11；[11;低温静置301]1；[11使琼脂糖冷却凝固 ；在显微镜下切除没有样品的 琼脂糖，有样品部分切成1_3小块，2.5 %戊二醛常温保存;弃去戊二醛，PBS快速洗两次，5-IOmin/次;水洗一次，5-10min/次，吸干；1-2 %锇酸于4°C或室温，固定2h; PBS或水洗3次，5-IOmin/次；30%乙醇或丙酮，IOmin，4°C ; 50%乙醇或丙酮，IOmin，4°C ; 70%乙醇或丙酮， IOmin室温；90%乙醇或丙酮，IOmin，室温；95%乙醇或丙酮，IOmin，室温；100%乙醇或丙 酮，IOmin X 3，室温;渗透;包埋;聚合;切片制好上镜观察。如图5-A中1和2所示，透射电子显 微镜观察结果显示，MIA PaCa-2细胞对照组其超微结构无异样，线粒体及其它细胞器结构 正常，细胞膜完整;但是DIA蛋白处理后，可以明显观察到线粒体结构发生变化，绝大多数线 粒体中间产生明显的的空泡，形态发生变化，部分细胞膜出现破裂，多数细胞呈现典型的坏 死病变，如图5-A中3和4所示。说明，DIA进入MIA PaCa-2后，损伤了其超微结构，尤其是对线 粒体的影响最为广泛和明显。
[0071 ](二）：测定融合蛋白DIA对胰腺癌细胞的线粒体膜电位的影响 [0072] 将MIA PaCa-2、BxPc-3细胞分别按I X IO5/孔的密度接种与12孔细胞培养板。37°C 培养24h后，加入不同浓度的DIA、HSA和HBD2(Abeam)，孵育24-48h后，每孔中加入终浓度为 l-20μg/ml的JC-I染料（Sigma)，37°C染色10_20min，PBS洗两边细胞，胰酶消化收集细胞， PBS洗三遍后，用0.5-lmL I XI3BS重悬，并用300目细胞筛过滤细胞悬液后，Ih内上机检测。 结果如图5B所示，检测DIA对胰腺癌细胞线粒体膜电位的影响，发现随着蛋白浓度的增加， DIA可以明显降低MIA PaCa-2的膜电位，但对BxPC-3的膜电位基本没有影响。而且HBD2单 体在与DIA等摩尔最高浓度下，对线粒体膜电位的影响明显低于DIA，说明DIA具有优于亲本 分子HBD2的干扰癌细胞线粒体的作用，而且这一作用仅对有增强巨胞饮作用的MIA PaCa-2 细胞作用明显，再次证明了本发明设计的可行性。
[0073]《实施例6》DIA对鼠 H22肝癌的抑瘤作用
[0074]小鼠 H22肝癌细胞在小鼠腹腔培养扩增，取生长期的细胞计数，用生理盐水稀释成 7.5X IO6Ail细胞悬液，取200微升直接接种于昆明小鼠右侧腋窝皮下，次日开始给药。融合 蛋白DIA和HSA经尾部静脉注射给药，于第1天和第6天给药，共两次。实验共设3组，每组6只 雌性昆明小鼠，即对照组(生理盐水）、HSA组(40mg/kg)、DIA组(20mg/kg)。实验期间记录小 鼠体重，于接种肿瘤后第10天结束实验，处死动物，取瘤，称重。按下列公式计算抑瘤率，并 对各组瘤重进行统计学处理。T/C( % ) =Wt/Wc X 100%，其中Wt为治疗组的瘤重，Wc为对照 组的瘤重。抑瘤率计算公式为（1-T/C) X 100%。结果如图6A所示，所用融合蛋白DIA的剂量 为20mg/kg时，抑瘤率能达到65%，同比HSA，对瘤重无明显影响，说明本发明DIA能对肿瘤起 到抑制生长的作用。在整个实验治疗期间，监测小鼠体重（图6B)显示给药组未使小鼠体重 下降，小鼠能够耐受所给的剂量。
[0075]《实施例7》DyLight680标记的DIA在活体中靶向肿瘤组织的能力
[0076] 实验过程所使用的DyLight 680 Antibody Labeling Kit购于Thermo公司，调节 待标记蛋白浓度至2. Omg/mL，溶于I3BS，取0.5mL加入40yL 0.67M的硼酸盐缓冲液中。将准备 好的蛋白溶液加入DyLight 680试剂，轻柔的上下震荡混匀。将反应管快速离心使反应混合 物集中到管底部，于室温，避光反应60min。取两个上下套管装配在一起，混匀纯化试剂并加 至套管上部，I ,OOOXg离心Imin，弃收集管。更换一个新的收集管，套管上部加入反应后的 蛋白溶液，使之与纯化试剂混合。1，〇〇〇 X g离心Imin，将收集管中标记好的蛋白合并。于4°C 避光保存(30天）。将人胰腺癌MIA PaCa-2细胞接种至裸鼠右侧腋下。约2-3周后，当肿瘤体 积至100-500mm3,将DyLight 680标记的DIA，通过尾静脉给药荷瘤裸鼠 （η = 3)的方式，给药 剂量分别为l〇mg/kg、30mg/kg和50mg/kg。利用XENG0EN(美国Caliper公司）的小动物活体 成像仪进行观察。
[0077] 结果发现:DIA能很好地靶向MIA PaCa-2裸鼠移植瘤处，2h时可见微弱强度黄色荧 光，随时间的推移荧光强度逐渐增强，24h富集程度最强，到264h基本消失（图7)。且随着剂 量的增大，肿瘤部位荧光增强。以上结果说明了本发明DIA具有较好的肿瘤靶向性。
[0078]《实施例8》DIA对裸鼠移植瘤MIA PaCa-2的生长抑制作用
