专利名称：重组恶性疟原虫175kD红细胞结合抗原功能区蛋白及其制法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及DNA重组技术和基因工程疫苗领域。更具体地，本发明涉及一种含恶性疟原虫175kD红细胞结合抗原功能区重组蛋白，编码该重组蛋白的DNA序列，含该DNA序列的载体，含该载体的宿主细胞，用基因工程制备该重组蛋白的方法，以及该重组蛋白在作为药物靶蛋白以及发展疟疾疫苗方面的应用。
背景技术：
疟疾是人类最古老的传染病之一，目前仍严重影响人类的健康。据世界卫生组织(WHO)的最新调查，约世界人口的40％仍处在疟疾威胁之中，分布于100多个国家。目前世界上每年有3至5亿人罹患疟疾，其中约300万人死亡。更为严重的是，由于疟原虫及蚊媒抗药性的产生和迅速扩散，疟疾不仅没有得到有效控制，反而有卷土重来之势。因此，开展全球遏制疟疾计划已成为WHO在新世纪两个重点研究领域之一。
人们在疟疾防治中依靠或期望获得突破的主要有三个途径抗疟药、疟疾疫苗和蚊媒防制。但抗疟药及蚊媒防制面临着巨大的困难和挑战，这是因为疟原虫及蚊虫抗药性的产生和扩散。尽管目前尚未有应用价值的疟疾疫苗问世，但普遍认为发展疟疾疫苗是人类控制乃至消灭疟疾的重要途径。
大量研究表明，疟疾是可以通过研制有效的疫苗而实现预防的。如用灭活子孢子免疫的志愿者能完全保护后来的攻击感染。再如用鼠疟原虫的重组抗原免疫小鼠，亦能完全保护后来同种疟原虫的攻击感染。此外，疟疾流行病学研究也显示，死于疟疾的主要是无疟疾免疫力的人群，如在疟区的儿童和非疟区人群进入疟区，而在疟区的成人很少因疟疾而死亡。如给这些无免疫力的人群接种有效的疫苗，使其达到与疟区成人同样的免疫力，这样就能实现预防疟疾和降低疟疾死亡率的目标。因此，疟疾疫苗研制已成为当今世界性热点课题。
在疟疾疫苗研究中，有两个候选疫苗的研究曾受到广泛关注，一是抗子孢子疫苗。该疫苗能抑制子孢子入侵肝细胞。但在后来的临床试验中效果不佳。据分析，其主要原因是该疫苗只产生抗子孢子免疫力，这样即使有极个别子孢子逃避该疫苗免疫攻击而幸存下来，就能入侵并在肝细胞生长繁殖，产生足够的裂殖子引起宿主致病。另一个是SPf.66多价合成肽疫苗。该疫苗是一个只有3个10肽表位通过疏水氨基酸相隔连接而成45肽的多聚物[Patarroyo，M.E.，et al，induction of protective immunity against experimental infection with malaria suingSynthetic peptides，Nature，328629，1987]。该疫苗在夜猴攻击试验中曾取得了较好的免疫保护效果，但后来在非洲、东南亚及南美洲的现场试验中未能取得理想的临床效果，没有应用价值。该疫苗失败的原因可能是SPf.66只有45肽，而在如此短肽序列中，可能不会有足够的T细胞表位能与多数个体MHC分子结合，导致抗原提呈受阻。
175kD红细胞结合抗原(EBA-175)是恶性疟原虫在红内期裂体增殖时合成并在裂殖体破裂时释放入血的一种可溶性蛋白。对EBA-175的研究表明，它在恶性疟原虫的生活史中可能是一个很重要的功能蛋白。然而，虽然曾有人在大肠杆菌中表达过175kD红细胞结合抗原(EBA-175)，但是表达的EBA-175却没有免疫原性。另外，出于某种未知原因，虽然有人尝试在酵母等真核细胞中表达EBA-175，但却尚没有成功地表达的175kD红细胞结合抗原的报道。因此，人们一直认为EBA-175无法作为抗疟疾的免疫原实施应用。
综上所述，尽管以生物技术为基础的疟疾疫苗研究已进行了近20年，但至今尚无有应用价值的疫苗问世。
因此，本领域迫切需要开发抗疟疾的有效免疫原和相关疫苗。
发明内容
本发明的一个目的就是提供一种新的可用于疟疾疫苗的免疫原。所述免疫原是含恶性疟原虫175kD红细胞结合抗原功能区(PfEBA175-IIF2)的重组蛋白。
本发明的一个目的是提供该免疫原的制法、用途以及含该免疫原的疫苗组合物。
在本发明的第一方面，提供了一种重组蛋白，它包含恶性疟原虫175kD红细胞结合抗原功能区IIF2的氨基酸序列，并且具有唾液酸依赖的红细胞结合功能。更佳地，所述的重组蛋白具有SEQ ID NO2中1-314位或1-320位所示的氨基酸序列。
在本发明的第二方面，提供了一种分离的DNA分子，它编码本发明的上述重组蛋白。更佳地，所述的DNA分子包括SEQ ID NO1中所示的核苷酸序列(包括1-960位或1-963位)。
在本发明第三方面，提供了含有上述DNA分子的载体，以及含所述载体的宿主细胞。
在本发明的第四方面，提供了一种产生本发明的重组蛋白的方法，它包括步骤在适合表达所述重组蛋白的条件下，培养上述的宿主细胞，从而表达出所述的重组蛋白；和分离所述的重组蛋白。
在本发明的第五方面，提供了一种组合物，它含有本发明所述的重组蛋白或其编码DNA分子和药学上可接受的载体。
在另一优选例中，所述的组合物是疫苗组合物。
在本发明的第六方面，提供了一种抗体，它特异性地结合于本发明的重组蛋白。
在本发明的第七方面，提供了一种本发明重组蛋白或恶性疟原虫175kD红细胞结合抗原功能区(PfEBA175-IIF2)的用途，它被用于制备预防疟疾疫苗。
图1显示了PfEBA175-IIF2重组蛋白示意图和合成示意图。
其中，APfEBA175-IIF2重组蛋白示意图。
图中显示PfEBA175-IIF2在全长PfEBA175分子中的位置。
