专利名称：斑马鱼组织因子途径抑制物－2基因和蛋白的制作方法
技术领域：
本发明属于生命科学领域。涉及斑马鱼组织因子途径抑制物-2(zebrafishtissue factor pathway inhibitor-2，zTFPI-2)的基因和蛋白，其编码的蛋白质与人TFPI-2具有很高的同源性，原位杂交证实斑马鱼体内确实存在此基因。
背景技术：
TFPI-2是一种Kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂，有三个Kunitz型结构域，能够抑制多种丝氨酸蛋白酶的活性，人体内主要由内皮细胞、成纤维细胞、角化细胞等合成和分泌，广泛存在于胰腺、肝脏、肾、肺等器官中。人TFPI-2(humanTFPI-2，hTFPI-2)能够抑制多种恶性肿瘤的侵袭转移，并与动脉粥样硬化斑块脱落有关，但生理功能尚不清楚。
斑马鱼已成为生物学研究的最佳脊椎动物模型之一，它个体小，产卵周期短，产卵量多且卵大；胚胎在体外快速发育，早期胚胎完全透明，二倍体的制作和突变体的获得均较容易，精子可以冷冻保存。斑马鱼基因组中的基因数目与人差不多，而且它的许多基因与人体存在对应关系。更为难得的是，斑马鱼的肿瘤发生与人类极为类似。所有这些特点使斑马鱼非常适合于胚胎学、发育遗传学和疾病功能基因组学的研究。因此，斑马鱼作为一种理想的分子生物学模式生物，拥有其他脊椎动物所无法相比的优点。
虽然人、猿、牛、小鼠和大鼠的TFPI-2基因已经克隆，但它在脊椎动物体内究竟具有什么样的生理功能还没有明确的答案。研究显示，绝大部分TFPI-2存在于细胞外基质(ECM)中，对多种蛋白酶具有重要的调节功能。许多研究者由此推测，TFPI-2在一些涉及到细胞外基质重塑的生理病理过程中可能发挥重要的作用，例如胚胎发育、伤口愈合、动脉粥样硬化、恶性肿瘤的侵袭转移等。鉴于模式生物斑马鱼的特点，在它的发育过程中研究TFPI-2的生理功能，具有其它模式生物不可比拟的优势，但前提是必须首先克隆到斑马鱼TFPI-2基因。
发明内容
本发明的目的是提供斑马鱼组织因子途径抑制物-2(zTFPI-2)的基因序列和其编码的蛋白质序列。
本发明提供了zTFPI-2的基因序列和蛋白质序列(序列1，序列2的核酸序列和该核酸序列编码蛋白质序列)，并应用原位杂交证实了zTFPI-2在斑马鱼体内的存在。
本发明提供了模式生物斑马鱼体内的一种kunitz型丝氨酸蛋白酶抑制剂的编码基因cDNA序列及由此预测的氨基酸序列，将其命名为斑马鱼TFPI-2(zebrafish TFPI-2，zTFPI-2)。zTFPI-2是一种典型的丝氨酸蛋白酶抑制剂，由232个氨基酸组成，其含有19个半胱氨酸，其中18个半胱氨酸组成9个二硫键，形成三个串联排列的kunitz结构域。与已知的hTFPI-2的三个结构域的同源性分别为63％、59％、71％。所述的蛋白质的第2个半胱氨酸残基以前的氨基酸残基数量和最后一个半胱氨酸残基以后的氨基酸残基数量可以发生任何数量上的变动。
本发明首先采用hTFPI-2的氨基酸序列在斑马鱼基因组及蛋白质数据库中进行比对，寻找斑马鱼体内与hTFPI-2同源的蛋白质。根据比对的结果获得斑马鱼TFPI-2的同源蛋白质及基因的部分序列。以此为基础采用RACE法克隆得到该基因的编码区序列及两端非编码区序列。
根据获得的cDNA序列标记探针，观察zTFPI-2基因在斑马鱼发育过程中的表达情况，结果证实该基因在斑马鱼体内确实存在。
根据zTFPI-2的cDNA序列，在斑马鱼的基因组文库中进行比对，得到该基因在斑马鱼体内的染色体定位、编码区的结构及碱基序列。
根据本发明的zTFPI-2的基因序列和氨基酸序列，以及其它已知物种的TFPI-2相应序列，采用生物信息学方法可得出TFPI-2在不同物种之间的进化关系和保守程度。
本发明对研究TFPI-2的生理功能，TFPI-2与肿瘤侵袭转移，胚胎发育和伤口愈合的关系提供了实验基础。
图1为zTFPI-2在受精后发育24小时的胚胎中有明显的表达。
具体实施例方式
实施例1 序列比对以hTFPI-2的蛋白质序列在Trust Sanger Institude斑马鱼数据库中进行比对，得到同源性最高的一段肽段Ensembl Translation，其ID为ENSDARP00000019243，cDNA序列为ENSDART00000024355，该序列由528bp组成，肽段的氨基酸数量为176。
