专利名称：一种农杆菌介导的大豆转基因方法
技术领域：
本发明涉及一种采用农杆菌介导的大豆转基因方法，属于农业生物技术领域。
背景技术：
植物基因工程是大豆遗传改良的的重要途径。近几年来转基因植物与日俱增， 转化方法也得到了快速的发展。大豆转基因的方法主要有农杆菌介导法、基因枪法、电激法、PEG ( polyethylene glycol,聚乙二醇)法、超声波辅助农杆菌转化法和花粉管通道法等。大豆是公认难转化的植物，转基因的困难主要是转化率低、重复性差、基因型局限等问题，目前主要是靠大量的转化受体来获得转基因植株。目前普遍采用的农杆菌介导的大豆转基因体系包括子叶节法、下胚轴法、胚尖法等转化方法存在周期长，一般至收获种子需 6-8个月，生根、移栽过程成功率低，并且转化率低于10% 。因此，进一步研究建立新的、 高效稳定的大豆转基因体系是十分必要的。本项发明一种农杆菌介导的大豆转基因方法， 是在水培养条件下完成转化，其转化周期短，获得当代种子仅需3-4个月，培养液用量少， 转化效率可达15-25%，节省了大量时间、人员、财力、物力。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种农杆菌介导的大豆转基因方法。为解决上述技术问题，提供如下技术方案
将萌发的大豆种子移入水培养箱中保湿光照培养，用含有目的基因的农杆菌进行侵染，侵染后包住子叶使其避光保湿培养，见光后每隔一天滴加芽诱导液于子叶节部位保湿培养约1-2周分化不定芽，筛选获得阳性再生苗，继续培养成株后收获种子。本发明具体步骤如下
(1)水培法转化体系选取饱满的大豆种子，于暗下25°c萌发，3天后移入水培箱中保湿光照培养，2天后去除顶芽及侧芽，并沿脉络划3-5道伤口，将两片子叶合拢用parafilm 膜包住子叶下1/2至下胚轴处，用含有目的基因的农杆菌侵染液滴入两片子叶缝隙中进行侵染；
(2)水培法共培养步骤侵染后用锡纸罩住子叶使其避光，在水培箱中20-25°C保湿培养，3天后去除锡纸；
(3)水培法芽诱导步骤每天或隔天滴加芽诱导液于子叶节部位，在水培箱中20-25°C 保湿培养约1-2周分化不定芽；
(4)阳性芽筛选a)有选择标记载体的鉴定利用一定浓度筛选标记物质涂抹伸长芽的叶片，2-3天去除阴性不定芽，直至筛选出阳性伸长芽；然后连根整体移入土中正常培养；b)无选择标记载体的鉴定去除每株首先伸长的3个不定芽，留取第4个不定芽，连根整体移入土中正常培养；
(5)PCR鉴定提取阳性伸长枝的叶片DNA进行PCR鉴定。所述大豆品种为合丰35、合丰45、合丰55、黑河38、黑河48、黑农44、黑农48、黑农51、绥农观、垦丰16、东农44、东农47、东农48、东农53、东农50、东农8004中任——种。所述避光保温培养时间优选为3天。所述水培箱由水培容器、通气装置、植株固定装置、保湿和避光装置组成，是在液体环境培养下对大豆进行农杆菌侵染、共培养、芽诱导、筛选。所述水培溶液为适合大豆正常生长的培养液，包括大豆生长所需的大量元素、微量元素及其它调节生长的物质。所述种子萌发可在培养箱中水催芽萌发，也可以在土、蛭石或其他培养基质中萌发，然后再移入水培环境中。所述侵染子叶用parafilm膜包住使两片子叶保持合拢，适合侵染液直接滴入，避免侵染液的下流，同时起到避光的作用。侵染液可加入乙酰丁香酮类物质以提高转化率。所述共培养后不需要去除侵染菌液，直接进行芽诱导，诱导液中添加植物生长调节剂6BA(6-BenZylamin0pUrine，6苄基腺嘌呤)等促进丛生芽分化的物质，以促进分化。芽诱导液的施用时间从共培养结束至筛选出阳性伸长枝为止，阴性植株的去除是从不定芽的基部切除。所述芽侵染液、芽诱导液、筛选物质可添加表面活性剂SILWET -77等，其目的在于提高附着能力。本发明具有如下优点
1.采用本发明提供的方法进行大豆转基因，转化效率高达15%_34%；
2.本发明方法转化周期短，从侵染到PCR检测需要40-50天，整个周期获得种子仅需要3-4个月；
3.TO代(转基因当代)结实率高、种子数量多；
4.本方法成本低，仅需要0.5-1L芽诱导培养液，需要植物生长调节物质微量；
5.操作步骤简单，不需继代、生根等操作；
6.培养环境要求低，不需要组培室，超净台等设备，并且植株受病虫害、菌污染几率小， 营养成分方便控制；
