专利名称：：短葶山麦冬c在制药中的应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于制药领域，涉及短葶山麦冬c在制药中的应用。
背景技术：
：短葶山麦冬Z/〃'ope/mwcan'(Decne.)Baily作为《中国药典》1995版新增品种-山麦冬的原植物之一，已在长期的传统中医临床实践中显示出其特有的疗效。但是，短葶山麦冬在临床的应用仍集中于饮片或是复方制剂，如生脉散、参麦注射液等，而迄今还未见单独以其提取物或单体化合物作为临床药物使用的，因此，对其进行深入研究和开发具有重要意义。在化学成分研究方面，主要集中在短葶山麦冬的皂苷类成分的分离和鉴别，由于山麦冬属植物须根中的总皂苷含量在相当长的生长期内远高于其块根，因此将短葶山麦冬的须根作为研究的对象，迄今已从短葶山麦冬中分离并鉴别了六个单体皂苷类成分，其中一个为短葶山麦冬C(DT13)。至今为止，世界上还没有一个理想的抗肿瘤转移药物。肿瘤患者一旦出现转移，即使进行手术、放、化疗，生存期限仍无法得到较好的延长。短葶山麦冬C在制备抗肿瘤转移药方面的应用也未见报导。
发明内容本发明的目的是提供短葶山麦冬C在制备抗肿瘤转移药方面的应用。本发明的技术方案是短葶山麦冬C在制备抗肿瘤转移药方面的应用，特别是在制备与肿瘤新生血管生成抑制相关的抗肿瘤转移药中的应用。研究显示，短葶山麦冬c对乳腺癌、黑色素瘤等多种肿瘤转移有明显抑制作用。本发明中短葶山麦冬c可以和药学上允许的任意一种辅料制成药物组合物，也可以和其他与短葶山麦冬c不发生拮抗作用的抗肿瘤转移药组成复方制剂。这些制剂可以是药学上允许的任意一种剂型，包括但不限于片剂、颗粒剂、丸剂、口服液、注射剂、膜剂、胶囊剂、脂质体等。短葶山麦冬c的用量可根据用药途径、患者年龄、体重、体表面积、所治疗的疾病类型和严重程度等变化，其日剂量可以是lmg/kg，可以一次或多次施用。本发明的有益效果本发明研究发现DT13能够明显抑制人乳腺癌细胞的生长、迁移、黏附能力，体内发现DT13能够抑制黑色素瘤B16的肺转移。DT13作为一个具有明显抗转移活性的候选药物，研究阐明DT13的抗转移作用及其与新生血管生成抑制作用的相互关系，可以为从肿瘤新生血管生成抑制剂入手发展DT13抗肿瘤转移药物提供借鉴，为制备抗肿瘤转移药提供了新的选择。图1是DT-13对缺氧状态人乳腺癌细胞MDA-MB-435迁移能力的影响。图2是DT-13对缺氧状态人乳腺癌细胞MCF-7迁移能力的影响。图3是DT-13对缺氧状态人乳腺癌细胞MDA-MB-231迁移能力的影响。图4是DT-13对血管生成的抑制实验照片。图5是DT-13对血管生成的抑制实验照片。具体实施例方式以下通过实施例对本发明作进一步的阐述。实施例1DT-13对细胞的毒性检测(一)材料仪器超净工作台(苏州艾可林净化设备有限公司)，恒温C02培养箱(德国Heraeus公司)，酶联免疫检测仪(美国BIO-RAD公司)，倒置生物显微镜(日本OLYMPUS公司)，平板摇床(江苏省光明实验仪器厂)。试剂RPMI1640、F12培养基(GIBCO)，胰蛋白酶(SIGMA)，新生牛血清(HYCLONE)，MTT(SIGMA)，DMSO(SIGMA)。细胞株人乳腺癌细胞MDA-MB-435、MDA-MB-231、MCF-7。(二)方法1、取处于指数生长期状态良好的细胞各一瓶，加入0.25%胰翠白酶消化液，消化使贴壁细胞脱落，计数24X10"个/ml，制成细胞悬液。2、取细胞悬液接种于96孔板上，置恒温002培养箱中培养24小时。3、换液，加入受试药物DT-13，20lal/孔，培养48小时。4、将MTT加入96孔板中，培养箱中反应4小时。5、吸去上清液，加入DMSO,150^1/孔，平板摇床上振摇5分钟。6、用酶联免疫检测仪在波长为570nm处测定每孔的吸光值，并计算细胞抑制。细胞抑制率％=(三)结果人乳腺癌细胞435阴性对照组OD值一药敏组OD值DT-13阴性对照组OD值终浓度M细胞抑制率％1><10-79.631>-13.271>-19.331>(IO"413.27xioo%人乳腺癌细胞MCF-7人乳腺癌细胞231终浓度M细胞抑制率％lxl(T730.52lxl0"622.99DT-13lx10-5-9.03lxlO"445.23终浓度M细胞抑制率％lx10-724.1114.22DT-13lxl0—5-11.54lxl(y413.76实施例2DT-13对缺氧状态细胞黏附能力的影响目的体外检测缺氧状态下，人乳腺癌细胞对基底膜粘附能力的变化材料六孔板，96孔板，PBS，1%明胶，2%BSA，无血清培养液，10%小牛血清培养液，消化液(0.25%胰蛋白酶)，MTT试齐IJ，DMSO方法一、明胶板的制备1、称取一定量的明胶粉，按照lg/100ml量加入热的PBS溶解，趁热点入96孔板中，30ul/孔，平放并晃动，使明胶平铺孔底，注意不要有气泡。2、放置过夜，将明胶吸出，PBS洗一遍。