专利名称：短葶山麦冬总皂苷及其制备方法
技术领域：
本发明提供一种短葶山麦冬总皂苷及其制备方法，尤其是含有留体皂苷类成分的 短葶山麦冬总皂苷，以及该总皂苷的制备提纯方法，该方法提取精制得到的短葶山麦冬总 皂苷具有抗肿瘤作用。
背景技术：
短葶山麦冬(Liriope musacarli (Decne. )Bailey)属于百合科山麦冬属植物，其 块根历来一直作为麦冬药材的替代品使用；《中国药典(一部)》收载短葶山麦冬作为山麦 冬的药材来源之一。短葶山麦冬皂苷C是从短葶山麦冬中提取的一种单体化合物，已有研究表明，其 具有良好的抗S180实体瘤和艾氏腹水癌的活性。短葶山麦冬皂苷C的提取方法是将短葶山麦冬药材粗粉先用甲醇提取，再依次经 乙醚、正丁醇萃取，正丁醇萃取物经s印hadex LH-20和硅胶柱层析后得到的单体化合物。本领域技术人员发现，短葶山麦冬皂苷C的出率低，制备成本高，应用到医药领域 的市场直接导致患者的治疗成本大幅增加，因此降低应用成本是药品进入市场流通的必 然。但是最可行的降低成本的有效路径就是不提纯单体，将其改为提取有效部位是业内公 知的并且通用的技术手段。有效部位，主要指的是总皂苷相对于单体皂苷出率高，制备成本 低，适合临床使用，并能有效降低治疗成本，患者顺应性也很好。但是医药用途的有效部位 并非简单的有效成分等的混合，而是必须针对特定的目的(治疗效果)经过特殊工艺手段 去芜存菁的、精制后的混合物，这是需要大量的工作以及娴熟的技艺才能胜任的。目前，医学发现并研究的肿瘤是人体中正在发育的或成熟的正常细胞，在某些不 良因素的长期作用下，某部的细胞群，出现的过度增生或异常分化而生成的新生物，在局部 形成肿块。但它与正常的组织和细胞不同，不按正常细胞的新陈代谢规律生长，而变得不受 约束和控制，导致了细胞呈现异常的形态、功能和代谢，以致可以破坏正常的组织器官的结 构并影响其功能。恶性肿瘤细胞还能向周围浸润蔓延，甚至扩散转移到其他器官组织，继续 成倍增生，造成对人体或生命极大的威胁。人体在生长的过程中虽常有肿块形成，但肿块不 一定都是肿瘤。因此，必须鉴别肿块的性质，才能做到正确诊断、正确治疗。肿瘤在临床上 有实体瘤和非实体瘤之分，实体瘤及有形瘤可通过临床检查如X线摄片、CT扫描、B超或触 诊扪及到的有形肿块称实体瘤。而X线、CT扫描、B超及触诊无法看到或扪及到的肿瘤如血 液病中的白血病就属于非实体瘤。癌症的分类血癌(白血病)、骨癌、淋巴癌(包括淋巴细胞瘤)、肠癌、肝癌、胃癌、 盆腔癌(包括子宫癌，宫颈癌)、肺癌(包括纵隔癌)、脑癌、神经癌、乳腺癌、食道癌、肾癌。由此可见，简单地用S180的实验结果不能在临床上定位于人体的任何准确位置 的癌症/肿瘤，况且单体对某种肿瘤的瘤株有效并不能证明有效部位同样有效，本发明将 用详实的数据证明这一论点，而医学治疗癌症/肿瘤是严格按照肿瘤在人体的生长部位或 器官进行医治的，因此，现有技术中关于短葶山麦冬皂苷C以及关于短葶山麦冬的文献对癌症治疗的临床研究仅仅起到引路的作用，而很难认为其作为临床依据或者起到教导的作用。因此，本领域急需发明一种可以分离出包括短葶山麦冬皂苷C单体在内(但不一 定是主要的有效成分)的总皂苷及其制备提纯方法，目的是可以得到具有确实成分的、治 疗效果明确的短葶山麦冬中总皂苷，使得到的总皂苷可以直接用于医药领域的治疗目的明 确的各种制剂，明确规范该植物提取物的医学用途，降低含有短葶山麦冬总皂苷的产品的 副作用以及降低其医药用途风险。