7.本方法适用于不同大豆基因型，都能获得较高的遗传转化效率。
图1 水培养装置结构图
A 气泵通气管；B 植株支架；C 固定漂浮板；D 保湿膜；E 水培箱；F 遮光布图2:草丁膦抗性表现图3 Bar引物(403bp)扩增电泳部分结果
M: 2000plusII; 1:质粒；2:阴性对照；3:水对照；4-16: PPT (phosphinothricin，草丁膦)阳性植株图4: Southern杂交鉴定转基因植株 1 质粒，2 非转基因，3-4 转基因植株图5 =Real-Time PCR检测T2代(转基因第二代)基因表达图6 利用PPT (草丁膦)筛选阳性植株图7 Bar引物(403bp)扩增电泳部分结果M: DL15000; 1-45: PPT (phosphinothricin，草丁膦)阳性植株；46 水对照；47:质粒；48:阴性对照。
具体实施例方式材料和方法
补充培养基成分
MS (Murasbige和Skoog)基本培养基调至ρΗ5· 8 ； MSl :1/4MS ；
MS2 :1/2MS+1. 67mg/L 6BA+lg/L L-cys + 1. 58g/L Na2S203+l. 54g/L DTT+lOOuM AS+0. 5%o SILWET-77 ；
MS3 :l/2MS+2mg/L 6BA+0. 5%0 SILffET -77 ；
YEB =Beef extract (牛肉浸膏)5g/L ;Yeast extract (酵母膏)lg/L ;P印tone (蛋白胨)5g/L ；Sucrose (蔗糖)5g/L ；MgS04 · 7H20 (硫酸镁)0. 04g/L ；pH 7. 4 实施例1
受体材料准备挑取东农50饱满种子150粒，置于12cm培养皿中，上下各铺双层纱布， 加蒸馏水(约IOOml)刚好没过种子，于25°C培养箱暗下催芽萌发，取3天已伸长苗转至加 MSl培养液的水培箱中(图1)，25°C光照培养，2天后(子叶展开前)用刀片小心去除顶芽及侧芽，轻轻划3-5道伤口后，轻轻将子叶合拢，将子叶下部1/2至下胚轴处用parafilm包好作为受体。农杆菌制备将植物表达载体PCAMBIA3301-GmFB (用GmFB基因替换载体 PCAMBIA3301中的⑶S(β-glucuronidase，β -葡糖苷酸酶)产生)利用冻融法转化农杆菌ΕΗΑ105、EHAlOl和LBA4404，获得工程菌，所述农杆菌的制备手段为本领域常规技术手段，另外宿主菌ΕΗΑ105、ΕΗΑ101和LBA4404为商业化菌株。侵染液准备含有目的基因的工程农杆菌在YEB液体培养基培养至0D_=0. 8时， 取30ml于4000rpm离心5min ；用50ml的MS2重悬，将制备好的菌液沿子叶缝隙滴入，用锡纸包好子叶，保湿培养3天。芽诱导阶段去除锡纸，每天在伤口处滴加MS3芽诱导液，诱导新芽的分化生长， 分化的生长点处膨大，并不断分化出不定芽。随着不定芽的继续生长，长势旺盛的芽开始伸长生长。抗性枝筛选利用70mg/L的PPT (phosphinothricin,草丁膦)对分化后伸长芽的三出叶进行涂抹，2-3天后观察，叶片大面积失绿变黄的为不具有PTT抗性株表现(见图2)， 用剪刀从基部去除阴性植株，直至筛选得到叶片无明显变化的PPT抗性植株。PCR检测PPT阳性苗采用筛选标记Bar ( 403bp)和目的基因GmFB双重引物检测 PPT阳性苗，电泳图见图3。引物序列如下
Bar sense: 5' GCGGTACCGGCAGGCTGAAG 3' Bar antisense: 5' CCGCAGGAACCGCAGGAGTG 3' 35S-GmFB- sense: 5' CCCGAGCAATAATCTCCAGG3' 35S-GmFB antisense 5' ATTCAACATACGCAGCAACT3，。移栽将PCR阳性苗移至土壤中正常培养。TO代植株避免了传统组培方式的继代、再生根，获得的植株更接近于实生苗，经在土中正常培养结实率高。阳性率统计经过用上述两种引物对阳性枝进行PCR检测，最终从48株PPT抗性枝中鉴定出20株阳性植株，阳性率为21. 1%，具体见表1、2。在进行PPT筛选时，去除阴性植株，选取阳性植株，获得的PPT阳性植株80%为第4、5个枝。若进行无筛选标记的转基因时，可去除首先长出的不定芽，保留第4个以后的不定芽。Southern杂交鉴定T2代转基因植株，通过X光片显影结果显示，基因以单拷贝和双拷贝形式插入到基因组中，杂交结果见图4