SP信号肽；I～VI全长Pf EBA175分子的六个区；TM跨膜区；CYT胞质区；B重组蛋白基因Pfeba175-IIf2的合成示意图。
Pfeba175-IIf2基因的合成959bp Pfeba175-IIf2基因分成12个寡核苷酸片段，用不对称PCR法分步进行基因拼接。基因5’和3’分别加上XhoI和EcoRI位点用于基因片段的克隆。各合成片段克隆在pBluscript载体进行序列分析。
图2全长Pfeba175-IIf2基因的琼脂糖凝电泳图。
电泳显示Pfeba175合成基因条带(泳道1)。
图3免疫印迹法检测PfEBA175-IIF2的表达的电泳图及与红细胞的结合反应。
用疟疾疫区现场人血清进行检测。其中，泳道1为诱导72小时后的上清。泳道2与大鼠红细胞的结合反应；泳道3与人红细胞的结合反应；泳道4与神经胺酸酶处理的人红细胞的结合反应；泳道5与胰蛋白酶处理的人红细胞的结合反应；泳道6与兔红细胞的结合反应；泳道7与小鼠红细胞的结合反应；1.泳道8为诱导前的培养上清。
图4是SDS-PAGE测定PfEBA175-IIF2的表达。
在诱导前0hr(泳道2)及诱导后12(泳道3)、24(泳道4)和48小时(泳道5)取培养上清15μl进行SDS-PAGE分离和考马斯亮蓝染色。在35KD处出现一条目的蛋白。泳道1为分子量标准。
图5是纯化的PfEBA175-IIF2重组蛋白的SDS-PAGE电泳图。
表达上清分离后，用Ni柱和HPLC上胶层析两步纯化，经SPS-PAGE测定获得目的蛋白纯度大于95％。泳道17.5μg；泳道215μg。
图6显示了PfEBA175-IIF2与疟疾疫区病人血清的结合反应情况。
以PfEBA175-IIF2重组蛋白包被，以1∶200稀释的疟疾疫区病人血清为一抗，进行ELISA检测。结果显示，83％的病人血清(65例)的OD值在cutoff值以上(0.084)。这表明，自然感染疟原虫的人群产生的针对天然PfEBA175-IIF2的抗体能够很好地识别PfEBA175-IIF2重组蛋白，进一步反应了PfEBA175-IIF2重组蛋白与天然蛋白在构象上很接近。
图7显示了用ELISA法测定免疫兔血清PfEBA175-IIF2特异IgG的水平。
图8显示了用ELISA法测定免疫鼠血清PfEBA175-IIF2特异IgG的水平。各组分别为◆IIF2单独免疫；■IIF2联合免疫；▲PfCP2.9单独免疫；×PfCP2.9联合免疫。
图9显示了免疫血清抑制疟原虫体外生长效率-1。
其中两组分别是1 ISA720佐剂+Pf EBA175-IIF2和ISA720佐剂+Pf CSP阴性对照蛋白(均为15％血清浓度)。
图10显示了免疫血清抑制疟原虫体外生长效率-2。
其中各组分别是A.免疫猴抗血清中特异的IgG的体外抑制率B.免疫兔抗血清中特异的IgG的体外抑制率。
具体实施例方式
本发明人经过深入而广泛的研究，通过对175kD红细胞结合抗原不同区段的改造以及对表达系统的优化，首次成功地在酵母系统中制得了含175kD红细胞结合抗原功能区IIF2且具有免疫原性的重组蛋白。测试表明，该重组蛋白可有效地引起免疫应答，具有唾液酸依赖的红细胞结合功能等生物学特性，在构象上与175kD红细胞结合抗原的天然构象相似。在此基础上完成了本发明。
175kD红细胞结合抗原(EBA-175)是恶性疟原虫在红内期裂体增殖时合成并在裂殖体破裂时释放入血的一种可溶性蛋白，由616个氨基酸残基组成。
EBA-175是由Camus和Hardley在1985年首次报道的，该抗原是恶性疟原虫在红内期裂体增殖时合成并在裂殖体破裂时释放入血的一种可溶性蛋白，该蛋白N-末端为信号肽序列，含有一个跨膜区以及C-末段的胞内区，胞外区可分为6个区域，其中II区和VI区为富含半胱氨酸区，II区含两个拷贝的富含半胱氨酸区(图1A)。
研究表明，在六种不同的恶性疟原虫分离株中均发现EBA-175，而所有这些分离株与EBA-175肽4抗血清和SAR175抗血清(从感染CAMP分离株之夜猴中制备)产生非常一致的阳性反应表明。这提示，也许不同株EBA-175分子之间存在细微差异，但主要功能域在蛋白结构及构象上是保守的，在生物化学及免疫学性质上是极其相似的。
EBA-175抗原有两个重要特征一是它能与人红细胞血型糖蛋白的唾液酸特异结合，二是它能与裂殖子结合。在EBA-175中存在与红细胞上受体结合的功能域。EBA-175的N端富含半胱氨酸的II区是EBA-175与红细胞以唾液酸依赖的方式结合的功能区。II区由两个重复片段F1和F2片段组成，F2片段是其与红细胞结合的区域，它与红细胞结合的方式与全长EBA-175蛋白相同。
如本文所用，术语“175kD红细胞结合抗原功能区II区F2片段”、“175kD红细胞结合抗原功能区IIF2”或“EBA-175IIF2”可互换使用，都指175kD红细胞结合抗原功能区II区的F2片段。该片段的序列是已知的，例如GenBank登录号U32207中的第447-760位氨基酸。
如本文所用，术语“175kD红细胞结合抗原功能区的重组蛋白”、“EBA-175IIF2重组蛋白”等可互换使用，都是指由恶性疟原虫175kD红细胞结合抗原功能区IIF2的氨基酸序列构成的蛋白。此外，175kD红细胞结合抗原功能区的重组蛋白包括含有或不含有信号肽，以及含有或不含有起始甲硫氨酸的重组蛋白。
