高效液相色谱法测定金霉素预混剂含量及相关物质的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分析测试领域，涉及一种预混剂含量及相关物质的检测方法，特别涉 及一种高效液相色谱法测定金霉素预混剂含量及相关物质的方法。
【背景技术】
[0002] 金霉素预混剂是金霉素生产菌的全发酵液与适量碳酸钙制成的金霉素钙盐，其中 的药物成分主要是金霉素，但是，也含有一些相关的发酵副产物，如四环素，差向金霉素等。 其金霉素含量测定一般采用微生物检测法（兽药国家标准收载）。实践表明，采用微生物法 测定含量有几个弊端：1)方法繁琐，耗时较长，造成工作效率低；2)方法的影响因素多，对 测试的准确度有较大的影响，测试的重复性与再现性也相对较差；3)测试成本较高；4)不 能同时测定其中的相关物质。
[0003] 《中国药典》（2005版）收载了盐酸金霉素，其含量及相关物质检测采用HPLC法， 可以用于金霉素预混剂的测定，但是，其色谱条件比较复杂、苛刻，流动相使用草酸铵、磷酸 氢二铵及二甲基甲酰胺的混合溶液（用氨试液调PH8. 3)。该方法虽然比微生物检测法方 便、快捷，但是具有如下缺点：1)流动相PH8.3为碱性条件，金霉素在碱性条件下极不稳定， 易氧化降解；2)使用含盐流动相，盐类很容易结晶吸出，造成仪器系统配件磨损，缩短仪器 的寿命，对色谱系统的维护保养不利，不适宜长期使用；3) -般色谱柱允许流动相的pH为 2. 0-7. 5,而该方法流动相的pH为8. 3,需要配备耐碱性的专用色谱柱，造价较一般色谱柱 要高。
[0004] 《中国药典》（2010版）收载的盐酸金霉素，含量及相关杂质检测仍采用HPLC法， 也可以用于金霉素预混剂的检测，该方法虽然克服了 2005版的缺点，调整了色谱条件，将 流动相改为酸性条件；但是，其流动相仍然比较苛刻，使用高氯酸、水和二甲亚砜混合溶液。 高氯酸为强氧化性酸，长期使用会使仪器系统造成腐蚀，缩短色谱柱及仪器的寿命，仍然对 仪器的维护保养不利，不适宜长期使用；另外一个缺点就是，二甲亚砜的价格较贵约为二甲 基甲酰胺价格的二倍，长期使用，成本也较高。
[0005] 针对上述情况，需要发明一种既可以进行准确可靠的测试，又能在长期使用中有 利于仪器的维护保养，还能够节约成本的经济实惠的检测方法。
【发明内容】
[0006] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一种检测效率高、准确可靠的运用高效液相色 谱法检测金霉素预混剂含量及相关物质的方法，本检测方法对仪器磨损、腐蚀较小，实验成 本低，适宜于长期使用。
[0007] 为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
[0008] 高效液相色谱法测定金霉素预混剂含量及相关物质的方法，采用如下色谱条件：
[0009] 色谱柱：（C18, 5um)色谱柱；
[0010] 流动相：以体积比为63~77:1. 8~2. 2:25~30的水、磷酸、N，N-二甲基甲酰胺 的混合溶液为流动相，所述磷酸浓度为2mol/L;
[0011] 流速：0? 8 ~1. 2ml/min;
[0012] 检测波长：270 ~400nm;
[0013] 柱温：30 ~4(TC;
[0014] 优选的，所述流动相中水、磷酸、N，N-二甲基甲酰胺的体积比为70 :2 :28。
[0015] 优选的，检测条件中流速为lmL/min，检测波长为365nm，柱温为35°C。
[0016] 金霉素预混剂中相关物质包括四环素和差向金霉素。
[0017] 检测方法通过以下步骤实现：
[0018] (1)标品溶液配制：取金霉素标准品、四环素标准品、差向金霉素标准品用 0.Olmol/L盐酸稀释分别配制成标品溶液，过0. 22iim滤膜，备供试标品溶液用；
[0019] (2)金霉素预混剂试样品溶液配制：取金霉素预混剂样品用0.Olmol/L盐酸稀释 配制成试样品溶液，过〇. 22ym滤膜，备供试样品溶液用；
[0020] (3)取相同体积的供试标品和样品溶液，注入高效液相色谱仪，按照所述的条件进 行高效液相色谱分析。
