专利名称：一种抗口蹄疫病毒重组活菌苗及其制备方法
技术领域：
本发明属于口蹄疫病毒防治技术领域，具体涉及以减毒猪霍乱沙门菌C500(仔猪副伤寒活菌苗)为载体的抗口蹄疫病毒重组活菌苗及其制备方法。
背景技术：
家畜口蹄疫(Foot-and-mouth disease，FMD)是当今世界上最为严重的家畜传染病，主要危害猪、牛、羊等偶蹄类动物，国际兽医局将口蹄疫列为A类传染病之首。多年来，口蹄疫在世界范围内大规模爆发和流行，给畜牧业造成巨大经济损失。根据免疫原性，口蹄疫病毒有A、O、C、SAT I、SATII、SATIII及AsiaI共7个血清型及65个以上的亚型。对口蹄疫的预防相当困难。目前主要有两种途径，第一种途径是通过物理和化学手段进行病毒灭活处理，并对爆发流行地区采取隔离和对邻近地区染病性牲畜及易感动物进行捕杀。第二种途径是进行广泛的免疫接种。本研究组自1983年便开始研究抗O型口蹄疫病毒的基因工程疫苗，先后在多肽疫苗和DNA疫苗的研究中取得了很好的效果。口蹄疫病毒主要经粘膜感染，而预防接种主要以注射为主。如果能通过口服途径免疫，则会筑起预防口蹄疫病毒感染的第一道防线，而且大大降低防治工作的人力成本。沙门菌(Salmonella)属肠杆菌科(Enteric bacilli)，是一种胞内侵袭性致病菌。沙门菌口服可以优先侵入和定居在肠相关淋巴组织(GALT)或PP结(Peyer’s Patches)中的特性有可能使其成为DNA疫苗和多肽疫苗的合适载体。为此，本发明以我国自行研制的猪霍乱沙门菌减毒株C500为受体菌，研究了口服口蹄疫病毒(FMDV)重组活菌疫苗，为预防猪、牛、羊等家畜的口蹄疫病毒病提供新的思路。
发明内容
本发明的目的是提出一种以减毒猪霍乱沙门菌为载体的抗口蹄疫病毒重组活菌苗及其制备方法。
本发明提出的以减毒猪霍乱沙门菌为载体的抗口蹄疫病毒重组活菌苗，由含有抗口蹄疫病毒能力的FMDV抗原表位的质粒和以减毒猪霍乱沙门菌C500(仔猪副伤寒活菌苗)为传递系统的载体组成。
本发明中含口蹄疫病毒抗原表位的质粒可以是用于制备DNA疫苗的真核质粒也可以是用于制备多肽疫苗的原核质粒。抗FMDV的抗原表位既可以来自O型、A型和Asia I，也可以是其中任何型之间的组合。
本发明提出的载体的抗口蹄疫病毒重组活菌苗的制备方法，包括基因制备、重组、重组活菌苗组建和活菌苗制备，具体步骤如下(1)用化学合成方法合成编码口蹄疫病毒抗原表位基因的DNA序列，并在DNA水平上连接成完整抗原基因，构成融合基因；(2)将融合基因插入表达质粒载体构建成真核表达质粒pBO1。将含有口蹄疫病毒疫苗基因的真核表达质粒pBO1经过中间宿主鼠伤寒沙门菌LB5010后，电转化到减毒的猪霍乱沙门菌C500中，构建成抗口蹄疫病毒的重组活菌苗pBO1/S.cho。
更进一步，本发明用血清凝集实验检测重组菌的沙门菌血清学特性，以保证减毒猪霍乱沙门菌C500自身作为疫苗的有效性；然后，将保存的菌种经活化后，按照约1％的接种量转接到三角瓶中静置培养，约6h以后，可得到2×109-5×109CFU/mL的培养物。采用人工灌服的方法给家兔口服免疫重组活菌苗。
本发明提出的疫苗在制备过程中，采用了化学合成、基因克隆、序列分析、基因重组等基因工程技术与方法。并用血清凝集实验、T细胞增殖实验和特异性抗体检测实验等免疫学方法检测该疫苗的效力。
本发明组建的重组活菌苗储存、使用方便。保存采用菌体冻干方式。既可以口服使用，又可以肌肉注射。用本发明组建抗O型口蹄疫病毒的重组活菌苗口服免疫家兔，检测重组菌在家兔体内诱导的免疫应答。家兔免疫后8周，分离脾脏T细胞，检测T细胞增殖情况。结果显示，口服pBO1/S.cho的家兔T细胞在1/40的FMDV特异性抗原的刺激下有明显的增殖反应，刺激指数SI＞11；免疫后2周和8周分别取家兔静脉血，用液相阻断ELISA法检测血清中针对FMDV的特异性抗体，pBO1/S.cho组家兔产生的抗体效价为1/32。
图1PCR方法鉴定转化子pBO1/S.cho。其中1.DNAMarker；2.pBO1/JM101的PCR产物 3.pBO1/S.cho的PCR产物；4.S.cho的PCR产物.