如本文所用，术语重组蛋白中“疟原虫175kD红细胞结合抗原功能区IIF2的氨基酸序列”指在本发明重组蛋白中的氨基酸序列，该序列与天然的或变异的疟原虫EBA-175IIF2片段具有基本上相同的氨基酸序列，并且具有与天然疟原虫EBA-175基本上相同的抗原活性及唾液酸依赖的红细胞结合功能等生物学特性。优选的疟原虫EBA-175IIF2氨基酸序列包括(但并不限于)天然的EBA-175胞外区中II区的第二个富含半胱氨酸区的氨基酸序列，及其消除了糖基化位点的该氨基酸序列。
此外，在EBA-175IIF2重组蛋白的N端或C末端还可添加其他不影响EBA-175IIF2免疫原性和红细胞结合功能等生物学特性的氨基酸序列。较佳地，这些添加的氨基酸序列有利于表达(如信号肽)，有利于纯化(如6xHis序列、酿酒酵母α-因子信号肽切割位点(Glu-Lys-Arg))，或可促进EBA-175IIF2重组蛋白的免疫原性(例如IL-2、GM-CSF等细胞因子的序列)。
编码本发明重组蛋白的DNA序列，可以全部人工合成。也可用PCR扩增或合成的方法获得EBA-175IIF2的编码DNA序列，形成编码本发明重组蛋白的DNA序列。
为了提高宿主细胞的表达量，可以对EBA-175IIF2重组蛋白编码序列进行改造，例如采用宿主细胞偏好的密码子，消除不利于基因转录及翻译的序列。在本发明的一个实施例中，就采用酵母偏好的密码子，对EBA-175IIF2重组蛋白基因进行检测，排除在基因中不利于基因转录及翻译的序列，包括内含子剪切位点，转录终止序列等，从而获得了利于在酵母中表达的编码序列。
在获得了编码本发明重组蛋白的DNA序列之后，将其连入合适的表达载体，再转入合适的宿主细胞。最后，培养转化后的宿主细胞，通过分离纯化得到本发明的新的重组蛋白。
如本文所用，术语“载体”包括质粒、粘粒、表达载体、克隆载体、病毒载体等。
在本发明中，可选用本领域已知的各种载体如市售的载体。比如，选用市售的载体，然后将编码本发明新重组蛋白的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，可以形成蛋白表达载体。
如本文所用，“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻近，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。
在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞，昆虫细胞、和哺乳动物细胞。较佳地，该宿主细胞是真核细胞，更佳地是酵母细胞。
在获得转化的宿主细胞后，可在适合表达本发明重组蛋白的条件下培养该细胞，从而表达出重组蛋白。然后再分离出表达的重组蛋白。
另一方面，本发明还包括对EBA-175IIF2重组蛋白或其编码DNA具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于EBA-175IIF2重组蛋白或片段。较佳地，指那些能与EBA-175IIF2重组蛋白或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的EBA-175IIF2重组蛋白结合的抗体。
本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab’或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子；或嵌合抗体。
本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的EBA-175IIF2重组蛋白或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达EBA-175IIF2重组蛋白或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人，Nature256；495，1975；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6511，1976；Kohler等人，Eur.J.Immunol.6292，1976；Hammerling等人，In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。
多克隆抗体的生产可用EBA-175IIF2重组蛋白或多肽免疫动物，如家兔，小鼠，大鼠等。多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于福氏佐剂等。
在本发明的另一方面，提供了含有本发明重组蛋白作为免疫原的组合物，尤其是疫苗组合物，所述的组合物含有0.001-99.9wt％所述的重组蛋白，(b)药学上可接受的载体和(c)任选的佐剂，其中各组分之和为100wt％。本发明的疫苗可以是预防性的(即预防感染)或治疗性的(即在感染后治疗疾病)。
这些疫苗包含免疫性抗原或免疫原、免疫原性多肽、蛋白或蛋白片段、或核酸(如核糖核酸或脱氧核糖核酸)，通常与“药学上可接受的载体”组合，这些载体包括本身不诱导产生对接受该组合物的个体有害的抗体的任何载体。合适的载体通常是大的、代谢缓慢的大分子，如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、氨基酸聚合物、氨基酸共聚物、脂质凝集物(如油滴或脂质体)以及无活性的病毒颗粒。这些载体是本领域普通技术人员所熟知的。另外，这些载体可起免疫刺激剂(“佐剂”)作用。
