同时测定麦冬中5种皂苷成分的hplc-elsd方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及药物质量控制方法技术领域，具体涉及同时测定麦冬中5种皂苷成分 的HPLC-ELSD方法。
【背景技术】
[0002] 麦冬来源于百合科沿阶草属植物Ophiopogonjaponicus(L.f)Ker-Gawl.的干燥 块根，是常用中药材之一，主要用于治疗肺燥干咳，阴虚痨嗽，喉痹咽痛，津伤口渴，内热消 渴等疾病。主产四川、浙江、湖北、山东、安徽等地，形成了川麦冬、杭麦冬等道地品种。
[0003] 麦冬中留体皂苷类成分为其代表性有效成分，《中国药典》2010年版一部麦冬项下 采用紫外-可见光分光光度法对麦冬的总皂苷含量进行了测定，以总皂苷含量建立了质量 标准。但是，药典方法的总皂苷含量受外界影响较大，其重现性和精密度均较低。同时，药 典方法测定的是总皂苷含量，并没有对麦冬中具体的皂苷含量进行监控，该质量标准无法 全面体现麦冬药材的质量。
[0004] 为解决上述问题，已有报道对麦冬中的某些特定皂苷成分进行检测。麦冬皂苷D 是目前研究较多，具有多种药理作用的皂苷成分。因此，俞建平等人以其为指标性成分，检 测了不同产地、不同生长年限麦冬中麦冬皂苷D含量，发现同一产地的浙江产麦冬皂苷D含 量有较大差别（ELSD-HPLC法测定浙麦冬、川麦冬中麦冬皂苷D含量的方法研究，中药新药 与临床药理，2002年7月第13卷第4期，第253-255页）。因此，麦冬皂苷D含量的高低不 适合作为浙江产麦冬质量的指标，不适合根据其建立浙江产麦冬的道地药材质量标准。
[0005] 可见，如果仅以麦冬中的某一特定活性成分含量作为质量指标建立质量标准，在 判断麦冬药材的质量时存在着极大的误判风险，也无法准确获知麦冬药材的产地。
[0006] 由于麦冬皂苷D'也具有一定药理活性，贾诚等人报道了同时测定麦冬药材中麦冬 皂苷D和麦冬皂苷D'含量的方法，发现不同批次的川麦冬中，麦冬皂苷D和麦冬皂苷D'含 量稳定，（ELSD_HPLC法测定麦冬药材中麦冬皂苷D、D'含量，现代中药研究与实践，2012年 第26卷第3期，第79-81页）。但是，其没有对其他产地的麦冬进行检测，仅以麦冬皂苷D 和麦冬皂苷D'的含量作为质量指标判断麦冬质量仍然存在着较大的风险，以其作为质量标 准可靠性不高。
[0007] 因此，考虑到中药材的活性成分繁多，且会受到外界多种因素的影响，以较少的活 性成分含量作为质量标准的指标可靠性不高。目前需要选择麦冬中更多活性成分的含量作 为指标，以建立一种更加可靠、更加全面反映的麦冬药材质量的标准。同时，由于中药对药 材的道地性有着特殊的要求，不同产地药材的用法及药效存在差异，也需要建立各道地药 材的质量标准，以对不同产地的麦冬进行有效的区分。
[0008] 对于上述质量标准的建立及其应用，亟需一种可以准确检测出麦冬中更多活性成 分的含量的方法。但是，目前并没有相关检测方法的报道。
【发明内容】
[0009] 考虑到现有技术中检测的活性成分较少，而指纹图谱虽然可检测的成分较多，但 其建立和实施条件苛刻，且对特定活性成分的专属性不强，从而不能准确测定活性成分的 含量。
[0010] 因此，为解决上述问题，本发明提供了一种既能测定麦冬中多种活性成分，且简单 易实施的方法，它是一种同时测定麦冬中5种皂苷成分的HPLC-ELSD(高效液相色谱-蒸发 光散射检测器）方法，所述5种皂苷成分为OphiopojaponinC(CAS号911819-08-4)、去乙 醜基OphiopojaponinA(CAS号 313054-32-9)、3-〇-a_L_ 鼠李糖 _ (1 - 2)_ 0 _ 甸甸糖麦 冬苷元、麦冬皂苷D和麦冬皂苷D'，包括以下步骤：
[0011] (1)皂苷成分标准曲线的建立：
[0012] a、对照品洛液的制备：
