专利名称：一种抗艾滋病表面糖蛋白的全人单克隆抗体及其制备方法
技术领域：
本发明属于生物医学领域，有关于一种抗艾滋病表面糖蛋白的全人单克隆抗体及其制备方法，尤其有关于一种抗艾滋病表面糖蛋白gp41的全人单克隆抗体及其制备方法。
背景技术：
自首例艾滋病(AIDS)于1981年6月被美国疾病控制中心(CDC)确认以来，艾滋病横行肆虐于全球，严重威胁着人类的健康和生存。据联合国艾滋病规划署和世界卫生组织的最新统计，截至2001年底，全世界共有500万人感染上艾滋病毒，至少有4000万艾滋病毒携带者，其中270万人是15岁以下的儿童。在全球范围内，AIDS是十大主要死因之一。按目前发展趋势预测，在不久的将来，AIDS死亡将替代一些常见死因而进入五大死因之列。我国自1985年在云南发现首例AIDS以来，HIV感染人数不断上升，尤以近年来发展势头迅猛，目前据专家估计，我国实际HIV感染者可能已逾100万，流行学研究表明入侵我国的艾滋病病毒现已有两个病毒类型(HIV I、HIV II)及其8种亚型分类，两个病毒类型间还存在有混合。因此积极寻找抗艾滋病药物、控制HIV的感染，已经越来越被关注。
自齐多夫定(AZT)—第一个治疗HIV感染药物于1987年被美国FDA批准上市后，抗艾滋病药物的研究发展突飞猛进，目前国外已有14个药物上市，主要针对HIV复制过程的关键酶-HIV逆转录酶(HIVRT)及HIV蛋白酶(HIVPR)。自1995年以来，每年都有2至3个新品种上市，是抗病毒药物发展史上进展最迅速的药物，充分说明国际上为研制抗艾滋病药物已投入了巨大人力、财力，以期克制这一危害人类健康的元凶，同时也说明了迄今还未出现能完全控制HIV感染的药物，生命科学工作者开始努力寻找新的有效治疗途径。
艾滋病主要是HIV I感染导致，HIV I入侵宿主细胞的过程分为两个步骤受体识别和膜融合。HIV I首先识别宿主细胞表面的特异受体蛋白并与之相结合。这种结合引发了病毒和宿主细胞表面的复杂构象变化，导致HIV I包膜与宿主细胞质膜相融合，使得HIV I核心颗粒进入宿主细胞的原生质中。HIV I入侵人体过程中起核心作用的是包膜糖蛋白，新型的抗病毒药物设计旨在切断这一个感染的关键门户。
HIV I入侵的第一步是gp120与细胞表面的受体分子CD4相结合，gp120的糖基化程度很高，其分子量有一半以上来自糖链，序列对比分析表明，不同HIV I株中gp120的变异程度很高，这也是HIV I易于逃避gp120抗体的主要原因(Modrow S，Hahn B H，Shaw G M，et al，J Virol，1987；61570)。共受体在HIV I入侵中的作用不容忽视，嗜T细胞HIV I感染必需的辅助因子-融合素(fusin)(Feng Y，Broder C C，Kennedy P E，et al，Science，1996；272872)，即CXCR4；初始嗜巨嗜细胞HIV I株需要共受体CCR5(Atchison R E，Gosling J，Monteclaro F S，et al，Science，1996；2741924)。gp120与CD4以及CXCR4或CCR5形成一种复杂的结构，而决不仅仅是简单的位点结合。这种结构一旦形成，就使gp120与gp41脱离，从而启动了HIV I入侵宿主细胞的下一过程膜融合。
基于上述原理，已有不少公司分别正在开发以CXCR3和CCR5为药靶的新药。目前Trimeris和Hoffmann-La Roche公司针对gp41抗原，已经开发出多肽抗体药物T20(36个氨基酸)。T-20在作用其他抗病毒药物治疗失败的病人时，结果表明在78个至少用过11种抗艾滋病药物治疗的病人中，55-60％的病人体内HIV的载量下降了90％，在治疗4个月后，1/3的病人体内不再检测到HIV的存在。实验的结果表明了以gp41为靶点开展药物研究的可行性。以gp41为靶点的药物T-20已经上市，但在长期使用病人身上出现许多问题，如T-20分子太小，很容易产生抗性；遇酸不稳定，不能进行口服；一天要静脉注射两次等。
患者感染HIV后，会产生抗HIV包膜糖蛋白的抗体，临床研究表明，被动性免疫治疗(passive immunotherapy，PIT)，即转输感染早期并具有较强抗艾滋病抗体的患者的血清，对艾滋病的晚期患者有一定的保护作用，能延缓病程的恶化，增加艾滋病患者的平均生存时间，PIT与现有的化学药物治疗相比无明显副作用，这预示中和性抗体是治疗艾滋病的更佳途径。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种抗艾滋病病毒表面糖蛋白gp41的全人单克隆抗体，其为全人抗体，没有鼠源性异种蛋白，无副作用。