增强组合物效果的较佳的佐剂包括但不局限于(1)铝盐(alum)，如氢氧化铝、磷酸铝、硫酸铝等；(2)ISA720佐剂；(3)福氏佐剂等。
疫苗组合物(包括抗原，药学上可接受的载体和/或佐剂)，通常含有稀释剂，如水，盐水，甘油，乙醇等。另外，辅助性物质，如润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质等可存在于这类运载体中。此外，包括免疫原性组合物在内的疫苗组合物可含有在药学上可接受载体中的抗原、多肽、蛋白、蛋白片段或核酸。
更具体地，包括免疫原性组合物在内的疫苗，包含免疫有效量的免疫原性多肽，以及上述其它所需的组分。“免疫有效量”指以单剂或连续剂一部分给予个体的量对治疗或预防是有效的。该用量根据所治疗个体的健康状况和生理状况、所治疗个体的类别(如非人灵长类等)、个体免疫系统合成抗体的能力、所需的保护程度、疫苗的配制、治疗医师对医疗状况的评估、及其它的相关因素而定。预计该用量将在相对较宽的范围内，可通过常规实验来确定。
通常，可将疫苗组合物或免疫原性组合物制成可注射剂，例如液体溶液或悬液；还可制成在注射前适合配入溶液或悬液、液体赋形剂的固体形式。该制剂还可乳化或包封在脂质体中，在上述药学上可接受的载体下增强佐剂效果。
常规方法是从肠胃外(皮下或肌内)途径通过注射给予免疫原性组合物。适合其它给药方式的其它配方包括口服、栓剂和透皮应用等。治疗剂量可以是单剂方案或多剂方案。疫苗可以结合其它免疫调节剂一起给予。
一种疫苗方式是DNA疫苗，即含有编码本发明重组蛋白的编码序列的DNA疫苗。
在本发明的一个实例中，全合成了恶性疟原虫175kD红细胞结合抗原功能区基因，并在毕氏酵母中分泌表达该抗原，经分析其构象非常接近天然构象。该抗原的免疫血清能有效抑制疟原虫生长，且具有唾液酸依赖的红细胞结合功能等生物学特性。
本发明的主要优点在于(1)本发明的EBA-175IIF2重组蛋白，其构象非常接近天然蛋白构象，并具有唾液酸依赖的红细胞结合功能等良好的生物学特性。
(2)EBA-175IIF2重组蛋白的表达产物能分泌到胞外，并进入无蛋白培养上清，便于分离纯化，纯度可达95％以上。
(3)EBA-175IIF2重组蛋白的表达水平高。摇瓶表达量为20mg/L，而15L发酵表达产量可达300mg/L。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989或中国专利申请CN01105292.9)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1PfEBA-175IIF2基因的合成1.1.Pfeba-175IIf2全合成基因的设计重组EBA-175IIF2蛋白的序列来自恶性疟原虫3D7株175kD红细胞结合抗原功能区EBA-175IIF2的氨基酸序列。选用毕氏酵母密码子使用频率，将该序列进行重新设计。采用计算机软件“DNA Star”、Omiga等分析并排除在该基因序列中存在的可能不利于基因转录及翻译的任何序列，如转录终止序列、内含子剪接位点序列、长的反向重复序列等。此外，在新设计的eba-175IIf2基因的5′和3′端分别增设XhoI和EcoRI酶切位点，以便能与表达载体连接。鉴定出该抗原序列中一个潜在糖基化位点，并通过将糖基化位点氨基酸Asn转为Gln(见SEQ ID NO2)，从而排除这一个糖基化位点。
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1.2.Pfeba-175IIf2全合成基因的的合成参见图1B。将eba-175IIf2合成基因序列分成12条寡核苷酸链，从5′到3′依次命为eba-175IIf2-1至eba-175IIf2-12，相邻两个寡核苷酸链之间有约16至20碱基的重叠部分。采用基因软件Oligo 4.0分析相邻寡核苷酸链间重叠部分序列，以排除不利于寡核苷酸链拼接的序列，如发夹结构等。
用PCR方法将12条链拼接成双链DNA分子。PCR扩增条件为95℃10秒(变性)、55℃30秒(退火)和72℃1分30秒(延伸)，每次25个循环，产生959bp全长eba-175IIf2合成基因。PCR产物用1％琼脂糖胶分离，并用QIAGEN DNA回收试剂盒分离目的基因(图2)。用XhoI和EcoRI双酶切目的基因片段，酶切条件为在20μl反应体系中含有2μg目的基因片段，1×酶切缓冲液，XhoI及EcoRI酶各5单位，37℃反应1小时。酶切片段与经同样酶切的pBluscript载体连接，并转化感受态DH5α大肠杆菌。抽提氨卞青霉素抗性菌落的质粒DNA，经双酶切鉴定为正确插入后进行DNA序列分析。以排除合成时的错误碱基。
将含全长无错误的合成基因的质粒转入大肠杆菌DH5α，经反复接种培养后，回收该质粒并进行序列分析，结果在eba-175IIf2基因中无发现碱基突变。表明该合成基因能稳定存在大肠杆菌中。
测序后的Pfeba-175IIf2序列如SEQ ID NO1所示。
为使Pfeba-175IIf2基因能在毕氏酵母中分泌表达，将该基因5′端进行修饰，即在该基因的5′端加上酿酒酵母α-因子信号肽前导序列的部分序列，包括信号肽切割识别氨基酸Lys-Arg-Glu-Ala-Glu-Ala的密码子序列(核苷酸序列为aaa agagag gct gaa gct)。在Pfeba-175IIf2基因的5′及3′端分别含有XhoI及EcoRI位点用于该基因克隆入表达载体。
