r>[0052] b、四环素标准品储备液：精密称取四环素标准品20.Omg至50ml容量瓶，用 0.Olmol/LHCl溶解，并稀释至刻度制备成浓度为0. 4mg/mL的四环素标准品储备液，冰箱中 2~8°C下保存最多7天；
[0053] c、差向金霉素标准品储备液：精密称取差向金霉素标准品15.Omg至50ml容量瓶， 用0.Olmol/LHCl溶解，并稀释至刻度制备成浓度为0. 3mg/mL的差向金霉素标准品储备液， 冰箱中2~8°C下保存最多7天；
[0054] 2、检测液的配制
[0055] a、金霉素标准品溶液：精密量取5ml金霉素标准品储备液于25ml容量瓶中，然后 用0.Olmol/LHCl稀释至刻度制备成浓度为200yg/mL的金霉素标准品溶液，注：金霉素标 准品纯度为92. 1%。
[0056] b、四环素和差向金霉素混合标准品溶液：精密量取1ml四环素标准品储备液和 lml差向金霉素标准品储备液于25ml容量瓶中，然后用0.Olmol/1HC1稀释至刻度，得到 四环素和差向金霉素混合标准品溶液，所述混合标准品溶液中四环素浓度为16yg/mL， 差向金霉素浓度为12yg/mL，注：四环素标准品的纯度97. 6%，差向金霉素标准品的纯度 89. 9%〇
[0057] c、金霉素预混剂样品溶液：取经研磨后的金霉素预混剂样品适量，精密称定，转移 至IJ100mL的容量瓶中，加2mol/LHCl，2ml浸润，然后用0?Olmol/LHC1稀释至刻度，于磁力 搅拌器上搅拌30分钟。对于本实例样品规格为20%，实际样品称取量为100. 6mg。金霉素 预混剂样品溶液中金霉素的理论浓度为203. 212yg/ml、四环素的理论浓度为11. 066yg/ ml、差向金霉素理论浓度为4. 024yg/ml。
[0058] 3、用高效液相色谱仪进行检测
[0059] 开启高效液相色谱仪，按上述色谱条件设定相关参数，使仪器系统运行平衡1小 时，将配制好的标品溶液和样品溶液，经0. 22ym的尼龙型微孔滤膜过滤到1. 5ml的样品瓶 中，放入高效液相色谱仪自动进样器中，按照设定好的色谱条件，依次进行测定，记录金霉 素标准品溶液、四环素和差向金霉素混合标准品溶液、金霉素预混剂样品溶液的图谱分别 如图1、图2和图3所示。
[0060] 4、结果分析
[0061] 从图1可得出标准品金霉素保留时间在12. 2左右，图3在保留时间12. 2左右也 出现了很明显的波峰，由此可得出图3图谱中有金霉素，并可以确定样品中金霉素的保留 时间位置。
[0062] 从图2可得出标准品四环素保留时间在5. 0左右，差向金霉素保留时间在9. 8左 右，图3在保留时间5. 0、9. 8左右也出现了很明显的波峰，由此可得出图3谱图中有四环素 和差向金霉素，并可以确定样品中四环素、差向金霉素的保留时间位置。将图1谱图信息记 录至表1，图2谱图信息记录至表2,图3谱图信息记录至表3。
[0063] 表1测定浓度为200ug/mL的金霉素标准品的谱图信息
[0064]
[0065] 表2测定浓度为16. 00ug/mL的四环素和浓度为12. 00ug/mL的差向金霉素混合标 准液的谱图信息；
[0066]
[0067] 表3测定金霉素预混剂样品溶液的谱图信息
[0073] 金霉素预混剂样品溶液中金霉素的理论浓度为203. 212yg/ml、四环素的理论浓 度为11. 066yg/ml、差向金霉素理论浓度为4. 024yg/ml，与本检测结果进行偏差计算：
[0074] 金霉素的相对偏差：（202. 82-203. 212)/203. 212 = -0? 19%，相对偏差在 ±2. 0% 范围内；
[0075] 四环素的相对偏差：（11. 17-11. 066)/II. 066 = 0. 94%，相对偏差在±5. 0%范围 内；
[0076] 差向金霉素的相对偏差：（4. 16-4. 024)/4. 024 = 3. 4%，相对偏差在±5. 0%范围 内。
[0077] 由以上可看出，本检测方法在色谱条件相对温和（流动相不含易结晶的盐类，也 不使用强酸）的条件下也可实现较高的准确度。
[0078] 5、与现有技术方法对比
[0079] 对同一批号的15%规格的金霉素预混剂使用药典方法与本发明方法的重现性测 试数据对比结果如表4,表5,表6。