实施例2 获得zTFPI-2 cDNA序列1.斑马鱼总RNA的提取采用Invitrogen公司组织RNA提取试剂提取斑马鱼总RNA，经甲醛变性琼脂糖凝胶电泳证明所提总RNA没有降解，没有DNA污染，可满足后续实验要求。
2.引物设计根据序列比对的结果设计下述引物P5’RACE outer5’------TCTTCACACTGCTGGCTGAT------3’P5’RACE inner5’------AAAACCGCTGAATGTCGTCA------3’P3’RACE outer5’------CAAAGACATGCGAGGAGTTCA------3’P3’RACE inner5’------TTCATCTCCAAGCAAAGCTG------3’5’KSMART IIA5′------AAGCAGTGGTACCAACGCAGAGTACGCGGG------3’3′KSMART II A5’------GGTTGGTACCGTTTTCCCAGTCACGACT(30)N-1N-----3’(N＝A，G，C，T；N-1＝A，G，C)KM13M45’------GGTTGGTACCGTTTTCCCAGTCACGAC-----3’引物全部由上海申能博彩生物技术公司合成。
3.zTFPI-2 5’和3’未知序列的克隆zTPFI-2未知序列的克隆采用Clontech公司的SMART技术进行，并作相应改进。具体步骤如下(1)第一条cDNA链合成
0.5ml反应管内混匀下述试剂斑马鱼总RNA 10μL(0.5μg)5’KSMART II A(12μM) 7μL3′KSMART II A(12μM) 7μL去离子水40μL总体积 64μL混匀上述试剂，置65℃2分钟，降温至42℃，加入下述试剂5×First-Strand缓冲液 20μLDTT(100mM) 2μL50×dNTP(10mM) 10μLRNase Inhibitor(20U/μL)5μLPowerScript逆转录酶 5μL总体积 42μL混匀上述试剂，置42℃30分钟。加入2μL 0.5M的乙二胺四乙酸二钠终止反应。本发明所述dNTP和逆转录酶等相关试剂购自Clontech公司。
(2)总cDNA的纯化取上述逆转录的反应产物，采用上海申能博彩生物技术公司的核酸纯化试剂盒纯化。具体操作按说明书进行。
(3)总cDNA的PCR扩增取上述纯化的cDNA40μL加入相同体积的去离子水，加入下述试剂去离子水 2μL10×PCR缓冲液10μL50×dNTP(10mM) 2μL5’KSMART II A(12μM)2μLKM13M4(12μM)2μLTakara HS DNA聚合酶(5U/μL)2μL总体积 20μL反应条件
(94℃30秒，55℃30秒，72℃3分钟)×15循环，72℃7分钟。
从反应管中取出30μL至另一新的反应管中作为优化管，剩余的反应体系置于4℃作为实验管。
自优化管中取出5μL备用，剩余反应体系按上述反应条件继续反应3个循环共18个循环)，取5μL备用。剩余20μL继续按上述条件反应3个循环(共21个循环)，取5μL备用。剩余15μL继续按上述条件反应3个循环(共24个循环)，取5μL备用。
剩余10μL继续按上述条件反应3个循环(共27个循环)，取5μL备用。剩余5μL继续按上述条件反应3个循环(共30个循环)。将每次取出的PCR产物进行1％琼脂糖电泳，观察PCR的结果。确定PCR产物不随循环次数增加而增加时的循环数为实验管的循环数。将4℃保存的实验管按上述反应条件进行反应，反应循环数为优化管确定的循环数。本发明实验所用DNA聚合酶购自日本Takara公司。
(4)总cDNA的环化取上一步反应的PCR产物30μL，用限制性内切酶KpnI酶切。反应体系如下PCR产物30μL10×缓冲液 10μL100×BSA 1μLKpnI(20U/μL) 10μL去离子水 49μL总体积 100μL37℃反应2小时。
反应产物采用上海申能博彩生物技术公司的核酸纯化试剂盒纯化。具体操作按说明书进行。
用T4DNA连接酶使酶切并纯化后的总cDNA环化，反应体系如下总cDNA 30μL10×T4 DNA连接酶缓冲液 10μLT4 DNA连接酶(6U/μL) 2μL去离子水 58μL总体积 100μL4℃反应过夜。
所述限制性内切酶，T4DNA连接酶购自美国NEB公司。