实施例2Pfeba-175IIf2基因在毕氏酵母中分泌表达2.1表达载体的构建Pfeba-175IIf2基因通过XhoI和EcoRI位点插入到pPIC9酵母表达质粒(购于lnvitrogen公司)。这样，PfEBA-175IIF2的N端与该载体上酿酒酵母α-因子信号肽C末端融合。由于PfEBA-175IIF2分子N端含有该信号肽切点三个特异氨基酸Glu-lys-Arg序列。故分泌表达释放的目的蛋白不含信号肽序列。
pPIC9K载体的基本元件与pPIC9相同，但它带有卡那霉素抗性基因，可用G418进行高拷贝插入子的筛选。这样，用BamHI和SalI将含Pfeba-175IIf2片段切出并插入pPIC9K表达质粒(购于lnvitrogen公司)的相应位点中，构建成pPIC9K/Pfeba-175IIf2。
2.2转化毕氏酵母SMD1168用SalI将pPIC9K/Pfeba-175IIf2质粒线性化，10μg线性化表达质粒电转化SMD1168毕氏酵母。转化菌先用组氨酸缺陷平板筛选His+转化子，然后用不同浓度G418平板筛选多拷贝插入的转化子。抽提不同转化子的基因组DNA，用一对目的基因内部引物PCR加以鉴定，表明表达质粒插入酵母染色体。经鉴定有插入的转化子进行以下表达研究。
2.3PfEBA-175IIF2表达转化子先接种在以甘油为碳源的培养基中，生长24小时后，转接到的以甲醇为碳源的培养基中。进行诱导表达。每24小时取样、检测表达产物上清和细胞沉淀。SDS-PAGE和考马斯亮蓝检测结果显示在35kD处有明显的PfEBA-175IIF2表达条带，该表达带只在甲醇诱导后出现，并随表达时间延长，其表达产物明显增加(图4)。用中国疟区疟疾病人血清进行免疫印迹法检测表达产物，结果可见35kD目的蛋白印迹。
实施例3.
PfEBA-175IIF2发酵与纯化经对表达条件的优化研究，摇瓶表达水平可达20mg/L。用15L罐进行发酵表达。在整个发酵周期中，前期的细胞呈指数生长上升，细胞密度达OD600＝100。到甘油添加生长期，细胞生长呈直线上升，细胞密度达到OD600＝560。但到了甲醇诱导表达阶段，细胞总密度基本保持不变，而目的蛋白表达是在甲醇加入后3-7hr开始，并随时间延长，表达产率迅速提高，并不断分泌到发酵液中，最高表达量可达300mg/L。
PfEBA-175IIF2表达产物的纯化分两步进行第一步是用Ni-NTA柱纯化。由于PfEBA-175IIF2C末端含有6×His序列，故表达产物可结合到Ni-NTA亲和柱上，并用250mM咪唑洗脱目的蛋白。第二步是用凝胶过滤液相法纯化。经两步纯化的蛋白纯度可达95％(图5)。
实施例4用PfEBA-175IIF2免疫动物在该实施例中，先用纯化的PfEBA-175IIF2为抗原，用ISA720为免疫佐剂免疫家兔，实验分为7组，第一组为ISA720+PfEBA-175IIF2；第二组为ISA720+PfCP-2；第三组为ISA720+PfCSP；第四组为ISA720+PfEBA-175IIF2+PfCP-2；第五组为ISA720+PfEBA-175IIF2+PfCP-2+PfCSP；第六组为ISA720+变性PfEBA-175IIF2；第七组为ISA720佐剂对照。免疫分4次进行，每次免疫分别在第0、20、40、和61天进行。每次免疫前及免疫结束后两周左右取血测定特异抗体水平(图7)。具体方法如下PfEBA-175IIF2抗原与ISA720佐剂按3∶7混合，用注射器抽吸乳化至均匀。PfEBA-175IIF2抗原变性处理按以下方法进行抗原溶液与固体尿素混合，使终浓度为8M，置50℃水浴60min，加入DTT使其终浓度为20mM，置50℃水浴6hr；再加入碘乙酸钠使其终浓度为60mM，置室温60min，毕后用0.1M pH7.5硼酸缓冲液(100mM硼酸、137mM NaCl，调pH至7.5)透析过夜。免疫剂量为每只家兔200μg，为1ml体积。采用皮下多点注射。四次免疫注射时间分别在D0、D20、D40和D61。在首次免疫后D33和D54、D75取血测定抗体ELISA及IFA滴度ELISA按以下程序进行采用表达PfEBA-175IIF2或恶性疟原虫全虫蛋白为抗原，每孔包被量为0.1μg，加入不同稀释度的抗血清100μl，每份稀释血清样本重复三孔，经37℃反应1hr和洗涤后，加入酶标二抗，用TMD底物显色，并读取450mM OD值。用免疫前血清确定阳性阈值，大于该值的稀释度为抗血清阳性最终滴度。
ELISA结果显示，佐剂对照组没有产生特异性抗体，其余6组均产生明显的特异性抗体(图7)。最高抗体滴度为1∶1,389,224；而用变性的重组PfEBA-175IIF2蛋白免疫家兔抗血清的抗体滴度只有1∶3,228。
另外，在用纯化的PfEBA-175IIF2为抗原，用ISA720为免疫佐剂免疫恒河猴和BALB/c小鼠亦产生明显的特异性抗体(图8)。最高抗体滴度为1∶41,026(恒河猴)、1∶61,435(BALB/c小鼠)。
上述结果表明，该重组蛋白在小鼠、家兔、恒河猴免疫实验中显示出极高免疫原性，远高于变性的PfEBA-175IIF2蛋白。