Real-Time PCR (实时荧光定量PCR)检测T2代基因表达通过实时定量PCR检测了 9 株T2代植株的基因表达情况，6株基因表达丰度显著增加，结果表明基因已经整合到基因组中并稳定表达，实时定量结果见图5。表1转化过程中的不同时期数目统计结果
权利要求
1.一种农杆菌介导的大豆转基因方法，其步骤如下(1)将萌发的大豆种子移入水培养箱中保湿光照培养，用含有目的基因的农杆菌侵染液对大豆伤口处理的生长点进行侵染；(2)侵染后包住子叶使其避光保湿共培养；(3)见光后每天或隔天滴加芽诱导液于子叶节部位保湿培养约1-2周分化不定芽；(4)筛选获得阳性芽，移栽土壤后继续生长发育，收获种子；步骤(1)- (3)在水培养箱中进行。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述大豆为合丰35、合丰45、合丰55、黑河 38、黑河48、黑农44、黑农48、黑农51、绥农沘、垦丰16、东农44、东农47、东农48、东农53、 东农50、东农8004中任——种。
3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述农杆菌侵染液采用MS2培养基，其组成如下(L) 50% MS, 1. 67mg 6 苄基腺嘌呤，Ig L-cys, 1. 58 g Na2S2O3,1. 54g 二硫苏糖醇， IOOuM乙酰丁香酮，0. 5%。表面活性剂SILWET-77。
4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述芽诱导液采用MS3培养基，其组成如下 (L) :50%MS,2mg 6苄基腺嘌呤，0.5%。表面活性剂SILWET -77。
5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述水培养箱由水培容器、通气装置、植株固定装置、保湿装置和避光装置组成。
6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，芽诱导液的施用时间是从共培养结束后至筛选出阳性伸长枝。
7.根据权利要求1所述方法，其特征在于，避光保温培养时间为3天。
8.根据权利要求1所述方法，其特征在于，筛选物质含有表面活性剂SILWET-77。
9.根据权利要求1所述方法，其特征在于，具体步骤如下(1)水培法转化体系选取饱满的大豆种子，于暗下25°C萌发，3天后移入水培箱中保湿光照培养，2天后去除顶芽及侧芽，并沿脉络划3-5道伤口，将两片子叶合拢用paraf ilm 膜包住子叶下1/2至下胚轴处，用含有目的基因的农杆菌侵染液滴入两片子叶缝隙中进行侵染；(2)水培法共培养步骤侵染后用锡纸罩住子叶使其避光培养3天，在水培箱中 20-25°C保湿培养，3天后去除锡纸；(3)水培法芽诱导步骤每天或隔天滴加芽诱导液于子叶节部位，在水培箱中20-25°C 保湿培养约1-2周分化不定芽；(4)阳性芽筛选a)有选择标记载体的鉴定利用一定浓度筛选标记物质涂抹伸长芽的叶片，2-3天去除阴性不定芽，直至筛选出阳性伸长芽；然后连根整体移入土中正常培养；b)无选择标记载体的鉴定去除每株首先伸长的3个不定芽，留取第4个不定芽，连根整体移入土中正常培养；(5)PCR鉴定提取阳性伸长枝的叶片DNA进行PCR鉴定。
全文摘要
一种农杆菌介导的大豆转基因方法，属于农业生物技术领域。本发明在液体培养条件下，利用农杆菌对萌发的大豆种子进行农杆菌侵染、共培养、芽诱导、筛选，利用筛选物质去除阴性枝，获得T0代阳性枝，继续培养后收获种子。本发明缩短了转化周期，获得转基因当代种子仅需3-4个月，并且提高了转化效率，T0代转化效率高达15-34%。同时，本方法适用于不同大豆品种资源或基因型，都能产生很高的转化效率。
文档编号C12N15/84GK102181479SQ20111005915
公开日2011年9月14日 申请日期2011年3月14日 优先权日2011年3月14日
发明者李文滨, 李永光, 赵琳 申请人:东北农业大学