[0013] 取OphiopojaponinC、去乙酰基OphiopojaponinA、3-〇_a-L-鼠李 糖-a-2)-e-葡萄糖麦冬苷元、麦冬皂苷D和麦冬皂苷D'对照品，混合，加甲醇配制成 混合对照品溶液；
[0014] b、对照品溶液的测定：
[0015] 配制系列浓度的混合对照品溶液，分别注入高效液相色谱仪，梯度洗脱，测定各 色谱峰峰面积，得到OphiopojaponinC、去乙酰基OphiopojaponinA、3-〇-a-L-鼠李 糖-(1 - 2)-P-葡萄糖麦冬苷元、麦冬皂苷D和麦冬皂苷D'的标准曲线；
[0016] 色谱条件如下：
[0017] 蒸发光散射检测器；
[0018] 色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶填料；
[0019] 流动相：以乙腈为流动相A，水或0. 1 %磷酸水溶液为流动相B;
[0020] 梯度洗脱：0~45min，流动相A:35 - 55%，流动相B:65 - 45% ;
[0021] (2)待测样品中皂苷成分的含量测定：
[0022] c、供试品溶液的制备：
[0023] 取待测麦冬粉末，加甲醇超声提取，过滤，滤渣加甲醇超声提取，过滤，除去溶剂， 残渣加水溶解，水饱和正丁醇多次提取，合并提取液，氨试液洗涤，除去氨液，正丁醇液回收 至干，残渣加甲醇溶解，过滤得供试品溶液；
[0024] d、供试品溶液的测定：
[0025] 取供试品溶液，注入高效液相色谱仪，以步骤b相同的色谱条件检测，根据步 骤（1)的标准曲线得到待测样品中OphiopojaponinC、去乙酰基OphiopojaponinA、 3-0-a-L-鼠李糖-(1 - 2)-P-葡萄糖麦冬苷元、麦冬皂苷D和麦冬皂苷D'的含量。
[0026] 进一步优选地，所述蒸发光散射检测器的漂移管温度为KKTC，气体流速为3. 0L/ min〇
[0027] 进一步优选地，步骤a中，所述对照品溶液中，每lmL溶液含phiopojaponinC 8. 80yg、去乙酰基OphiopojaponinA7. 80yg、3-0-a-L-鼠李糖-(1 - 2) - 0 -葡萄糖麦 冬苷元16. 80yg、麦冬皂苷D9. 80yg和麦冬皂苷D' 10. 60yg。
[0028] 进一步优选地，步骤c中，所述麦冬粉末的粒径为过四号筛。更进一步优选地， 步骤c中，所述供试品溶液的制备方法为：取过4号筛的麦冬粉末3. 0g，精密称定，加甲醇 50mL，超声提取45min，过滤，滤渣加甲醇30mL，超声提取30min，抽滤，合并滤液，回收溶剂 至干；残渣加水lOmL使溶解，水饱和正丁醇多次提取，合并提取液，氨试液洗涤，除去氨液， 正丁醇液回收至干，残渣加甲醇溶解，定容至5mL，过滤得供试品溶液。
[0029] 进一步优选地，所述色谱柱的长度为250mm，内径为4. 6mm，填料的粒径为5ym。更 进一步优选地，所述色谱柱为Kromasil100-5C18色谱柱。
[0030] 进一步优选地，所述色谱条件的柱温为35°C。
[0031] 进一步优选地，所述色谱条件的体积流量为1.OmL/min。
[0032] 进一步优选地，所述麦冬为川麦冬。
[0033] OphiopojaponinC、去乙酰基OphiopojaponinA和 3-〇_a-L-鼠李 糖-(1 - 2) - 0 -葡萄糖麦冬苷元均为留体皂苷，也具有一定的生理活性。发明人选择它们 的含量与麦冬皂苷D、麦冬皂苷D'的含量一起进行检测，以作为全面判断麦冬质量的指标。
[0034] 最终，本发明通过对提取方法和色谱条件的筛选，成功建立了同时测定麦冬中5 个麦冬阜苷成分含量的HPLC-ELSD方法，该方法准确可靠、简便快速。利用本发明的检测方 法，既可以建立出以麦冬中5个麦冬皂苷成分含量作为指标的麦冬药材质量标准，还可以 为不同产地的麦冬建立出道地药材的质量标准，从而为全面监控麦冬质量提供了有效的保 障。