本发明的另一目的在于提供一种抗艾滋病病毒表面糖蛋白gp41的全人单克隆抗体，其为无需抗体分子结构的变构转换及拼接等，技术更为简便，高通量筛选，开发周期短。
本发明的再一目的在于提供一种抗艾滋病病毒表面糖蛋白gp41的全人单克隆抗体，其为生产工艺简单，抗体产量高。
本发明的再一目的在于提供一种抗艾滋病病毒表面糖蛋白gp41的全人单克隆抗体，其为与人体内天然产生的抗体完全一致，具有经过人体整个免疫系统择优选择筛选的、最优的特异性亲和力和结合力。
为了实现上述目的，本发明提供了一种抗艾滋病病毒表面糖蛋白gp41的全人单克隆抗体。其特征为通过人-人杂交瘤技术或其他单克隆抗体技术制备得到；具有序列9报道的重链和序列10报道的轻链；没有鼠源性异种蛋白；以及，与人体内天然产生的抗体完全一致，具有经过人体整个免疫系统择优选择筛选的、最优的特异性亲和力和结合力。
为了实现上述目的，本发明还同时提供有一种抗艾滋病病毒表面糖蛋白gp41的全人单克隆抗体的制备方法。其特征是至少包括如下步骤(a)筛选产生高滴度gp41抗体的病人，分离艾滋病患者的外周血B细胞；(b)将人骨髓瘤Karpas 707H和外周血B细胞融合产生杂交瘤；
(c)筛选产生gp41高亲和力抗体的杂交瘤；(d)制备和纯化抗体；(e)抽提细胞总mRNA，通过通用引物，获得抗体序列；以及，(f)装入T载体进行测序。
如本领域的普通技术人员所知，一种氨基酸可以有多种密码子编码，但密码子编码获得的氨基酸序列不变。因此本发明提供了一种核酸密码子序列，但并不仅限于这种核酸序列。
图1为本发明中通用引物序列1的名称和描述。
图2为本发明中通用引物序列2的名称和描述。
图3为本发明中通用引物序列3的名称和描述。
图4为本发明中通用引物序列4的名称和描述。
图5为本发明中通用引物序列5的名称和描述。
图6为本发明中通用引物序列6的名称和描述。
图7为本发明中重链基因序列7的名称和描述。
图8为本发明中轻链基因序列8的名称和描述。
图9为本发明中重链蛋白序列9的名称和描述。以及，图10为本发明中轻链蛋白序列10的名称和描述。
具体实施例方式
本发明提供了一种抗艾滋病病毒表面糖蛋白gp41的全人单克隆抗体。该抗体具有序列9报道的重链和序列10报道的轻链，没有鼠源性异种蛋白，与人体内天然产生的抗体完全一致，具有经过人体整个免疫系统择优选择筛选的、最优的特异性亲和力和结合力。该抗体可以用于临床上艾滋病的诊断和治疗。
同时，本发明还提供有一种该抗体的制备方法，以下通过一个较佳实施例对该方法所至少包含的步骤作出说明。
(a)筛选产生高滴度gp41抗体的病人，分离艾滋病患者的外周血B细胞。
选择100名自愿者，均为艾滋病患者，各自去静脉血5ml，分离血清，-20℃保存，经商业化gp41试剂盒筛选，抗gp41抗体阳性且滴度大于1；64的病人为目标自愿者，然后在目标自愿者取外周血50ml，加淋巴细胞分层液，200g离心，取界面B细胞层，取100ul B细胞做免疫珠试验判断是否致敏。合并致敏的B细胞，用RPMI 1640洗涤3次。
(b)人骨髓瘤Karpas 707H和外周血B细胞融合产生杂交瘤。
用RPMI 1640调B细胞至5×106/ml，人骨髓瘤细胞Karpas 707H用RPMI1640调至2×106/ml。将Karpas 707H与致敏人B细胞各1ml混合，在2分钟内逐滴加入新鲜配制的2mlPEG-2000，然后立即快速滴入50ml RPMI 1640终止PEG作用，200g离心5分钟，弃上清，重复加入50ml RPMI 1640洗涤，将融合细胞用HAT培养基配制成1×106/ml，预培养饲养细胞一天，在96孔细胞培养板中每孔加入100ul，HAT RPMI 1640培养10天(37℃，5％CO2)，转HT RPMI 1640培养7天。
(c)筛选产生gp41高亲和力抗体的杂交瘤。
用于筛选克隆的96孔微孔板用gp41胞外区包被，每孔加100ul细胞培养上清，37℃培养过夜，洗涤后加HRP标记的鼠抗人IgG Fc mAb，37℃培养30分钟，洗涤后加入底物(TMB)显色，OD值大于10×空白OD值为阳性，得到阳性克隆。
(d)制备和纯化抗体。
