抗体进行定性，定量分析。检测试剂盒配备了国际通用的 MSC 的五阴(CDllb、CD19、CD34、CD45、HLA-DR)三阳(CD73、CD90、CD105)检测抗体和对应的对照抗体。
[0034]检测步骤:
(I)取7根流式管，分别为
①空白对照
②FITC-⑶90单染管
③PE单染管
④PerCP-CD105单染管
⑤APC-CD73单染管
⑥Positiveantibody isotype(阳性混合抗体的对照抗体)+ Negative antibody
is o ty p e (阴性混合抗体的对照抗体)
⑦Positiveantibody cocktail(阳性混合抗体)(CD73、CD90、CD105)+ Negativeantibody cocktail(阴性混合抗体)(CDllb、CD19、CD34、CD45、HLA_DR)
(2)各流式管分别加入相同量的传代细胞(有核细胞数2-5X 15个)，不可粘到管壁。
[0035](3)各流式管加入对应抗体
①不加任何抗体
②加入CD90-FITC5ul
③加入PE-Negativecocktail 5μ1
④加入CD105-PerCP 5ul
⑤加入CD73-APC5ul
⑥加入阳性混合抗体的对照抗体(Positiveantibody isotype)和阴性混合抗体的对照抗体(Negative antibody isotype)
⑦加入阳性混合抗体(Positiveantibody cocktail)和阴性混合抗体(Negativeantibody cocktail)
(4)涡旋振荡器混匀各检测管后，室温避光放置30min，加入ImL PBS/管，涡旋混匀后，1200rpm/min，离心5min。
[0036](5)弃上清，重复洗涤3次，最后加入0.5mL PBS重悬细胞，上机检测(若不能及时上机，应加入2%多聚甲醛溶液固定剂)。
[0037](6)上机分析结果得:共收集10000个细胞，其中CD90阳性细胞占100%，CDl Ib、CD19、CD34、CD45、HLA-DR阴性细胞占99.3%，CD105阳性细胞占99.3%，CD73阳性细胞占99.2%，所以 CD7 3、CD90、CD 105表达率在99% 以上，为阳性;CD 11 b、CD 19、CD34、CD45、HLA-DR表达率小于1%，为阴性；另外⑶llb、CD19、⑶34、⑶45、HLA-DR阴性细胞中⑶73、⑶90、⑶105共阳性细胞占93.7%。
[0038]上述说明:按照实施例中的方法分离培养得到的人绒毛膜间充质干细胞，满足CD73、CD90、CD105 大于95%，为阳性；0)1113、0)19、0034、0)45、!11^-01?小于2%，为阴性的结果，经鉴定为间充质干细胞。
[0039]酶消化法和本方法获得的绒毛膜间充干细胞形态的比较(图4)，方法及结果如下:酶消化法中绒毛膜的剥离与本发明专利申请方法一致，剥离获得组织用剪刀剪成5mm3
大小后，加入终浓度为2mg/ml的I型胶原酶37 V消化60min，加入等体积培养基中和胶原酶作用，用10um滤网过滤去除较大的组织块，滤液离心去除上清，用培养基重悬沉淀获得单细胞悬液，加入培养瓶中于37°C培养箱培养，48h即可观察到贴壁生长的细胞。
[0040]结果说明:酶消化法获得的人绒毛膜间充质干细胞生长分散(图4-A)，形态不一致，细胞在生长过程中会产生杂质影响细胞生长状态，传代后细胞拉丝，互相交织在一起(图4-B)，本发明专利所用的方法分离获得的人绒毛膜间充质干细胞(图4-C)形态均一，呈涡旋状生长，符合间充质干细胞生长特性，传代后(图4-D)也能较好保持这些特性。
[0041]以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
【主权项】
