传至P20代维持性能稳定，主要包括细胞形态、增殖能力、MSC表面标记物表达，此方法还可维持绒毛膜间充质干细胞在体外长期培养过程； 5)本方法中所采用的试剂均为人工合成试剂，无外源物质，成分明确，并进行相关临床检测符合标准；
6)冻存复苏后细胞状态良好，能够稳定保持细胞干性和细胞活力，对细胞无伤害。
【附图说明】
[0019]图1是分离获得的原代人绒毛膜间充质干细胞和传代后人绒毛膜间充干细胞形态图；其中，A为分离获得的原代间充质干细胞;B为第I代间充质干细胞;C为第5代间充质干细胞;D为第10代间充质干细胞;E为第15代间充质干细胞;F为第20代间充质干细胞；
图2是流式检测获得的人绒毛膜间充干细胞表面抗原表达情况一维结果图:其中，A为收集细胞位置;B为获取的数据，共收集10000，其中Rl门中有9050个细胞，R2门中有9050个细胞，R3门中有8990个细胞，R4门中有8989个细胞，R5门中有8982个细胞;C为CD90阳性峰图；D为⑶lib、⑶19、⑶34、⑶45、HLA-DR阴性峰图；E为⑶105阳性峰图；F为⑶73阳性峰图。
[0020]图3是流式检测获得的人绒毛膜间充干细胞表面抗原表达情况二维结果图；其中，A为收集细胞位置;B为获取的数据，共收集10000，其中Rl门中有9027个细胞，R2门中有8933个细胞，R3门中有8461个细胞;C为CD90阳性，CDllb、CD19、CD34、CD45、HLA-DR阴性细胞团位置;D为R2细胞团中⑶105阳性、⑶73阳性细胞团位置。
[0021]图4是酶消化法获得的人绒毛膜间充质干细胞与本专利方法获得人绒毛膜间充质干细胞形态的比较图；其中，A为酶消化法获得的间充质干细胞;B为酶消化法获得的间充质干细胞进行传代后;C为本专利法获得的间充质干细胞;D为本专利法获得的间充质干细胞进行传代后。
【具体实施方式】
[0022]下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。
[0023]本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。
[0024]本发明所述的胎盘保护液为自己配制，为含有100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的1640培养基，1640培养基购自BI，货号为01-100-1ACS。
[0025]本发明所用的间充质干细胞无血清培养基购自BI，货号为05-200-1A。
[0026]本发明所用的重组细胞胰酶溶液购自BI，货号为03-079-1B。
[0027]DMSO和右旋糖酐细胞冻存混合液，购自WAK-Chemie Medical GmbH，货号为WAK-DEX40-50-5。
[0028]实施例1 人胎盘绒毛膜的剥离
操作前首先用体积浓度为75%酒精擦拭采集容器进行消毒后拿入生物安全柜，无菌环境下打开胎盘采集容器，用体积浓度为75%酒精浸泡过的纱布擦拭容器口周围的血液，避免滴落在操作台面造成污染，用14cm灭菌的镊子翻转胎盘，将靠近胎儿一侧的胎盘面朝上，换用1cm灭菌镊子轻轻剥离羊膜暴露出羊膜下层的绒毛膜层，用灭菌眼科剪沿着脐带断面剪取脐带周围的绒毛膜层，剪取过程中应尽量沿着绒毛膜剪，去除连接在绒毛膜下的绒毛和毛细血管，将获得的组织置于0.9%氯化钠注射液中清洗去除血液，用镊子剥去毛细血管，清洗结束后将绒毛膜组织依次用含有100U/ml青霉素100U/ml链霉素的0.9%氯化钠注射液和甲硝唑注射液浸泡绒毛膜组织，浸泡时间均为10分钟，浸泡过程中要用镊子晃动组织，使绒毛膜组织充分与消毒液接触，达到除菌的效果，最后再用0.9%氯化钠注射液清洗绒毛膜一次，去除残留的青霉素、链霉素和甲硝唑注射液，即达到有效防止污染又清除抗生素的残留。清洗完成后的绒毛膜组织放入无菌培养皿中，并加入间充质干细胞无血清培养基，按照每1g绒毛膜组织加入l_2ml间充质干细胞无血清培养基，然后用无菌剪刀将绒毛膜剪成Imm3大小的组织块。
[0029]实施例2
人绒毛膜间充质干细胞原代培养