发明内容
本发明经过大量的实验，研制出一种短葶山麦冬总皂苷及其提取和精制的方法， 该方法简单、高效，分离度高，使得总皂苷的活性更加有效、准确和针对性强，单体纯度高。本发明目的在于提供一种短葶山麦冬中总皂苷的制备方法，其在现有的常规技术 得到的短葶山麦冬提取物(短葶山麦冬总皂苷粗提物)，进一步经过精制，从而提纯了活性 成分，使其有益的活性效果更加明确。本发明目的在于提供一种短葶山麦冬中总皂苷，该总皂苷具有抗肿瘤、抗癌方面 的活性，该效果更正了现有技术中公认的短葶山麦冬皂苷具有治疗实体瘤的医学疗效方面 的偏差和误区，颠覆了现有的部分理论，对短葶山麦冬的进一步研究以及短葶山麦冬总皂 苷对肿瘤的治疗具有可贵的指导意义。本发明的目的还在于提供上述短葶山麦冬总皂苷抗肿瘤，如肺癌、肝癌和宫颈癌 等恶性肿瘤方面的治疗作用。本发明提供了一种短葶山麦冬中总皂苷的制备方法，该方法包括以短葶山麦冬 根(块根或须根)为原料，以乙醇提取，提取液用正丁醇萃取，得粗总皂苷(也称短葶山麦 冬总皂苷粗提物)；取粗总皂苷加水溶解，使该粗总皂苷溶液通过非极性大孔树脂柱(如 ab-8型，d-101型等大孔树脂柱)，以水洗脱，至洗脱液无色，弃去该水洗脱液，目的是去除 糖类成分，再以乙醇的水溶液洗脱，收集洗脱液至洗脱液无色，优选再回收溶剂，得到总皂 苷。该总皂苷为精制后的短葶山麦冬总皂苷，也为本发明上述的短葶山麦冬中总皂苷。上述洗脱用乙醇溶液的浓度很重要，本发明优选50-95% wt的乙醇进行洗脱。需要说明的是在本文中，本发明为了规范技术术语，消除歧义，将短葶山麦冬的 常规提取方法得到的提取物称之为短葶山麦冬总皂苷粗提物。上述提取得到粗总皂苷所采用的提取溶剂是乙醇，该乙醇是药学意义上的相对于 稀乙醇而言的浓度彡51% wt的乙醇，一般指的是51% 95% wt的乙醇。本发明上述的稀 乙醇指的是乙醇的质量浓度< 50. 5%的乙醇溶液。对稀乙醇的界定参见中国药典附录“试 液”，95%的乙醇529ml加水1000毫升得到的乙醇的浓度即为稀乙醇的浓度的上限，经过测 算，乙醇浓度20度时就是稀乙醇，即，稀乙醇的最大浓度是49. 5-50. 5% wt。所述的短葶山麦冬根以乙醇提取，提取液用正丁醇萃取，该正丁醇的量为短葶山 麦冬根重量的0. 5 5倍，更优选与短葶山麦冬根的重量相等。上述在上柱之前还包括将粗总皂苷加水溶解，再过滤，弃去不溶物，滤液、上柱，以 乙醇的水溶液洗脱的步骤，洗脱时收集洗脱液一般为收集至少4倍柱体积的洗脱液，例如 收集4 40倍柱体积的洗脱液，在本发明的优选实施例中，可以收集8 15倍柱体积的洗脱液即可达到本发明的目的和效果。上述柱体积指的是非极性大孔树脂柱的填料填充的体 积。目前也有技术披露提取短葶山麦冬总皂苷粗提物的方法采用稀乙醇提取，再采用 正丁醇或者树脂吸附的方法进行初步除杂。本发明人按照常规方法重复再现提取得到的 粗提物经过检测证明纯度不高，含有大量的糖类成分等对肿瘤细胞没有或者少有活性的成 分，且呈现出一定抑制活性的目标瘤株所针对的肿瘤部位不明确，缺乏对临床的实际指导 意义等缺陷。本发明的目的在于在现有对短葶山麦冬研究的基础上进一步精制，得到基本上去 除糖类成分等杂质的、对有明确分类的瘤株有强活性的短葶山麦冬总皂苷。