实施例5PfEBA-175IIF2对疟原虫的体外抑制试验用于本实验的恶性疟原虫FCC1/HN株取自海南省。培养按国际上通用的Trager氏蜡烛缸法进行，并按以下公式计算抑制原虫生长率(抑制率) 具体方法如下恶性疟原虫FCC1/HN株按Trager和Jansen氏方法进行体外培养，每天更换培养液，每四天添加红细胞。用于抑制试验的原虫需经过同步处理，即在实验前24小时，含有各期的疟原虫与5％山梨醇混合，置室温30min。经此处理的原虫主要只含环状体时期的原虫。再继续培养24小时，绝大部分已发育到裂殖体。将此时的原虫配制成2％细胞压积和0.5％的原虫感染率。按实验需要加入不同量抗血清，配制成不同抗血清浓度的起始培养物。以每孔200μl将该培养物置96孔平板中，培养24hr或72小时后，制作薄血膜、吉氏染色，用显微镜计数原虫率。
抗血清制备用灭菌注射器从免疫家兔心脏取血，置灭菌离心管中，待血液凝固，血凝块逐渐缩小溢出血清后，离心回收血清，分离的血清经56℃30min灭活及过滤除菌后用于上述抑制试验。
除去IgG抗血清的制备用蛋白A吸附法除去抗血清中的抗体。装填一支蛋白A-Agarose层折柱，按厂家说明书对该柱进行预处理。加抗血清于柱上，收集滤过液，反复过柱直至在SDS-PAGE考马斯亮蓝染胶上未能见到IgG条带。同时洗脱结合在柱上的IgG。体外抑制试验结果(图9)ISA720佐剂与PfEBA-175IIF2抗原的免疫血清经6.7倍稀释后能抑制85％(恒河猴血清)及82％(家兔血清)以上原虫的生长，且这种作用是依赖于PfEBA-175IIF2正确的空间构象。
结果如下(1)用ISA720佐剂+PfEBA-175IIF2免疫的兔血清能抑制82％原虫生长，而只用PfCSP阴性对照组无明显抑制作用(IR0％)。(图9)(2)用8M尿素和DTT变性PfEBA-175IIF2蛋白，再用烷化剂进行烷化处理。经此变性处理的PfEBA-175IIF2与ISA720免疫产生的抗血清完全失去抑制疟原虫生长作用(IR0％)。
(4)用蛋白A柱除去各兔免疫血清中IgG，并测定这种无IgG的免疫血清的抑制恶性疟原虫体外生长作用。结果显示ISA720佐剂+PfEBA-175IIF2组的免疫血清，在去除IgG后失去原有的抑制作用，其抑制率从原来的82％降为0％。
以上抑制试验结果表明(1)PfEBA-175IIF2产生的免疫血清经6.7倍(15％血清含量)稀释后能有效抑制疟原虫体外生长(＞80％的抑制率)，且这种抑制作用是抗体介导的，因为去除抗体的免疫血清失去原有的抑制作用，且这种抑制作用是IgG浓度依赖的；(2)ISA720佐剂是由法国赛比克公司研制的新型佐剂，现已批准人体应用。本结果显示，ISA720和PfEBA-175IIF2联合免疫产生很高的抗体水平。这为PfEBA-175IIF2作为疫苗进行临床试验寻找到了合适的佐剂；(3)PfEBA-175IIF2的免疫保护作用是依赖于该抗原正确的构象，经变性处理的抗原不能诱导保护性抗体。这样，有效的PfEBA-175IIF2重组疫苗需要产生具有天然构象的表达产物。
另外，重组PfEBA175-IIF2和PfCP-2.9联合免疫后，针对两个重组蛋白的ELISA抗体滴度不低于两个蛋白单独免疫的滴度针对两个重组蛋白的抗血清和特异性IgG在体外抑制恶性疟原虫生长的能力并不应联合免疫而减弱(图7、8)。如前所述，由于疟原虫生活史复杂，抗原具有种、株、期特异性，且存在严重的抗原变异，单价疫苗很难达到100％的有效率。因此，一个有效疟疾疫苗需有多个抗原的掺入，而本发明中涉及到的PfEBA175-IIF2与已进入I期临床试验的疟疾疫苗候选抗原PfCP-2.9进行联合免疫所获得的良好的实验结果，应为这种多个抗原掺入的疫苗研制模式带来曙光。
实施例6重组PfEBA-175IIF2与红细胞的结合反应用无血清的RPMI1640培养液在4℃对含有重组PfEBA-175IIF2蛋白的发酵培养上清进行彻底透析。透析过的发酵培养上清液在室温下分别与人完整的红细胞、经过神经胺酸酶或胰蛋白酶处理的人红细胞、小鼠、大鼠、兔的红细胞充分混匀60分钟。再用1M NaCl将结合在红细胞上的蛋白洗脱下来。用SDS-PAGE和Western blot的方法来验证重组PfEBA-175IIF2与红细胞的结合情况。
结果如图3所示。表明重组EBA175-IIF2可以与完整的红细胞结合却不能与神经氨酸酶或胰蛋白酶处理的红细胞结合。可见重组EBA175-IIF2具有与天然蛋白极其相似的唾液酸依赖的红细胞结合功能的生物学特性。
实施例7重组PfEBA-175IIF2与疟疾疫区病人血清的结合反应以PfEBA175-IIF2重组蛋白包被，以1∶200稀释的疟疾疫区病人血清为一抗，进行ELISA检测。
结果如图6所示。结果显示，83％的病人血清(65例)的OD值在cutoff值以上(0.084)。这表明，自然感染疟原虫的人群产生的针对天然PfEBA175-IIF2的抗体能够很好地识别PfEBA175-IIF2重组蛋白，进一步反应了PfEBA175-IIF2重组蛋白与天然蛋白在构象上很接近。