取消毒、清洗、剪碎后的组织2ml于T-75细胞培养瓶中，用巴氏吸管将组织平铺于细胞培养瓶底部，应保证组织与组织之间存有空隙，给从组织中爬出的细胞一定的生长空间，将细胞培养瓶倒置于5%C02、37°C细胞培养箱中，放置30min使组织牢固的贴于细胞培养瓶底部，静止结束后取出细胞培养瓶添加间充质干细胞无血清培养基，用移液管吸取7ml培养基，沿瓶壁缓慢加入培养瓶中无组织粘附的部位，盖好盖子后翻转细胞培养瓶并轻轻晃动，使培养基均匀的铺于组织之间，将细胞培养瓶置于5%C02、37°C细胞培养箱静止培养，5天后更换新的间充质干细胞无血清培养基，培养7天后与显微镜下观察，可见组织周围开始有细胞长出，之后每2-3天观察一次细胞生长情况，如图1中的A图和图4中的C图均为分离获得的原代间充质干细胞。当细胞汇合度达60%时可进行细胞传代。
[0030]实施例3
人绒毛膜间充质干细胞传代
将T-75培养瓶中的培养基完全移出，加入15mlPBS清洗细胞一次(采用PBS清洗细胞不为必须操作，可根据实际情况来定)，移除PBS，加入重组细胞胰酶溶液3ml，放入37 °C培养箱消化约2分钟，在此过程中需在倒置显微镜下观察到贴壁细胞收缩情况，待细胞全部脱离瓶底后，用手掌拍打培养瓶侧壁，显微镜观察细胞是否已消化为单个细胞，加入15ml的间充质干细胞无血清培养基稀释重组细胞胰酶溶液终止胰酶作用，然后将细胞悬液转移至50ml离心管中，取200ul细胞悬液用苔盼蓝染色计活细胞数。然后将离心管离心，1200rpm/min，离心3min，弃上清，加入1ml间充质干细胞无血清培养基，用巴氏管轻轻吹悬沉淀在离心管底部的细胞，再根据4000-6000个细胞数/cm2接种到新的细胞培养瓶中，并做好标记，培养瓶中补加间充质干细胞无血清培养基至15ml，于37 °C、饱和湿度、5%的CO2培养箱中培养，一般
2-3天细胞汇合度可达90%，此时可进行再次传代，若细胞生长缓慢应每3天更换一次培养基。通过全量换液可去除未贴壁细胞和细胞碎片，细胞汇合度达80%时可进行再次传代，通过以上步骤可完成间充质干细胞的传代培养，根据需要重复上述操作进行P2、P3、P4……传代，如图1-B、C、D、E、F分别为传至第I代、第5代、第10代、第15代、第20代的间充质干细胞，随着传代次数的增加细胞形态会有所改变，特别是从第10代开始，细胞生长速度开始减慢，细胞开始变得细长，成衰老的发展趋势，如图1所示。
[0031 ] 实施例4
人绒毛膜间充质干细胞冻存 T-75细胞瓶中的细胞汇合度达90%时可进行间充质干细胞的冻存，首先配制含有体积分数为20%冻存保护剂的间充质干细胞无血清培养基，用移液枪吸取间充质干细胞无血清培养基4ml，加入500ul的二甲基亚砜(DMSO)和500ul的右旋糖酐，充分混匀备用；移除T-75细胞培养瓶中的培养基，加入15ml的PBS清洗细胞一次(采用PBS清洗细胞不为必须操作，可根据实际情况来定)，移除PBS溶液，加入3ml重组细胞胰酶溶液，左右晃动细胞培养瓶，是胰酶溶液均匀的平铺于培养瓶底部，将细胞培养瓶置于37°C培养箱静置2min，显微镜下观察细胞细胞收缩情况，若所有细胞开始收缩并脱离平底，用手轻轻拍打培养瓶侧壁，使细胞成为单个细胞悬液，此时加入加入15ml的间充质干细胞无血清培养基稀释重组细胞胰酶溶液终止胰酶作用，并用移液器轻轻吹打细胞悬液3-4次，将细胞悬液移至50ml离心管，1200rpm，离心5分钟，去除上清液，加入事先配制好的含有体积分数为20%冻存保护剂的间充质干细胞无血清培养基5ml重悬细胞，移液器反复吹打3次，将细胞吹散充分接触冻存保护剂，取1.6ml细胞悬液移至2ml冻存管中，共分为3只，拧紧冻存管的盖子，防止低温环境下冻存管盖子变松，导致细胞污染，将冻存管置于含有异丙醇的冻存盒中，迅速将冻存盒置于-80°C冰箱过夜，第二天取出冻存盒将细胞冻存管移至_196°C液氮罐中保存。
[0032]实施例5
人绒毛膜间充质干细胞的复苏
取一个保温饭盒装入适量37°C温水，用镊子从液氮罐中取出之前冻存的细胞冻存管，迅速置于37°C温水中并不断晃动细胞冻存管，使冻存管中的液体迅速融化，待液体完全融化后1200rpm，离心5min，去除上清液，用移液枪加入Iml间充质干细胞无血清培养基并吹打
3-4次，吸出溶液移至T-25细胞培养瓶中，补充3ml间充质干细胞无血清培养基，混匀后置于5%C02、37°C细胞培养箱培养，第二天显微镜下观察细胞贴壁情况，并更换新的培养基继续培养，根据细胞生长密度进行传代。
[0033]将得到的间充质干细胞进行流式细胞检测(图2和图3)，方法如下:
实验原理:利用流式细胞技术检测间充质干细胞特异性表面抗体表达情况。根据抗原抗体结合原理，选用BD公司人类间充质干细胞检测试剂盒，用特定荧光素标记的抗体对已知携有相应抗原的细胞进行染色。经荧光素标记抗体染色的细胞可以被流式细胞仪识别，并根据已知细胞所携带的荧光素的强度，对标记