本发明所述的短葶山麦冬总皂苷粗提物优选通过下述方法制得以短葶山麦冬根 为原料，以相对短葶山麦冬原料重量的至少4倍量的浓度> 51% wt的乙醇提取，提取液浓 缩至稠膏，再用水分散，然后再用正丁醇萃取，取正丁醇层萃取液，回收溶剂，得到即为所述 的粗总皂苷，也称为短葶山麦冬总皂苷粗提物。本发明所述的“稠膏”为本领域公知，其相对密度大约应在1.35或以上。上述以短葶山麦冬根为原料的乙醇提取的过程中，乙醇的浓度为51 95 % wt，乙 醇的量一般优选为短葶山麦冬根原料重量的10-20倍，更优选12 18倍，例如用15倍量 的51% wt以上浓度(优选大约85% )的乙醇提取；提取的方法可以任何可行的方法，例如 是浸渍、回流等都可以，为了更好地得到总皂苷，本发明优选采用回流的方法。上述乙醇提取液回收溶剂后，加水分散的过程中，加水量为短葶山麦冬根原料重 量的0. 1 10倍，优选0. 5 5倍，在本发明的优选实施例中，加等倍量(短葶山麦冬根重 量的等倍量)的水分散，再用正丁醇萃取，正丁醇的量为上述加水分散中的水量的0. 5 5 倍，更优选加入的正丁醇和加入的水大约等量，萃取液回收溶剂，得粗总皂苷；该粗提物为 短葶山麦冬总皂苷粗提物，也称粗总皂苷。本发明的原料可为短葶山麦冬或其中间产物短葶山麦冬总皂苷粗提物，后者可通 过市售购得或按《天然药物化学》(第4版，人民卫生出版社)记载的方法得到。经过反复的、精确的测试实验，上述方法所收集的含短葶山麦冬中总皂苷的流份， 即短葶山麦冬总皂苷中，属于单体化合物的短葶山麦冬皂苷A含量为所得到的该短葶山麦 冬总皂苷的量的3-25% wt，优选5 20%。本发明还提供了一种短葶山麦冬中总皂苷，其为采用上述的制备方法得到的短葶 山麦冬中总皂苷，其中，短葶山麦冬皂苷A含量3-25% wt，优选5 20%，以上述方法得到 的短葶山麦冬总皂苷的重量为100%作为基准进行计算。本发明的短葶山麦冬总皂苷中，标识性成分为短葶山麦冬皂苷A，其为单体化合 物，在收集含短葶山麦冬总皂苷流份的精制除杂步骤中，该单体的色谱峰的保留时间为 10 55分钟。经过进一步的验证，本发明所述的短葶山麦冬中总皂苷中还含有短葶山麦 冬皂苷B、短葶山麦冬皂苷C等同样属于皂苷类的成分，短葶山麦冬皂苷B在收集含山麦冬 中总皂苷的流份的步骤中的保留时间为12 60分钟。短葶山麦冬皂苷A β-sitosterol β -D-glucopyranoside (简称 Lm-1)、短葶山麦冬阜苷 B :ruscogenin 1-0- β -D-glucop yranosyl (1 — 2) - β—D—fucopyranoside (简称 Lm_2)禾口短寧山麦冬阜昔 C :ruscogenin 1-0-[β -D-glucopyranosyl(1 — 2)] [ β -D~xylopyranosyl(1 — 3)]- β -D-fucopyranoside (简称 Lm-3)等的结构和分析具体参见 YuB Y, Hirai Y, Shoji J, et al. Comparative studies on the constituents of ophiopogonis tuber and its congeners. VI. Studies on the constituents of the subterranean part of Liriope spicata var. prolifera and L. muscari. (1). Chem Pharm Bull. 1990 ；38 (7) : 1931—1935。