[0021] 用峰面积外标法计算相关物质含量：
[0022] 金霉素预混剤试样溶液中对应组分浓度=标标准品纯度 .A标
[0023] A样:样品中相应组分的峰面积；
[0024] A标:相应标品的峰面积；
[0025] C标:相应标品溶液的浓度。
[0026] 优选的，所述金霉素标品溶液浓度为200yg/mL，所述四环素标品溶液浓度为 16yg/mL，所述差向金霉素标品溶液浓度为12yg/mL，所述金霉素预混剂试样品溶液溶度 为 1 ~2mg/mL〇
[0027] 本发明的有益效果在于：
[0028] (1)色谱条件相对温和（流动相不含易结晶的盐类，也不使用强酸），有利于仪器 的维护保养，降低了仪器的长期、连续使用而导致磨损与腐蚀，可以延长仪器的寿命，提高 仪器的利用率；
[0029] ⑵测试准确度高，金霉素含量测定回收率可达到99%~101%，其他物质测定回 收率可达98%~102% ;
[0030] (3)精度高，各组分测试的重复性RSD小于0. 5% ;含量测定的再现性RSD小于 1 %，相关物质测定的再现性RSD小于3%;
[0031] (4)有较宽的线性测试范围，完全满足各种规格的金霉素预混剂的测定。金霉素在 5yg/ml~500yg/ml的浓度范围内，具有很好的线性相关性，相关系数R2可达0. 99998,定 量限可达1. 1yg/ml，检测限可达0. 30yg/ml;相关物四环素在4yg/ml~40yg/ml的浓 度范围内，具有很好的线性相关性，相关系数R2可达0. 99992,定量限可达0. 45yg/ml，检 测限可达〇. 13yg/ml;相关物差向金霉素在3yg/ml~30yg/ml的浓度范围内，具有很好 的线性相关性，相关系数R2可达0. 99945定量限可达1. 4yg/ml，检测限可达0. 39yg/ml;
[0032](5)专属性强，HPLC分离测试过程主成分金霉素和各相关杂质互不干扰，分离度 均大于1. 6,对各组分峰进行纯度测定，纯度指数均为正值；
[0033] (6)耐用性好，色谱条件的微小变化，不影响测试的准确性，可以使用不同品牌的 C1S色谱柱，同时调整二甲基甲酰胺的比例以达到组分的最佳分离。
【附图说明】
[0034] 为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行 说明：
[0035] 图1为测定浓度为200ug/mL的金霉素标准液的谱图；
[0036] 图2为测定浓度为16. 00ug/mL的四环素和浓度为12. 00ug/mL的差向金霉素混合 标准液的谱图；
[0037] 图3为测定金霉素预混剂样品溶液的谱图。
【具体实施方式】
[0038] 下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。
[0039] 检测仪器及条件：
[0040] 岛津LC-20系列高效液相色谱仪，SH)-M20A检测器；
[0041] 色谱柱：C18,5y，4.6X150mm;
[0042] 柱温控制：35°C;
[0043] 检测波长：紫外365nm;
[0044] 流动相：水：2mol/L磷酸溶液：N，N-二甲基甲酰胺=70 :2 :28 (体积比）；
[0045] 栗流量：1.OOml/min;
[0046] 定量体积：20yL;
[0047] 纯化水（HPLC级）、盐酸（优级纯）、磷酸（优级纯）、N，N-二甲基甲酰胺（色谱 纯）
[0048] 流动相溶液的配备：取纯化水700ml，加入2mol/L磷酸溶液20ml混合均匀，然后 加入N，N-二甲基甲酰胺280ml，用真空抽滤器经0. 45ym膜过滤，备用。
[0049] 1、检测标准品储备液配制
[0050] 自冰箱中取出金霉素，四环素，差向金霉素标准品，置于干燥器中，放置到室温后 称量使用。
[0051] a、金霉素标准品储备液：精密称取金霉素标准品50.Omg至50ml容量瓶，用 0.Olmol/LHCl溶解，并稀释至刻度制备成浓度为lmg/mL的金霉素标准品储备液，冰箱中 2~8°C下保存最多7天；