一种短葶山麦冬组织培养方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及植物生物技术中植物组织培养的方法，具体地说，涉及一种短葶山麦冬组织培养方法。
【背景技术】
[0002]短葶山麦冬(Zir1pe muscari )为百合科山麦冬属集药用、观赏于一体的园林地被植物。我国的短葶山麦冬主要分布于淮河以南的省区，以湖北、福建、浙江和四川居多。短葶山麦冬是一种具有多种药理功效的药用植物，既可作为功能性保健食品以提高免疫系统耐受力，又可用于心肌缺血、心肌梗塞、抗心律失常等疾病的临床治疗。
[0003]由于山麦冬用药部位以块根为主，其野生资源已处于严重衰竭状态，受人为破坏严重。目前山麦冬种苗主要是种子繁育为主，因种子发芽率低下，受季节制约，故远远不能满足大规模生产对山麦冬种苗的需要。而植物组织培养技术具有加速育种进程、缩短繁殖时间、改良植物品质、节省空间、减少劳动、可终年生产、不受自然条件限制等特点，可有效解决山麦冬种苗繁殖耗时长、繁殖系数低的问题。目前虽然有关于山麦冬组织培养研究报道，但都存在外植体消毒困难、易产生内生细菌、繁殖系数低等问题，而本发明具有简便、经济、可操作性高等特点，并有效地提高了芽的诱导率、继代系数及生根率，为其大规模工厂化生产奠定基础。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供出一种短葶山麦冬组织培养方法，本本发明以短葶山麦冬茎尖为外植体，经过外植体消毒、启动培养、增殖培养、壮苗培养、生根培养、炼苗及移栽等过程有效地提高了芽的诱导率、继代系数及生根率，进而建立了完整的短葶山麦冬组织培养体系，从而实现了本发明的目的。
[0005]本发明的一种短葶山麦冬组织培养方法，包括以下的步骤:
(I)外植体消毒:取健壮短葶山麦冬当年生的茎尖，刷洗干净后，用洗衣粉溶液浸泡5?1min后用软毛刷轻轻刷洗外植体表面将其表面的尘土和部分菌体去除，然后用自来水冲洗I?3h后置于超净工作台中，先用75%乙醇消毒5?30s后用无菌水洗3?5次，再用0.1%升萊溶液消毒10?25min,用无菌水冲洗4?6次再用无菌滤纸擦干表面的水珠后备用。
[0006](2)启动培养:将经步骤(I)处理后的茎尖接种到启动培养基进行芽诱导，接种后先在25?28°C条件下全暗培养I?7天后统计污染率和存活率。然后置于每天光照10?12小时，光照强度为1500?20001x条件下培养30天，统计组培苗的萌动率及生长情况。
[0007](3)增殖培养:将步骤(2)培养得到的生长正常、有明显茎、叶结构的丛生芽切下并转入增殖培养基上进行继代培养，接种后先在25?28°C条件下全暗培养I?3天，然后置于每天光照10?12小时，光照强度为1000?20001x，置于培养温度为25?28°C的条件下培养30天后观察生长情况和芽增殖情况。多次反复切割芽体进行继代培养，以得到更多的丛生芽。
[0008](4)壮苗培养:将经步骤(3)增殖培养的丛生苗切成适当大小，接种到壮苗培养基上进行壮苗培养，以利于生根。接种后先在25?28°C条件下全暗培养I?3天，然后置于每天光照11?12小时，光照强度为2000?30001x，培养温度为25?28°C的条件下培养至组培苗生长到2cm以上。
[0009](5)生根培养:将步骤(2)、(3)或(4)过程获得的高度2.0cm以上的组培苗接种到生根培养基上进行生根培养，接种后先在25?28°C条件下全暗培养I?3天，然后置于每天光照11?12小时，光照强度为2000?30001x，培养温度为25?28°C的条件下培养I个月后统计生根情况。