为证明上述提取物属于总皂苷，本发明采用薄层层析的方法(TCL)和高效液相色 谱的方法(HPLC)进行检测(紫外检测波长约203nm)，一般采用C18色谱柱，洗脱相为甲醇 (10-60% wt)-水(90-40% wt)或乙腈(5-50% )-水(95-50% wt)的混合溶液，更优选甲 醇-水梯度洗脱，经DAD (紫外检测器，检测波长190-300nm)和qtof (两级质谱)检测器检 测，确定本发明提取物属于总皂苷类。综上所述，可以看出，采用传统的短葶山麦冬中总皂苷的制备方法，一般制备产物 为皂苷和糖类及少量其他小分子化合物的混合物，杂质较多。本发明制备得到的产物为精制的短葶山麦冬总皂苷，尽可能去除糖类和小分子及 低极性化合物等杂质，得到纯度较高的总皂苷提取物，包括对在肝脏、肺、胃肠、宫颈等部位 的肿瘤和癌症具治疗效果的几乎所有的活性成分。本发明还提供了上述短葶山麦冬中总皂苷在抗肿瘤方面的作用，尤其是短葶山麦 冬总皂苷在制备治疗癌症的药物中的用途。本发明所述的肿瘤包括良性肿瘤和恶性肿瘤， 后者尤其包括肝癌、肺癌、胃癌、宫颈癌。1、山麦冬精致总皂苷对H22(肝癌)移植小鼠的作用实验动物KM小鼠；瘤原H22 (肝癌)；剂量设计以200mg/kg为高剂量组剂量，100mg/kg为低剂量组剂量。方法和结果60只KM小鼠分6组——空白对照组、环磷酰胺对照组、丙酮提取物高剂量组、丙酮 提取物低剂量组。常规接种H22。与接种后24h给药，每天1次，连续给7天，于最末次给药 24h，处死小鼠，取出瘤块，称重，组间做t检验，并计算抑瘤率。试验重复1次。结果见附表 2、山麦冬精致总皂苷对U-14宫颈癌移植小鼠的作用样品山麦冬精致总皂苷；瘤原U14 ；动物昆明鼠，II级，北京大学医学部实验 动物科学部提供，许可证号SCXK (京)2006-0008 3、山麦冬精致总皂苷对Lewis肺癌移植小鼠的作用样品山麦冬精致总皂苷瘤原Lewi s肺癌动物C57，II级，北京大学医学部实验动物科学部提供，许可证号 SCXK (京)2006-0008 4、山麦冬精致总皂苷对S-180肉瘤移植小鼠的作用样品山麦冬精致总皂苷；瘤原S180 ；小鼠，昆明鼠，雌性，体重18 22g。
7 上述经过药理药效实验验证，通过建立小鼠移植肿瘤的动物模型，结果验证，本发 明制得的短葶山麦冬中总皂苷单体的抗肺癌、肝癌和宫颈癌的效果与文献记载不尽相同， 现有文献记载的是短葶山麦冬皂苷c具有抗腹水癌和S-180肉瘤的作用，本发明经过反复 实验，验证了经过本发明进精制的短葶山麦冬总皂苷具有lewis肺癌、H-22肝癌和U-14宫 颈癌的效果，但抗S-180肉瘤的作用不明显，为研究和应用短葶山麦冬总皂苷纠正了现有 理论可能存在的偏差，提供了准确可信的依据。经急性毒性实验及长期毒性实验证实，短葶山麦冬总皂苷安全范围广；急性毒性 实验显示，总皂苷部位的LD5tl可达1600mg/kg，治疗指数高，临床应用于治疗肿瘤或作为肿 瘤治疗辅助用药，在具有有效活性的同时还具有安全性。
图1 本发明的制备方法得到的短葶山麦冬总皂苷的色谱图，其中横坐标是时间 (分钟)，纵坐标是吸收度。