将阳性克隆杂交瘤细胞调为1×106/ml，在RPMI 1640添加10％FBS的培养基中37℃培养过夜，1000g离心5分钟取上清，测抗体滴度为1∶20000，共80ml，加等量50％的甘油，-20℃保存。用gp41抗原的胞外段经CNBr偶联到sephrose 4B制备全人gp41单克隆抗体亲和层析柱，全人gp41单克隆抗体亲和层析柱用0.01M PB，pH6.8，0.1mM a-mercaptothanol BufferA预平衡4小时，4℃保存。其操作是首先将160ml含全人gp41单克隆抗体的上清，假如200ml柱体积的亲和层析柱中，4℃过夜，然后用BufferA充分流洗到OD280小于0.01，流速8ml/min，用0.01M PB，pH6.8，0.1mM a-mercaptothanol，150mM NaCl Buffer B洗脱，流速2ml/min，收集OD280＞0.02的部分，冷冻干燥，得到纯化的全人gp41单克隆抗体。
(e)抽提细胞总mRNA，通过通用引物，获得抗体序列；以及，(f)装入T载体进行测序。
根据抗体氨基酸及核酸序列，设计通用引物H5，H3，κ5，κ3，λ5，λ3如下。通用引物分别为序列1，2，3，4，5，和6，其名称和描述分别见图1至图6。在序列1至6中，M＝A/C，R＝A/G，W＝A/T，S＝G/C，Y＝C/T，K＝G/T，V＝A/G/C，H＝A/C/T，D＝A/G/T，B＝G/C/T。
取表达量最高的杂交瘤细胞约2×106个，用Qiagen公司的blood mini RNA抽提试剂盒抽提总RNA，然后取2ul RNA为模板，以Oligo(dT)20为逆转录引物，用Invitrogen公司的SuperScriptIIIFirst-Strand Synthesis System for RT-PCR试剂盒进行逆转录。取逆转录产物1ul作为PCR模板，分别以H5+H3引物、κ5+κ3引物、λ5+λ3引物，用Roche公司的Expand HighFidelityPLUSPCR System扩增抗体基因，反应体系为5×Expand HiFiPLUSReaction Buffer 10ul，模板1ul，5’和3’引物各1ul，dNTP(10mM each)1ul，25mM MgCl21ul，Expand HiFiPLUSEnzyme 0.5ul，无菌水补加到50ul。反应条件为94℃30秒，54℃30秒，72℃2分钟，共进行30个循环。反应结束后取3ul电泳检测，发现H5+H3引物组和λ5+λ3引物组扩增出特异性单一条带，而κ5+κ3引物组无特异性条带扩出。电泳回收重链PCR产物和λ链PCR产物，分别连接克隆到pGEM-T载体中，进行基因测序，分别获得名称和描述如图7、图8所示的重链及轻链(λ链)基因序列7和序列8，翻译得到名称和描述分别如图9和图10所示的重链及轻链(λ链)蛋白序列9和序列10。
如本技术领域的人所知，本发明的附图和实施例仅为说明本发明的功能、结构和原理而不应当成为对本发明理解上的限制；同时，本发明的目的均已经实现。上述实施例可能在不脱离本发明原理的情况下有所变更，故此，本发明的保护应以权利要求书中所描述的范围为准。
权利要求
1.一种抗艾滋病病毒表面糖蛋白gp41的全人单克隆抗体。其特征为所述抗体为通过人-人杂交瘤技术或其他单克隆抗体技术制备得到；具有如序列9报道的重链和如序列10报道的轻链；没有鼠源性异种蛋白；以及，与人体内天然产生的抗体完全一致，具有经过人体整个免疫系统择优选择筛选的、最优的特异性亲和力和结合力。
2.一种如权利要求1中所述的抗体的制备方法，其特征是至少包括如下步骤(a)筛选产生高滴度gp41抗体的病人，分离艾滋病患者的外周血B细胞；(b)将人骨髓瘤Karpas707H和外周血B细胞融合产生杂交瘤；(c)筛选产生gp41高亲和力抗体的杂交瘤；(d)制备和纯化抗体；(e)抽提细胞总mRNA，通过通用引物，获得抗体序列；以及，(f)装入T载体进行测序。
全文摘要
本发明揭露了一种抗艾滋病病毒表面糖蛋白gp41的全人单克隆抗体及其制备方法。该抗体通过人－人杂交瘤技术或其他单克隆抗体技术制备得到，具有如说明书中序列9报道的重链和序列10报道的轻链，没有鼠源性异种蛋白，并且与人体内天然产生的抗体完全一致，具有经过人体整个免疫系统择优选择筛选的、最优的特异性亲和力和结合力。该种抗艾滋病病毒表面糖蛋白gp41的全人单克隆抗体的制备方法至少包括如下步骤(a)筛选产生高滴度gp41抗体的病人，分离艾滋病患者的外周血B细胞；(b)将入骨髓瘤Karpas707H和外周血B细胞融合产生杂交瘤；(c)筛选产生gp41高亲和力抗体的杂交瘤；(d)制备和纯化抗体；(e)抽提细胞总mRNA，通过通用引物，获得抗体序列；以及，(f)装入T载体进行测序。
文档编号C12N5/22GK1931876SQ200510027880
公开日2007年3月21日 申请日期2005年7月19日 优先权日2005年7月19日
发明者倪健, 杨子义, 罗鹏, 杨武剑 申请人:上海富纯中南生物技术有限公司