3、用2%BSA封闭1小时后吸去。4、加入无血清培养基，20~3(^1/孔，平衡l小时以上，后吸去。，二，细胞培养1、生长旺盛的人乳腺癌细胞，培养于六孔板中，计数7X1(^9X104,2ml/孔。2、培养至细胞长至铺满孔底80%时，去掉培养基，PBS洗一遍，换成无血清培养基，并且加入受试药物DT-13,常氧培养。三，黏附能力测定1、培养后的细胞去培养基，PBS洗一遍，消化，离心，制成无血清细胞悬液。2、将无血清细胞悬液加入处理好的明胶板中，200nl/孔，每一个剂量设10个平行孔。空白组仅加入无血清培养基。3、培养1小时后，用注射器将培养液吸去，PBS洗一遍，方法为加入PBS200p1/孔，枪头小心吹打10下，用注射器吸出。4、加入MTT40(al/孔，孵育4小时。5、弃去MTT，加入DMSO，150|al/L,平板摇床上振摇5分钟。6、用酶联免疫检测仪在波长为570nm处测定每孔的吸光值，并计算细胞黏附抑制率阴性对照组OD值一药敏组OD值细胞黏附抑制率％=-----------------------------------xl00阴性对照组OD值-空白组OD值结果MDA-MB-231细胞黏附抑制率(％)DT-1310-8mol/l20.98DT-1310-7mol/l30.26DT-1310-6mol/l50.12DT-1310-5mol/l55.94MDA-MB-435DTI3IO一58DTI3l一63DT130脚M43MCF-7DT13l一28.6DT13O.l一37.1DT1310nM59.1DT13固81.6实施例3DT-13对缺氧状态细胞迁移能力的影响用BoydenChamberTranswell检测细胞迁移能力。该装置分内外两室。内室底部为多聚碳酸盐滤膜(孔径8pm)，先用1%明胶包被，再用无血清的培养液平衡1h。人乳腺癌细胞(1.5x104个细胞A00pl)悬于含2y。FBS及不同浓度受试化合物的培养液种入内室。外室则加入0.6ml含或不含VEGF(20ng/ml)的培养液。37'C孵育6h后，弃去孔中培养液，用90%乙醇固定细胞10miii。用棉签轻轻擦去内室上层未迁移的细胞，0.10/0结晶紫常温染色10min，用PBS漂净多余染料，最后用10%乙酸100^1/孔抽提10min，用可调波长式微孔板酶标仪(VERSAmaxTM，MolecularDeviceCorporation,Sunnyvale,CA，USA)在600nm下测定OD值。结果见图l、2、3,说明DT13能够明显抑制三种乳腺癌细胞的迁移。实施例4DT-13对血管生成的抑制实验实验材料6日龄鸡蛋购于南京浦口、经消毒的手术器械、粗针头、弯镊、孵箱、经灭菌的滤纸片(制药膜)、DT-13。操作药膜的制备DT-13药物浓度为Pl(^M加入到直径0.5cm灭菌滤纸膜上，分别加30pl,1(^1，lpl，以制备不同浓度的药膜。1、将6日龄受精鸡蛋擦拭后大头朝上固定；2、用粗针头刺破气室处蛋壳；3、用弯镊开窗；4、将表面膜小心剥除，选取血管最少的部位放置药膜；5、宽胶带封口，标记后放于孵箱，2日后拍照观察结果。结果见图4，箭头处为放置药膜处。第二次实验结果见图5。药物浓度为30nrno1，20nmo1，lOnmol，lnmol，操作过程同第一次实验步骤。两次实验结果均发现，与空白对照相比，DT-13在lOnmol就有明显的血管生成抑制作用。实施例5DT-13对B16黑小鼠转移瘤的抑制作用小鼠黑色素瘤细胞B16尾静脉注射C57小鼠，注射细胞量1*106个，同时给药DT-13二周后处死动物，数肺部转移灶个数进行统计。组别剂量动物数动物数开始体重结束体重肺重/体重肺转移灶mg/kg(开始)(结束)(克)(克)(个数)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>*:P<0.05**:P<0.01，与溶剂对照组相比。DT-13高、中剂量组与溶剂对照组相比，肺重/体重的比值明显下降，且肺部转移灶数量也明显降低。结果显示，DT-13对B16黑小鼠转移瘤有较好的抑制作用。权利要求1、短葶山麦冬C在制备抗肿瘤转移药中的应用。2、根据权利要求1所述的应用，其特征在于抗肿瘤转移药为肿瘤新生血管生成抑制剂。3、根据权利要求l所述的应用，其特征在于肿瘤为乳腺癌、黑色素瘤。全文摘要本发明属于制药领域，公开了短葶山麦冬C在制药中的应用。本发明提出了短葶山麦冬C在制备抗肿瘤转移药方面的应用，特别是在制备与肿瘤新生血管生成抑制相关的抗肿瘤转移药中的应用。本发明研究发现短葶山麦冬C能够明显抑制人乳腺癌细胞的生长、迁移、黏附能力，能够抑制黑色素瘤B16的肺转移，为制备抗肿瘤转移药中的应用提供新的选择。文档编号A61P35/00GK101352448SQ20081019604公开日2009年1月28日申请日期2008年9月11日优先权日2008年9月11日发明者余伯阳,立孙,张陆勇,伟施,朱丹妮,林森森,袁胜涛申请人:中国药科大学