(5)zTFPI-2 cDNA未知序列的克隆用环化的斑马鱼总cDNA为模板做PCR反应，反应体系如下环化总cDNA(约1.0μg/μL) 0.5μL10×缓冲液5μLP5’RACE outer(25pmol/μL)1μLP3’RACE outer(25pmol/μL)1μLdNTP(10mM each) 1μLTakara HS DNA polymerase 0.5μL去离子水 41μL反应条件如下(94℃30秒，55℃30秒，72℃1分钟)×30循环72℃7分钟。
取上述PCR产物作模板，再进行PCR反应，反应体系如下PCR产物 0.5μL10×缓冲液5μLP5’RACE inner(25pmol/μL)1μLP3’RACE inner(25pmol/μL)1μLdNTP(10mM each) 1μLTakara HS DNA polymerase 0.5μL去离子水 41μL反应条件如下(94℃ 30秒，55℃ 30秒，72℃ 1分钟)×30循环72℃ 7分钟。
取PCR产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳，分析产物片断的大小。并用上海申能博彩生物技术公司的核酸纯化试剂盒纯化上述PCR产物。
纯化后的PCR产物与Invitrogen公司的pGEM-T载体重组，反应体系如下2×连接酶缓冲液 5μLpGEM-T(50ng) 1μLPCR产物 3μLT4 DNA连接酶 1μL
4℃连接过夜，转化大肠杆菌感受态DH5α，抽提质粒测序，该重组质粒命名为rpGEMTzTFPI-2。所用T载体购自Invitrogen公司。
实施例3 斑马鱼原位杂交1.探针标记用限制性内切酶SpeI使rpGEMTzTFPI-2充分线性化，反应步骤如下反应体系rpGEMTzTFPI-2(1μg/μL) 30μL10×反应缓冲液 10μL100×牛血清白蛋白1μLSpeI(10U/μL)8μL水 51μL总体积 100μL37℃反应过夜。
线性化的rpGEMTzTFPI-2采用上海申能博彩生物技术公司的核酸纯化试剂盒纯化，具体步骤按说明书进行。
采用线性化的rpGEMTzTFPI-2为模板，用地高辛标记的NTP进行RNA探针标记。反应体系如下10×T7 RNA聚合酶缓冲液2μLDTT(50mM) 2μL地高辛标记NTP混合物(每种2.5mM)4μLRNA酶抑制剂(40U/μL) 0.5μLrpGEMTzTFPI-2(0.5μg/μL) 1μLT7 RNA聚合酶(50U/μL) 1μL无RNA酶水 9.5μL37℃反应2小时。
加入2μL(2U/μL)的DNA酶，37℃孵育30分钟。
加入2ul乙二胺四乙酸二钠(pH8.0，0.2mol/L)，2.5ul氯化锂(4mol/L)，75ul无水乙醇零下20摄氏度过夜。4℃ 12000转/分钟离心30分钟，去上清，用50ul的无RNA酶的水溶解。变性琼脂糖凝胶电泳观察探针的质量。最后加入450ul的杂交缓冲液，备用。
2.胚胎固定取受精后发育24小时胚胎，用0.5毫升PBST洗涤两次。加入4％的多聚甲醛0.5毫升，室温静置5分钟，去多聚甲醛。再加入0.5毫升4％多聚甲醛室温静置5分钟，再置于4℃12-15小时。去多聚甲醛，用PBST0.5毫升洗涤一次。再用甲醇洗涤三次，最后加入0.5毫升甲醇冻存于零下20摄氏度。
3.杂交(1)用表1所示的溶液和时间使固定的胚胎重新水化表1
(2)在PBST中用细针头去掉绒毛膜；(3)在室温用10μg/ml的蛋白酶K消化胚胎10分钟；(4)室温用4％的多聚甲醛重新固定胚胎20分钟；(5)用0.5ml的PBST洗5次，每次5分钟；(6)在300μL杂交液中65℃预杂交2小时，杂交完毕前30分钟用杂交液1/20稀释探针置于65℃预热30分钟；(7)去除预杂交液换成含有探针的杂交液，在65℃杂交过夜；(8)去除杂交液，用表2溶液在65℃洗涤。溶液要在65℃预热30分钟，每种溶液洗涤时间为10分钟。
表2
(9)用0.5毫升0.2×SSC在65℃洗两次，每次30分钟；(10)用表3溶液洗涤
表3
(11)在PBST中加入2mg/ml的BSA和5％的绵羊血清作为封闭液，4℃封闭胚胎1-3小时；(12)用封闭液1/2000稀释碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体，使胚胎在此抗体溶液中4℃过夜；(13)用含有2mg/ml的PBST洗八次，每次15分钟；(14)用含有100mM Tris pH＝9.5、100mM的氯化钠、50mM的氯化镁和0.1％土温-20溶液平衡胚胎；(15)加入碱性磷酸酶显色液室温显色30分钟至1小时，观察结果。
