货号:SH30538. 01 ；上述本发明的二甲苯(分析纯，AR)，购自天津市凯信化学工业有限公司，产品批号2010年9月10日；上述本发明的无水乙醇(分析纯，AR) ,10009218，购自国药集团化学试剂有限公司，产品批号:20091105o以下的实施例用于进一步说明本发明。实施例1样品RNA提取本实施例的材料为人卵巢癌的福尔马林固定石蜡包埋组织，本实施例中1Μ、2Μ、 3皿、411、511、811、1011、1说、2￥、3￥、4￥、5￥、6￥，分别代表了组织从固定包埋开始到进行实验的保存时间分别为1个月，2个月，3个月，4个月，5个月，8个月，10个月，11个月，2年，3年，4 年，5年，6年。1年内的标本21个依次编号为1 21。2 6年的标本21个依次编号为22 42。该编号系统也适用于本说明书其它实施例。用本发明的方法从上述42个标本中提取RNA，经过核酸微量测试仪(品牌 NanoVue Plus , GE Healthcare产品，美国，型号=28923216)测定的浓度及纯度如下表1 表 权利要求
1.从石蜡包埋组织中提取总RNA的方法，包括如下步骤①脱蜡将待处理的石蜡包埋组织切成厚度为20μ m的组织片，取4片组织片置于无菌的1.5ml离心管内，加入Iml 二甲苯，漩涡震荡混勻，50°C水浴3分钟，室温条件下， 14000rpm,弃上清，重复操作1 3次；加Iml无水乙醇，混勻，室温条件下，HOOOrpm离心 2 4分钟，弃上清，重复操作2次，所得样品室温空气干燥15 30分钟；②消化向步骤①所得样品中加入400ul消化缓冲液和4ul蛋白酶，55°C水浴30 150 分钟；③提取在480ul提取剂中加入IlOOul无水乙醇，加入离心管中，用吸头反复吹打直到组织没有成团，90%的组织碎裂，呈白色云雾状为止；准备一个带滤柱的收集管，加700ul 混合液，9000rpm离心30秒，再加剩余液体，再9000rpm离心30秒，弃滤液；加700ul洗液 l,9000rpm离心30秒，加500ul洗液2/3，9000rpm离心30秒，弃滤液，再9000rpm离心30秒，弃滤液；④纯化提前95°C水浴预热无核酸酶水，准备DNase混合液6ulIOxDNA酶缓冲液，4ul DNA酶，50ul无核酸酶水；加60ul DNA酶混合液到滤柱中央，室温静置30分钟，加700ul洗液1室温静置30 60秒，9000rpm离心30秒，弃滤液，加500ul洗液2/39000rpm离心30 秒，弃滤液，再加500ul洗液2/3，9000rpm离心60秒，弃滤液；用新的收集管，加60ul的预热的无核酸酶水，室温静置2 3分钟，12000rpm离心1分钟，反复收集一次。
2.权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤①中采用二甲苯对待处理的石蜡包埋组织进行脱蜡的操作根据样品的石蜡含量调整次数石蜡含量高于50%时，重复操作3次； 石蜡含量30 50%时，重复操作2次；石蜡含量低于30%时，操作1次。
全文摘要
一种从石蜡包埋组织中提取总RNA的方法，该方法是在试剂盒的基础上所提出的改进方法，包括脱蜡、消化、提取和纯化的步骤。采用本发明的方法，可以提取出保存时间最长达6年的石蜡包埋保存的组织样品中的RNA，经过核酸微量测试仪和国际公认的Agilent 2100bioanalyzer分析，提取的浓度在211-3116ng/μl，提取纯度A260/2801.75-2.04，都非常理想，可以进一步进行mRNA及miRNA水平的qRT-PCR和miRNA的microarray的高丰度基因的表达研究，这对于开展大量FFPE的基因研究提供了实验基础，具有广阔的应用价值。
文档编号C12N15/10GK102181431SQ20111005947
公开日2011年9月14日 申请日期2011年3月11日 优先权日2011年3月11日
发明者丁艳芳, 崔世英, 赵瑾瑶 申请人:大连医科大学