1.一种人绒毛膜间充质干细胞的分离培养方法，其特征在于，包括以下步骤: 步骤(I)，人胎盘组织的采集:人胎盘组织娩出后，用生理盐水对胎盘组织进行清洗以除去胎盘组织周围的血液和胎粪，然后将胎盘组织浸在胎盘保护液中，暂存于2-8°C环境中； 所述的胎盘保护液为含100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的1640培养基； 步骤(2)，绒毛膜组织的剥离:在无菌环境下，将步骤(I)得到的浸在胎盘保护液中的胎盘组织的靠近胎儿一侧的胎盘面朝上，然后剥离羊膜并暴露出羊膜下层的绒毛膜层，接着剪取脐带周围的绒毛膜层，并将剪取得到的绒毛膜组织置于0.9%氯化钠注射液中； 步骤(3)，绒毛膜组织的洗涤与消毒:先用0.9%氯化钠注射液漂洗步骤(2)得到的绒毛膜组织以去除血液，并用镊子剥去毛细血管，再用含有100U/ml青霉素和100U/ml链霉素的0.9%氯化钠注射液浸泡绒毛膜组织，接着用甲硝唑注射液浸泡绒毛膜组织，浸泡时间均为5-10分钟，最后再用0.9%氯化钠注射液清洗绒毛膜以去除残留的青霉素、链霉素和甲硝唑注射液； 步骤(4)，绒毛膜组织的剪碎:将经步骤(3)清洗得到的绒毛膜组织放入无菌容器内，并加入间充质干细胞无血清培养基，按照每1g绒毛膜组织加入l_2ml间充质干细胞无血清培养基，然后用无菌剪刀将绒毛膜剪成Imm3大小的组织块； 步骤(5)，人绒毛膜间充质干细胞原代培养:将步骤(4)得到的绒毛膜组织块均匀的平铺于细胞培养瓶中，然后置于细胞培养箱内静置30-60min，之后向细胞培养瓶中添加间充质干细胞无血清培养基，使培养基刚好没过绒毛膜组织块，接着于5%C02、37 °C的细胞培养箱中静止培养，6-8天后，可见组织块周围有细胞长出，即人绒毛膜间充质干细胞； 步骤(6)，人绒毛膜间充质干细胞传代培养:待长出细胞汇合率达50-60%时对人绒毛膜间充质干细胞进行传代培养，弃培养基，加入重组细胞胰酶溶液消化细胞，待细胞消化完全后，加入是本步骤所用重组细胞胰酶溶液体积5倍的间充质干细胞无血清培养基，以终止重组细胞胰酶作用，然后离心去除上清液，之后加入间充质干细胞无血清培养基重悬细胞，并移至新的培养瓶中置于5%C02、37 °C的细胞培养箱中培养； 步骤(7)，人绒毛膜间充质干细胞的冻存:当步骤(6)培养的细胞汇合率达90%后进行细胞冻存，先用重组细胞胰酶溶液将细胞消化成单个细胞后，再加入是本步骤所用重组细胞胰酶溶液体积5倍的间充质干细胞无血清培养基终止重组细胞胰酶溶液作用，离心去除上清液，用含有体积分数为20%冻存保护剂的间充质干细胞无血清培养基重悬细胞，重悬混匀后，将重悬溶液置于冻存管中； 步骤(8)，冻存细胞缓慢降温:将步骤(7)得到的冻存管置于含有异丙醇的冻存盒中，-80 0C冰箱过夜放置，第二天转入-196 °C液氮罐中长期储存； 步骤(9)，冻存细胞的复苏:从步骤(8)的液氮罐中取出冻存管后，置于37°C水浴锅中迅速融化，1200-1800rpm离心5min，去除含有冻存保护剂的间充质干细胞无血清培养基，加间充质干细胞无血清培养基重悬细胞并将重悬溶液移至细胞培养瓶中，于5%C02、37°C细胞培养箱静置培养，第二天显微镜下观察细胞贴壁情况，若细胞已经贴壁说明细胞复苏成功，然后更换新的间充质干细胞无血清培养基，于5%C02、37 °C细胞培养箱继续培养。2.根据权利要求1所述的人绒毛膜间充质干细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤(I)所述的暂存于2_8°C环境中的时间不能超过24h。3.根据权利要求1所述的人绒毛膜间充质干细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤(7)所述的冻存保护剂为DMSO和右旋糖酐细胞冻存混合液。4.根据权利要求1所述的人绒毛膜间充质干细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤(7)所述的将重悬溶液置于冻存管中时，采用规格为2ml的冻存管，每个冻存管中加入重悬溶液1.5-1.8ml 05.根据权利要求1所述的人绒毛膜间充质干细胞的分离培养方法，其特征在于，步骤(6 )和步骤(7 )中用重组细胞胰酶溶液消化细胞前，先用PBS清洗细胞以除去培养基。
【专利摘要】本发明涉及一种人绒毛膜间充质干细胞的分离培养方法，属于生物医药技术领域。本发明经过人胎盘绒毛膜组织的采集、绒毛膜组织剥离，消毒、洗涤、剪碎、原代分离获得间充质干细胞及间充质干细胞的体外培养和冻存，并对分离获得的细胞进行相关检测。本发明能够从人胎盘绒毛膜组织中分离获得大量表型均一稳定的间充质干细胞，经检测符合临床应用标准。通过培养体外扩增获得满足冻存或临床使用的细胞数量。
【IPC分类】C12N5/0775
【公开号】CN105713871
【申请号】CN201610166682
【发明人】闫姗姗, 李一佳, 甘明川, 莫春红
【申请人】云南舜喜再生医学工程有限公司
【公开日】2016年6月29日
【申请日】2016年3月22日