具体实施例方式以下结合附图详细说明本发明，但不限定本发明的实施范围。实施例1 取短葶山麦冬药材，加大约15倍量85%乙醇回流提取；提取液回收溶剂至稠膏 状，加等生药量(重量)水分散，以正丁醇萃取2次，合并萃取液，回收溶剂得粗总皂苷。将 粗总皂苷再加生药量的等重量倍的水溶解，上ab-8型大孔树脂柱，先以水洗脱，至洗脱液 molish反应呈阴性，再以8倍柱体积的95% wt的乙醇洗脱，洗脱液回收溶剂，得短葶山麦 冬总皂苷。经过采用高效液相色谱分析的方法(HPLC)进行检测，色谱柱是C18，洗脱相为甲 醇_水或乙腈_水的混合溶液，更优选为甲醇-水梯度洗脱的溶液，经过DAD和qtof检测 器检测，得到的图谱参见图1，图谱确定本实施例得到的提取物属于总皂苷类，是精制后的 短葶山麦冬总皂苷。在该总皂苷中，除了短葶山麦冬皂苷A、短葶山麦冬皂苷B和短葶山麦冬皂苷C 之外，还含有短葶山麦冬皂苷D (Lm-4) :ruscogenin 1-β-D-fucopyranoside及短葶山麦冬阜昔 E(Lm_5) :pennogenin 3-0-[4‘ -O-rhamnopyranosyl (1 3)-β -D-xylopyranosyl (1 — 4) ] - β-D-fucopyranoside，具体参见 Yu B Y, Hirai Y, Shoji J, etal. Comparative studies on the constituents of ophiopogonis tuber and its congeners. VI. Studies on the constituents of the subterranean part of Liriope spicatavar. prolifera and L. muscari. (1). Chem Pharm Bull. 1990 ；38 (7) : 1931—1935。实施例2 取短葶山麦冬药材，加大约8倍量75%乙醇浸渍提取2次；提取液回收溶剂至稠 膏状，加0. 5倍生药量(重量)水分散，以正丁醇萃取2 5次，合并萃取液，回收溶剂得山 麦冬粗总皂苷。将粗总皂苷再加生药量的0. 5重量倍的水溶解，上d-101型大孔树脂柱，先 以水洗脱，至洗脱液molish反应呈阴性，再以10倍柱体积的80% wt的乙醇洗脱，洗脱液回 收溶剂，得短葶山麦冬总皂苷。经过采用高效液相色谱分析的方法(HPLC)进行检测，色谱柱是C18，洗脱相为甲 醇_水梯度洗脱的溶液，DAD和qtof检测器检测，得到的图谱确定本实施例得到的提取物 属于总皂苷类，是精制后的短葶山麦冬总皂苷。实施例3 取短葶山麦冬药材，加大约4倍量80%乙醇加热提取；提取液回收溶剂至稠膏状， 加1. 5倍生药量(重量)水分散，以正丁醇萃取4次，合并萃取液，回收溶剂得山麦冬粗总皂 苷。将粗总皂苷再加生药量的1. 5重量倍的水溶解，上d-101型大孔树脂柱，先以水洗脱， 至洗脱液molish反应呈阴性，再以15倍柱体积的50% wt的乙醇洗脱，洗脱液回收溶剂，得 短葶山麦冬总皂苷。实施例4 取短葶山麦冬药材，加大约20倍量90%乙醇加热提取；提取液回收溶剂至稠膏 状，加1. 5倍生药量(重量)水分散，以正丁醇萃取4次，合并萃取液，回收溶剂得山麦冬粗 总皂苷。将粗总皂苷再加生药量的1. 5重量倍的水溶解，上d-101型大孔树脂柱，先以水洗 脱，至洗脱液molish反应呈阴性，再以4倍柱体积的90% wt的乙醇洗脱，洗脱液回收溶剂， 得短葶山麦冬总皂苷。实施例5 取短葶山麦冬药材，加大约15倍量85%乙醇回流提取；提取液回收溶剂至稠膏 状，加等生药量(重量)水分散，以正丁醇萃取2次，合并萃取液，回收溶剂得粗总皂苷；将 粗总皂苷再加生药量的等重量倍的水溶解，上ab-8型大孔树脂柱，先以水洗脱，至洗脱液 molish反应呈阴性，再以8倍柱体积的75% wt的乙醇洗脱，洗脱液回收溶剂，得短葶山麦 冬总皂苷。