本发明所采用的杂交相关试剂购自Roche诊断试剂公司。
实验结果表明，zTFPI-2在受精后发育24小时的胚胎中有明显的表达(附图1)。
无需进一步详细阐述，相信采用前面所公开的内容，本领域技术人员可最大限度地应用本发明。因此，前面的优选具体实施方案应被理解为仅是举例说明，而非以任何方式限制本发明的范围。
从以上描述，本领域技术人员可很容易地明了本发明的本质特征，而且在不偏离其主旨和范围的情况下，可对本发明进行各种变更和改进。
SEQUENCE LISTING<110>复旦大学<120>斑马鱼组织因子途径抑制物-2基因和蛋白<130>Fudan-20050424<160>2<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>1077<212>DNA<213>斑马鱼(Danio rerio)<220>
<221>CDS<222>(76)..(777)<400>1aagtcatatc aggcgagcaa cataacatta acatatcaga cttacacgcg atctcacgac60cccaagtcca tcaca atg gcg tgt gat tta ctc gga gct ctg ttg ctt ttc111Met Ala Cys Asp Leu Leu Gly Ala Leu Leu Leu Phe1 5 10att tct gtg cta gaa agc gcc gtc gga ctg acg tta caa cct aaa gaa 159Ile Ser Val Leu Glu Ser Ala Val Gly Leu Thr Leu Gln Pro Lys Glu15 20 25gtt tgt ctg ttg caa att gaa gaa ggg acg tgt aat gac gac att cag 207Val Cys Leu Leu Gln Ile Glu Glu Gly Thr Cys Asn Asp Asp Ile Gln30 35 40cgg ttt tac tac aat aca atc agc cag cag tgt gaa gag ttc agc tac 255Arg Phe Tyr Tyr Asn Thr Ile Ser Gln Gln Cys Glu Glu Phe Ser Tyr45 50 55 60agc ggc tgt gga gga aac caa aac aac ttc agg tct ttc gtg gaa tgt 303
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权利要求
1.斑马鱼组织因子途径抑制物-2基因和蛋白，其特征是具有序列1，序列2的核酸序列和该核酸序列编码蛋白质序列。
2.按权利要求1所述的斑马鱼组织因子途径抑制物-2基因和蛋白，其特征是所述的核酸序列是cDNA序列。
3.按权利要求1所述的斑马鱼组织因子途径抑制物-2基因和蛋白，其特征是所述的核酸序列是mRNA序列。
4.一种DNA载体，其特征是含有权利要求1中所述的核酸序列，命名为rpGEMTzTFPI-2，能复制。
5.按权利要求4所述的DNA载体，其特征是所述载体是质粒pGEMT。
6.按权利要求1所述的斑马鱼组织因子途径抑制物-2基因和蛋白，其特征是所述的蛋白质由232个氨基酸组成，其含有19个半胱氨酸，其中18个半胱氨酸组成9个二硫键，形成三个串联排列的kunitz结构域。
7.按权利要求6所述的斑马鱼组织因子途径抑制物-2基因和蛋白，其中所述的蛋白质的第2个半胱氨酸残基以前的氨基酸残基数量和最后一个半胱氨酸残基以后的氨基酸残基数量可以发生任何数量上的变动。
全文摘要
本发明属于生命科学领域。涉及斑马鱼组织因子途径抑制物－2(zTFPI－2)的基因和蛋白。本发明克隆并鉴定了斑马鱼组织因子途径抑制物－2(zTFPI－2)基因，其编码的蛋白质与人TFPI－2具有很高的同源性，原位杂交证实zTFPI－2基因在斑马鱼发育的特定阶段和特定部位表达。本发明对研究TFPI－2的生理功能，TFPI－2与肿瘤侵袭转移，胚胎发育和伤口愈合的关系提供了实验基础。
文档编号C12N15/63GK1746305SQ20051002623
公开日2006年3月15日 申请日期2005年5月26日 优先权日2005年5月26日
发明者马端, 孔德升, 宋后燕 申请人:复旦大学