[0079]取体重为18-22g的雌性BALB/c裸鼠2-3只建立移植瘤传代模型，将人胰腺癌细胞 MIA PaCa-2接种于裸鼠腋窝皮下，每只接种I X IO7个细胞。待瘤块长至200-300mm3,采用颈 椎脱白法处死荷瘤裸鼠，无菌条件下取出皮下生长的瘤块，修剪去除包膜及坏死组织，生理 盐水中剪成约2mm 3大小的瘤块，并用套管针将瘤块分别移植到裸鼠右腋窝皮下，火棉胶粘 住切口。待瘤块长至约50-100mm3时，按照裸鼠体重和瘤体积进行分组，每组6只。按照下述 给药方案处理：〇1六（1〇11^/1^、2〇11^/1^、3〇11^/1^)、!13六（3〇11^/1^)以及阳性对照吉西他滨 (GEM)(40mg/kg)。尾静脉给药，每只200yL，对照组不作处理，吉西他滨腹腔注射。第一次给 药后的第8天，按照相同剂量给药第二次，第二次给药后的第8天给第三次药。实验期间，每3 天对裸鼠体重和肿瘤的体积进行测量，并观察裸鼠的精神状态。根据公式V = ab2/2计算肿 瘤体积(a:肿瘤长径，b:肿瘤短径），绘制肿瘤生长曲线及裸鼠体重变化曲线图。DIA抑制 MIAPaCa-2移植瘤生长的治疗效果显著，三组计量由高到低抑瘤率分别约为59%，65%和 80% (图8A)，30mg/kg DIA的抑瘤率明显优于吉西他滨40mg/kg的抑瘤率(67%)，上述各治 疗组的小鼠状态良好，未发生死亡，体重变化区间在10%以内（图8B)。由此说明，本实验室 构建的防御素-白蛋白抗肿瘤融合蛋白DIA与临床上常用于治疗胰腺癌的吉西他滨相比， DIA的抑瘤效果更好，白蛋白本身对肿瘤抑制无明显作用，说明防御素的引入发挥了很好的 弹头作用。
【主权项】
1. 一类靶向巨胞饮的防御素-白蛋白抗肿瘤融合蛋白，其特征是，所述融合蛋白系由人 防御素、连接肽、人血清白蛋白组成并具有以下结构： 防御素 HBD2-连接肽(G4S) 2-人血清白蛋白HSA，或者人血清白蛋白HSA-连接肽(G4S) 2-防御素 HBD2。2. 权利要求1所述的融合蛋白，其特征是，所述防御素不限于人即方御素 HBD2,包括所有 的人α防御素和人邱方御素家族成员，优选人邱方御素 HBD2。3. 权利要求1所述的融合蛋白，其特征是，所述的人即方御素2(HBD2)具有SEQ ID Ν0:1 所示的氨基酸序列；所述人血清白蛋白HSA具有SEQ ID Ν0:2所示的氨基酸序列；所述连接 肽(G4S)2为(GGGGS)2,具有SEQ ID Ν0:3所示的氨基酸序列。4. 权利要求1所述的融合蛋白，其特征是，所述融合蛋白具有SEQ ID NO: 1-SEQ ID:NO: 3-SEQ ID:N0:2即SEQ ID N0:4所示的氨基酸序列，或者具有SEQ ID N0:2-N0:3-N0:l所示 的氨基酸序列。5. 权利要求1所述的融合蛋白，其特征是，该融合蛋白的编码基因具有SEQ ID N0:5所 示的核苷酸序列，或相应于编码SEQ ID N02-N03-N01氨基酸序列的核苷酸序列。6. 制备权利要求1所述融合蛋白的方法，其特征是，将HBD2-(G4S)2-HSA基因序列，加入 合适的酶切位点以及利于蛋白纯化的标签序列，插入到合适的表达载体，获得重组表达载 体，电转化至感受态细胞，获得含有目的基因序列的表达菌株，其被命名为GS115-DIA，于 2015年09月16日送交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，其编号为 CGMCC No. 11388，表达菌株经培养、诱导表达，收取培养液，进行蛋白纯化，获得DIA目的蛋 白。7. 以权利要求1所述融合蛋白为活性成分与药学上可接受的载体组成的药物组合物。8. 权利要求1、7所述融合蛋白及其药物组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。9. 权利要求8所述的应用，其包含治疗或预防人胰腺癌、肺癌或肝癌中的一种或多种。
【专利摘要】本发明涉及一类防御素-白蛋白的抗肿瘤融合蛋白，其包含以下结构：防御素HBD2-连接肽(G4S)2-人血清白蛋白HSA；其中所述的人β防御素2(HBD2)具有SEQ？ID？NO:1所示的氨基酸序列，所述人血清白蛋白HSA具有SEQ？ID？NO:2所示的氨基酸序列，所述新型抗肿瘤融合蛋白，具有白蛋白巨胞饮靶向性和防御素HBD-2杀伤肿瘤细胞的功能，有望开发成为一类新型抗肿瘤药物。CGMCC No.1138820150916
【IPC分类】C12N1/19, A61P35/00, A61K47/48, A61K38/17, C07K19/00, C12N15/62, C12N15/81
【公开号】CN105504063
【申请号】CN201510674664
【发明人】杜玥, 甄永苏, 尚伯杨, 盛唯瑾, 李毅, 张胜华, 刘秀均
【申请人】中国医学科学院医药生物技术研究所
【公开日】2016年4月20日
【申请日】2015年10月19日