讨论疟疾目前仍然严重威胁着人类的健康，疟原虫抗药性的产生和迅速扩散及抗杀虫剂蚊媒的出现和蔓延，使得疟疾的药物防治陷入了困境，故研制有效的疟疾疫苗以控制疟疾流行已成为当务之急。疟原虫生活史复杂，抗原具有种、株、期特异性，且存在严重的抗原变异，这给疫苗研制带来困难，因而疟疾疫苗研制的难度比人们当初想象的要高得多。在疟原虫生活史中，只有红内期原虫使人致病甚至致命，因此研制有效的红内期疟疾疫苗可降低疟疾的发病率和病死率，对疟疾的防治具有重要意义；而入侵红细胞对恶性疟原虫的生存又至关重要，疟原虫只有入侵宿主红细胞才能生存，因此这一过程应该是疟原虫红内期生活史中的关键环节，而疟原虫入侵红细胞是个复杂的过程，大致可分为疟原虫与红细胞的吸附、疟原虫与红细胞结合部位的识别与重新定向、疟原虫对红细胞的攻击、入侵等几个阶段。干扰或者阻断这种结合就能阻断疟原虫裂殖子入侵，阻断疟原虫入侵红细胞就应该能阻止红内期原虫的生长，应是疟疾疫苗发展的一个重要方面。已有的实验证据表明，疟原虫入侵宿主红细胞的过程是受体和配体介导的，且涉及到多对受体配体的相互作用，因此，对不同疟原虫配体蛋白的研究是疟疾疫苗研制所必需。
总而言之，疟原虫生活史及抗原的复杂性使宿主免疫系统对疟原虫的应答反应亦十分复杂，也增加了疟疾疫苗研制的难度，因此在疫苗候选抗原的选择上更应该从疟原虫生活史中的关键环节入手，选择与这样的生活史环节关系密切的疟原虫蛋白对疟疾疫苗的研制具有更重要的意义。
入侵红细胞对恶性疟原虫的生存至关重要，而具有红细胞结合功能的EBA175-IIF2蛋白势必参与恶性疟原虫入侵这一重要的生命活动。研究提示，该蛋白亦具有较强的免疫原性，其免疫血清可在体外抑制疟原虫的生长。近年发现EBA-175抗原在红细胞前期疟原虫阶段也表达，使得这一疟疾疫苗候选抗原备受研究者关注。
本发明人经过广泛而深入的研究，从DNA水平全合成恶性疟原虫175kD红细胞结合抗原功能区蛋白基因及表达该重组蛋白。结果发现，该重组蛋白可有效地引起免疫应答，且具有唾液酸依赖的红细胞结合功能等生物学特性。
另外，由于疟原虫生活史复杂，抗原具有种、株、期特异性，且存在严重的抗原变异，单价疫苗很难达到100％的有效率。因此，一个有效疟疾疫苗需有多个抗原的掺入，而本发明中涉及到的PfEBA175-IIF2与已进入I期临床试验的疟疾疫苗候选抗原PfCP-2.9进行联合免疫所获得的良好的实验结果，为开发多价疫苗带来曙光。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表<110>中国人民解放军第二军医大学<120>重组恶性疟原虫175kD红细胞结合抗原功能区蛋白及其制法和用途<130>054501<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>963<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(963)<223>175kD红细胞结合抗原功能区IIF2重组蛋白的编码序列<400>1gaaaagagag agcatattga tttggacgat ttttctaaat tcggttgtga caagaactcc 60gttgatacta atacgaaagt ctgggaatgc aagaaaccat acaagttgtc taccaaagac 120gtttgtgtcc ctccaagacg tcaagaattg tgtcttggca acattgatag aatctacgac 180aagaacttgc tgatgattaa agagcacatc ttggctattg ccatctatga atctaggatt 240cttaagcgta aatacaagaa caaagatgac aaggaggttt gtaaaatcat tcaaaagact 300tttgctgata tcagagacat tatcggtgga acagattact ggaacgactt gtctaatcgt 360aaactggttg gtaagattaa cactaattcc aactacgtcc atagaaataa acaaaacgat 20aagttgttta gggacgaatg gtggaaagtt attaagaaag atgtctggaa cgttatctct 80tgggtgttca aggacaaaac tgtttgtaag gaggatgaca ttgaaaacat cccacaattt 540ttcagatggt tttccgagtg gggtgatgac tactgtcagg ataaaactaa gatgattgaa 600accttgaaag ttgagtgcaa ggaaaaacca tgtgaggacg ataactgcaa gagaaaatgt 660aattcttaca aggaatggat ttccaaaaag aaagaggaat ataacaagca agcaaaacag 720taccaagagt atcagaaggg taataactac aaaatgtatt ctgaatttaa gtcaattaaa 780ccagaggttt acttgaagaa atattctgaa aagtgttcca atcttaactt cgaggatgaa 840tttaaggagg aattgcattc tgactacaag aacaaatgta ctatgtgccc agaggttaag 900gatgtcccta tttcaatcat tagaaataac gaacaaacat ctcaccatca ccatcaccat 960taa 963<210>2<211>320<212>PRT<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(320)<223>175kD红细胞结合抗原功能区IIF2重组蛋白<400>2Glu