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权利要求
一种短葶山麦冬总皂苷的制备方法，该方法包括以短葶山麦冬根为原料，以乙醇提取，提取液用正丁醇萃取，得粗总皂苷；取粗总皂苷加水溶解后，使其通过非极性大孔树脂柱，先以水洗脱至洗脱液无色，再以50 95％wt的乙醇溶液洗脱，收集洗脱液至洗脱液无色，得短葶山麦冬总皂苷。
2.权利要求1所述的制备方法，其中，所述的粗总皂苷通过下述方法制得以短葶山 麦冬根为原料，以相对于短葶山麦冬的原料重量的至少4倍量的浓度> 51% wt的乙醇提 取，提取液浓缩至相对比度1.35的稠膏，再用水分散，用正丁醇萃取，取正丁醇层萃取液， 干燥，得所述的粗总皂苷。
3.权利要求1所述的制备方法，其中，在乙醇提取短葶山麦冬根的过程中，所述的乙醇 的量为所述短葶山麦冬根重量的10-20倍。
4.权利要求2所述的制备方法，其中，在所述的提取液加水分散再用正丁醇萃取中，水 为短葶山麦冬根重量的0. 1 10倍，正丁醇为水的重量的0. 5 5倍。
5.权利要求1所述的方法，其中，所述的收集洗脱液至洗脱液无色后，得到的短葶山麦 冬总皂苷中短葶山麦冬皂苷A的含量为3-25% Wt0
6.一种短葶山麦冬总皂苷，其为采用权利要求1所述的方法得到。
7.权利要求6所述的短葶山麦冬总皂苷，该短葶山麦冬总皂苷中，短葶山麦冬皂苷A含 量为3-25% wt,以所述的短葶山麦冬总皂苷的重量为100%计。
8.权利要求6所述的短葶山麦冬总皂苷，其中，所述的粗总皂苷通过下述方法制得 以短葶山麦冬根为原料，以至少为短葶山麦冬重量的4倍量的浓度> 51% wt的乙醇提取， 提取液浓缩至稠膏，再加水分散，用正丁醇萃取，得粗总皂苷；取粗总皂苷加水溶解，过滤弃 去不溶物后，滤液通过非极性大孔树脂柱，先以水洗脱至洗脱液无色，再以乙醇的水溶液洗 脱，收集洗脱液至洗脱液无色，得短葶山麦冬总皂苷。
9.权利要求6所述的短葶山麦冬总皂苷在制备治疗肿瘤的药物中的用途。
10.权利要求9所述的用途，其中，所述的肿瘤为良性肿瘤和/或包括肝癌、肺癌、宫颈 癌的恶性肿瘤。
全文摘要
本发明提供了一种短葶山麦冬中总皂苷及其制备方法，该方法包括以短葶山麦冬根为原料，以浓度≥51％wt的乙醇提取，提取液用正丁醇萃取得粗总皂苷；取粗总皂苷加水溶解，优选过滤弃去不溶物，使该粗总皂苷溶液通过非极性大孔树脂柱，先以水洗脱至洗脱液无色，再以乙醇的水溶液洗脱，收集洗脱液至洗脱液无色，得总皂苷；本发明还提供了上述方法得到的短葶山麦冬总皂苷；本发明的方法提取精制得到的短葶山麦冬总皂苷具有明确的抗肿瘤作用。
文档编号A61P35/00GK101926921SQ200910142488
公开日2010年12月29日 申请日期2009年6月18日 优先权日2009年6月18日
发明者林瑞超, 王钢力, 聂黎行, 黄权成, 黄鹏腾 申请人:中国药品生物制品检定所