图2酶切方法鉴定转化子pBO1/S.cho。其中1.DNA Marker；2.受体菌S.cho 3.pBO1/JM101；4.转化子pBO1/S.cho图3口服重组DNA疫苗免疫家兔T细胞增殖检测。
具体实施例方式
化学合成O型FMDV的VP1基因中62ヘ120、423ヘ480位的DNA序列，串联成为423ヘ480-62ヘ120-423ヘ480的一级结构。将此片段克隆到真核载体pCDM8上，构建成pBO1。
然后将质粒pBO1用CaCl2法转化到中间宿主减毒鼠伤寒沙门菌LB5010中。从LB5010中提取质粒，再用电击法转化减毒猪霍乱沙门菌C500。挑取减毒猪霍乱沙门菌C500菌种于3mL LB液体培养基中，37℃200r/min振荡过夜；取250μL菌液，接种于25mL LB液体培养基中，37℃200r/min振荡培养至OD600＝0.6-0.7(约2-2.5h)；4℃，4000r/min离心10min收集菌体；0℃，10％甘油洗涤，4℃，4000r/min离心10min收集菌体，3次；最后一次洗涤后悬浮于1mL 10％甘油中，以每管200μL分装，-20℃冻存；取200μL感受态菌液放在冰上慢慢融化后，加入1μg DNA(对照不加DNA)，冰浴5min，使DNA吸附到细菌上，然后移入电转化杯中；利用Bio-Rad Gene Pulser电转化仪在2.0kV，25μF，200Ω电阻的条件下进行转化；电击后加入400μl LB液体培养基，50r/min慢慢摇动1.5h后，取部分转化液涂布在含有氨苄青霉素的平板上，37℃培养24h。
通过PCR初步鉴定重组菌(见附图1)。以载体上的序列为引物，转化的抗性菌落为模板，通过PCR初步鉴定转化子。从图1可见，PCR产物为2kb左右的特异性片段，与预期结果相符。
用HindIII单酶切鉴定质粒(见附图2)。用HindIII对初筛的转化子进行单酶切鉴定，得到约12.7kb的特异性条带。这说明质粒pBO1已经转入S.choC500，电转化成功。
用玻片凝集实验验证重组菌pBO1/S.cho的血清学特性，即具有免疫原性。
对家兔进行单剂量口服方式免疫。实验家兔共分三组，每组5只.pBO1/S.cho活菌和沙门菌空菌C500以口服方法进行，剂量均为100亿(次/只)。DNA疫苗pBO1按常规的注射方式免疫，用量为800μg(次/只)。(2)活菌苗制备从LB平板上接单菌落于25mL液体LB中培养，37℃静置18h；每2.5mL培养物接到含25mL液体LB的三角瓶中，静置6h以后，可得到2×109-5×109CFU/mL的培养物。实验中，用平板稀释计数法计算活菌数目。口服组接种前禁食12h，为了让家兔服到完全剂量的菌液，采用人工灌服的方法。口服后至少过30min才给食。
分别在免疫2周和8周时对家兔耳静脉取血和心脏取血，血液静置2h，3000r/min离心10min，将血清移入干净的1.5mL离心管中，每管0.5mL，-20℃冻存，液相阻断ELISA方法检测血清抗体(见附表1)。从表1可以看出，pBO1/S.cho、pBO1组家兔产生的中和抗体效价为1/32，对照组S.cho产生的中和抗体效价为阴性。