Lys Arg Glu His Ile Asp Leu Asp Asp Phe Ser Lys Phe Gly Cys1 5 10 15Asp Lys Asn Ser Val Asp Thr Asn Thr Lys Val Trp Glu Cys Lys Lys20 25 30Pro Tyr Lys Leu Ser Thr Lys Asp Val Cys Val Pro Pro Arg Arg Gln35 40 45Glu Leu Cys Leu Gly Asn Ile Asp Arg Ile Tyr Asp Lys Asn Leu Leu50 55 60Met Ile Lys Glu His Ile Leu Ala Ile Ala Ile Tyr Glu Ser Arg Ile65 70 75 80Leu Lys Arg Lys Tyr Lys Asn Lys Asp Asp Lys Glu Val Cys Lys Ile85 90 95Ile Gln Lys Thr Phe Ala Asp Ile Arg Asp Ile Ile Gly Gly Thr Asp100 105 110Tyr Trp Asn Asp Leu Ser Asn Arg Lys Leu Val Gly Lys Ile Asn Thr115120 125Asn Ser Asn Tyr Val His Arg Asn Lys Gln Asn Asp Lys Leu Phe Arg130135 140Asp Glu Trp Trp Lys Val Ile Lys Lys Asp Val Trp Asn Val Ile Ser145 150155 160Trp Val Phe Lys Asp Lys Thr Val Cys Lys Glu Asp Asp Ile Glu Asn165170 175Ile Pro Gln Phe Phe Arg Trp Phe Ser Glu Trp Gly Asp Asp Tyr Cys180185 190Gln Asp Lys Thr Lys Met Ile Glu Thr Leu Lys Val Glu Cys Lys Glu195200 205Lys Pro Cys Glu Asp Asp Asn Cys Lys Arg Lys Cys Asn Ser Tyr Lys210215 220Glu Trp Ile Ser Lys Lys Lys Glu Glu Tyr Asn Lys Gln Ala Lys Gln225230 235 240Tyr Gln Glu Tyr Gln Lys Gly Asn Asn Tyr Lys Met Tyr Ser Glu Phe245250 255Lys Ser Ile Lys Pro Glu Val Tyr Leu Lys Lys Tyr Ser Glu Lys Cys260265 270Ser Asn Leu Asn Phe Glu Asp Glu Phe Lys Glu Glu Leu His Ser Asp275280 285Tyr Lys Asn Lys Cys Thr Met Cys Pro Glu Val Lys Asp Val Pro Ile290295 300Ser Ile Ile Arg Asn Asn Glu Gln Thr Ser His His His His His His305310 315 320
权利要求
1.一种重组蛋白，其特征在于，它包含恶性疟原虫175kD红细胞结合抗原功能区IIF2的氨基酸序列，并且具有唾液酸依赖的红细胞结合功能。
2.如权利要求1所述的重组蛋白，其特征在于，所述的重组蛋白具有SEQ IDNO2中1-314位或1-320位所示的氨基酸序列。
3.一种分离的DNA分子，其特征在于，它编码权利要求1所述的重组蛋白。
4.如权利要求3所述的DNA分子，其特征在于，它具有SEQ ID NO1中所示的核苷酸序列。
5.一种载体，其特征在于，它含有权利要求3所述的DNA分子。
6.一种宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求5所述的载体。
7.一种产生权利要求1所述的重组蛋白的方法，其特征在于，包括步骤在适合表达所述重组蛋白的条件下，培养权利要求6所述的宿主细胞，从而表达出所述的重组蛋白；分离所述的重组蛋白。
9.一种组合物，其特征在于，它含有权利要求1所述的重组蛋白或权利要求3所述的DNA分子和药学上可接受的载体。
10.如权利要求9所述的组合物，其特征在于，所述的组合物是疫苗组合物。
全文摘要
本发明提供了一种恶性疟原虫175kD红细胞结合抗原功能区的重组蛋白(PfEBA175－IIF2)，编码该重组蛋白的DNA序列，含该DNA序列的载体，含该载体的宿主细胞，用基因工程制备该重组蛋白的方法，以及该重组蛋白在制备抗疟疾疫苗、疟原虫入侵机制基础研究方面的应用。本发明的PfEBA175－IIF2重组蛋白具有优异的免疫原性和良好的生物学特性，可在免疫个体中引发有效的抗疟原虫的免疫应答，且具有唾液酸依赖的红细胞结合功能。
文档编号C12N15/30GK1887907SQ20051002723
公开日2007年1月3日 申请日期2005年6月29日 优先权日2005年6月29日
发明者潘卫庆, 张冬梅 申请人:中国人民解放军第二军医大学