[0010](6)炼苗移栽:将步骤(5)获得的高约6?8cm的生长良好且健壮的生根试管苗去瓶盖置于自然光照下炼苗5?7天后，将试管苗从培养瓶中取出，洗掉根部培养基，栽入由营养土:珍珠岩=3:1混合成的基质，置于光照培养箱内培养，每天以1/4MS大量兀素营养液给幼苗浇水，保持湿度。待幼苗成活后再移栽大田。
[0011]上述步骤(2)所述的启动培养基为:MS+0.1?lmg/L6-BA+0.1?0.5mg/LNAA+15 ?30g/L 蔗糖 +3.5 ?6.0g/L 琼脂，pH 为 5.4 ?5.8。
[0012]上述步骤(3)所述的增殖培养基为:MS+0.1?1.0mg/LNAA+1?5mg/L 6-BA+15?30g/L 鹿糖 +3.5 ?6.0g/L 琼脂，pH 为 5.4 ?5.8。
[0013]上述步骤(4 )所述的壮苗培养基为:MS+0.0I?0.5mg/L 6-BA+0.0I?lmg/LGA3+15 ?30g/L 蔗糖 +3.5 ?6.0g/L 琼脂，pH 为 5.4 ?5.8。
[0014]上述步骤(5)所述的生根培养基为:1/2MS+1?5mg/L IBA+15?30g/L蔗糖+3.5 ?6.0g/L 琼脂，pH 为 5.4 ?5.8。
[0015]本发明的优点是:通过植物组织培养技术短时间内快速获得大量短葶山麦冬优良品种试管苗的方法。本发明以短葶山麦冬茎尖为外植体，经过外植体消毒、启动培养、增殖培养、壮苗培养、生根培养、炼苗及移栽等过程有效地提高了芽的诱导率、继代系数及生根率，进而建立了完整的短葶山麦冬组织培养体系，以便进行短葶山麦冬种苗工厂化生产。
【具体实施方式】
[0016]以下实施例是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制。
[0017]实施例1:
(I)外植体消毒:取健壮短葶山麦冬当年生的茎尖，刷洗干净后，用洗衣粉溶液浸泡5min后用软毛刷轻轻刷洗外植体表面将其表面的尘土和部分菌体去除，然后用自来水冲洗Ih后置于超净工作台中,先用75%乙醇消毒5s后用无菌水洗3次，再用0.1%升汞溶液消毒1min,用无菌水冲洗4次再用无菌滤纸擦干表面的水珠后备用。
[0018](2)启动培养:将经步骤(I)处理后的茎尖接种到启动培养基进行芽诱导，接种后先在28°C条件下全暗培养3天后污染率低至3%，存活率达78.9%。然后置于每天光照10小时，光照强度为1500x条件下培养30天，组培苗的萌动率为68%。所述的启动培养基为:MS+0.5mg/L6-BA+0.lmg/L NAA+30g/L 蔗糖 +4.5g/L 琼脂，pH 为 5.8。
[0019](3)增殖培养:将步骤(2)培养得到的生长正常、有明显茎、叶结构的丛生芽切下并转入增殖培养基上进行继代培养，接种后先在28°C条件下全暗培养I天，然后置于每天光照10小时，光照强度为10001X，置于培养温度为28°C的条件下培养30天后芽增殖系数为4.89。多次反复切割芽体进行继代培养，以得到更多的丛生芽。所述的增殖培养基为:MS+0.5mg/LNAA+3mg/L 6_BA+15g/L 蔗糖 +4.0g/L 琼脂，pH 为 5.8。
[0020](4)壮苗培养:将经步骤(3)增殖培养的丛生苗切成适当大小，接种到壮苗培养基上进行壮苗培养，以利于生根。接种后先在28°C条件下全暗培养I天，然后置于每天光照11小时，光照强度为20001x，培养温度为28°C的条件下培养15天组培苗即可生长到2cm以上。所述的壮苗培养基为:MS+0.3mg/L 6-BA+0.05/L GA3+15g/L蔗糖+3.5g/L琼脂，pH为5.8ο
[0021](5)生根培养:将步骤(2)、(3)或(4)过程获得的高度2.0cm以上的组培苗接种到生根培养基上进行生根培养，接种后先在28°C条件下全暗培养I天，然后