表1口服重组DNA疫苗免疫家兔的血清抗体效价
免疫8周后处死动物，在无菌条件下取家兔脾脏，磨碎，用淋巴细胞分离液分离出单个核细胞，用3H-TdR掺入法进行T细胞增殖检测(见附图3)。图3结果显示，pBO1/S.cho组家兔T细胞在1/40的O型FMDV特异性抗原的刺激下有明显的增殖反应，刺激指数SI＞11；而pBO1仅在1/20的稀释度有SI＝4.4的增殖反应；S.cho则在几个稀释度下均没有明显的增殖反应。这说明重组活菌苗在家兔体内诱导了特异性的T细胞应答。
权利要求
1.以减毒猪霍乱沙门菌为载体的抗口蹄疫病毒重组活菌苗，其特征在于重组活菌苗由含有抗FMDV抗原表位的质粒和以减毒猪霍乱沙门菌C500为传递系统的载体组成。
2.根据权利要求1所述的抗口蹄疫病毒重组活菌苗，其特征在于以抗FMDV的抗原表位构建的质粒是真核质粒或原核质粒。
3.根据权利要求1所述的抗口蹄疫病毒重组活菌苗，其特征在于抗FMDV的抗原表位来自O型、A型和Asia I或者其中任何型之间的组合。
4.一种以减毒猪霍乱沙门菌为载体的抗口蹄疫病毒重组活菌苗的制备方法，其特征在于(1)用化学合成方法合成编码口蹄疫病毒抗原表位基因的DNA序列，并在DNA水平上连接成完整抗原基因，构成融合基因；(2)融合基因插入表达质粒载体构建成真核表达质粒pBO1；将含有口蹄疫病毒疫苗基因的真核表达质粒pBO1经过中间宿主鼠伤寒沙门菌LB5010后，电转化到减毒的猪霍乱沙门菌C500中，构建成抗口蹄疫病毒的重组活菌苗pBO1/S.cho。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于还进一步(1)用血清凝集实验检测重组菌的沙门菌血清学特性，以保证减毒猪霍乱沙门菌C500自身作为疫苗的有效性；(2)将保存的菌种经活化后，按照约1％的接种量转接到三角瓶中静置培养，约6h以后，可得到2×109-5×109CFU/mL的培养物。采用人工灌服的方法给家兔口服免疫重组活菌苗。
全文摘要
本发明是一种以减毒猪霍乱沙门菌为载体的抗口蹄疫病毒重组活菌苗，用化学合成方法合成编码口蹄疫病毒抗原表位基因的DNA序列，并在DNA水平上连接成完整抗原基因，构成融合基因。融合基因插入表达质粒载体构建成真核表达质粒pBO1。然后将该真核表达质粒pBO1经过中间宿主鼠伤寒沙门菌LB5010后，电转化到减毒的猪霍乱沙门菌C500中，构建成抗口蹄疫病毒的重组活菌苗pBO1/S.cho。免疫家兔后，重组活菌苗pBO1/S.cho在家兔体内诱导了明显的T细胞增殖反应并检测到针对FMDV的特异性抗体。
文档编号C12N15/09GK1730650SQ20051002738
公开日2006年2月8日 申请日期2005年6月30日 优先权日2005年6月30日
发明者刘明秋, 严维耀, 郑兆鑫 申请人:复旦大学