[0035] 显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离 本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
[0036] 以下通过实施例形式的【具体实施方式】，对本发明的上述内容再作进一步的详细说 明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容 所实现的技术均属于本发明的范围。
【附图说明】
[0037] 在下述附图中，1.OphiopojaponinC;2?去乙酰基OphiopojaponinA; 3-0-a-L-鼠李糖-(1 - 2) - 0 -葡萄糖麦冬苷元；4.麦冬皂苷D;5.麦冬皂苷D'。
[0038] 图1为混合对照品溶液的HPLC-ELSD图。
[0039] 图2为供试品溶液的HPLC-ELSD图（样品批号：201501)。
[0040] 图3为水提取时的HPLC-ELSD图。
[0041] 图4为甲醇提取时的HPLC-ELSD图。
[0042] 图5为80 %甲醇提取时的HPLC-ELSD图。
[0043] 图6为无水乙醇提取时的HPLC-ELSD图。
[0044] 图7为95 %乙醇提取时的HPLC-ELSD图。
[0045] 图8为80 %乙醇提取时的HPLC-ELSD图。
[0046] 图9为流动相为乙腈-水时的HPLC-ELSD图。
[0047] 图10为流动相为乙腈_0. 1 %磷酸水时的HPLC-ELSD图。
[0048] 图11为流动相为甲醇-水时的HPLC-ELSD图。
[0049] 图12为本发明梯度洗脱程序下的HPLC-ELSD图。
[0050] 图13-16为其他梯度洗脱程序下的HPLC-ELSD图。
【具体实施方式】
[0051] 仪器与材料：
[0052] Agilentl200高效液相色谱仪（美国安捷伦公司，包括二元栗，自动进样器， AlltechELSD-2000蒸发光散射检测器），BP121S十万分之一电子天平（德国赛多利斯公 司），KQ-500DB数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。
[0053] 乙腈为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯；麦冬皂苷D(批号： MUST-14052901)，麦冬皂苷D'（批号：MUST-14061901)，OphiopojaponinC(批 号：MUST-14071203)，3-0-a-L-鼠李糖-(1 - 2)-0 -葡萄糖麦冬苷元（批号： MUST-14070210)，去乙酰基OphiopojaponinA(批号：MUST-14072002)对照品由成都曼 思特生物科技有限公司提供，质量分数均多98% ;检测样品为2015年三台地区收集麦 冬药材，共10个批次，经成都中医药大学李敏教授鉴定为Ophiopogonjaponicus(L.f) Ker-Gawl.的干燥块根。
[0054] 实施例1本发明方法
[0055] 1色谱条件
[0056] 色谱柱为Kromasil100-5C18 柱（4. 6mmX250mm，5ym);流动相为乙臆（A)-〇? 1 % 磷酸水⑶溶液，梯度洗脱：〇~45min，35%~55%A，体积流量1.OmL/min;柱温35°C，漂 移管温度l〇〇°C，气体流速3. 0L/min;进样量15yL。
[0057] 2溶液制备
[0058] 2. 1混合对照品溶液制备
[0059] 精密称定OphiopojaponinC、3-0-a-L-鼠李糖-(1 - 2)-0 -葡萄糖麦冬苷元、 去乙酰基OphiopojaponinA、麦冬皂苷D、麦冬皂