[0080] 表4 :相关物质-金霉素（％ )测试结果对比
[0081]
[0082]
[0083] 表5 :相关物质一一四环素（％ )测试结果对比
[0084]
[0085] 表6 :相关物质一一差向金霉素（％ )测试结果对比
[0086]
[0087] 对比测试结果表明，本发明的测试方法对于金霉素预混剂测试的准确度与重现性 不低于药典方法，该方法适合于公司日常生产的连续检测，准确可靠且经济实惠。
[0088] 最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通 过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在 形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。
【主权项】
1. 高效液相色谱法测定金霉素预混剂含量及相关物质的方法，其特征在于，采用如下 色谱条件： 色谱柱：(C18,5um)色谱柱； 流动相拟体积比为63~77:1. 8~2. 2:25~30的水、憐酸溶液、N，N-二甲基甲酯胺 的混合溶液为流动相，所述憐酸溶液浓度为2mol/L ; 流速：〇. 8 ~1. 2ml/min; 检测波长：270~400nm; 柱溫：30~40°C。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述流动相中水、憐酸、N，N-二甲基甲酯 胺的体积比为70 :2 :28。3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，流速为ImL/min，检测波长为365nm，柱溫 为 35〇C。4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述相关物质包括四环素和差向金霉素。5. 根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其特征在于，通过W下步骤实现： (1)标品溶液配制：取金霉素标准品、四环素标准品、差向金霉素标准品用O.Olmol/L 盐酸稀释分别配制成标品溶液，过0. 22ym滤膜，备供试标品溶液用； (2)金霉素预混剂试样品溶液配制：取金霉素预混剂样品用0.0 lmol/L盐酸稀释配制 成试样品溶液，过0. 22ym滤膜，备供试样品溶液用； (3) 取相同体积的供试标品和样品溶液，注入高效液相色谱仪，按照权利要求1-3中任 一项所述的条件进行高效液相色谱分析； 用峰面积外标法计算相关物质含量： 金霉素预混剂试样品溶液中对应组分浓度==^XC标X标准品纯度 ：A# :样品中相应组分的峰面积；A:相应标品的峰面积；C:相应标品溶液的浓度。6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述金霉素标品溶液浓度为200yg/mL， 所述四环素标品溶液浓度为16yg/mU所述差向金霉素标品溶液浓度为12yg/mU所述金 霉素预混剂试样品溶液溶度为1~2mg/血。
【专利摘要】本发明涉及一种高效液相色谱法测定金霉素预混剂含量及相关物质的方法，采用如下色谱条件：色谱柱：(C18，5um)色谱柱；流动相：以体积比为63～77:1.8～2.2:25～30的水、磷酸、N,N-二甲基甲酰胺的混合溶液为流动相，所述磷酸浓度为2mol/L；流速：0.8～1.2ml/min；检测波长：270～400nm；柱温：30～40℃；进样量：10～25μL；检测器：紫外检测器；配制金霉素、四环素、差向金霉素标品溶液和金霉素预混剂样品溶液，再按照上述色谱条件进行高效液相色谱分析，并通过峰面积计算出预混剂中相关物质含量。本检测方法色谱条件相对温和(流动相不含易结晶的盐类，也不使用强酸)，有利于仪器的维护保养，并且测试准确度高。
【IPC分类】G01N30/88
【公开号】CN105004831
【申请号】CN201510431875
【发明人】谢昌贤, 秦定宇, 刘运添, 云喜报, 金玲玲, 杨晓亚, 樊二改, 王鹏飞
【申请人】金河生物科技股份有限公司
【公开日】2015年10月28日
【申请日】2015年7月21日