200mMa -丽 戊二酸，61111心抗坏血酸，2001111脯氨酸及1%齡1(161?-40)，351：200巧111催化2011，反 式-4-居基-k脯氨酸的产量如下表，结果显示能够表达k脯氨酸-4-居基化酶的大肠杆 菌化21 (pSWl)菌株能够W k脯氨酸为前体全细胞催化生产反式-4-居基-k脯氨酸。
[0096]
[0097]
[0098] 本实施例通过离线催化证明，包含本发明基因的宿主细胞具有产生催化生产反 式-4-居基-k脯氨酸的活性。
[0099] 实施例4. W k脯氨酸为前体发酵生产反式-4-居基-k脯氨酸
[0100] 发酵培养基为；葡萄糖lOg/L ;膜蛋白腺8g/L ;硫酸倭5g/L ;磯酸氨二钟Ig/L ;氯 化钢2g/L ;硫酸镇0. 5g/L ;硫酸亚铁0. 278g/L ;氯化巧0. 015g/L ;脯氨酸lOg/L，a -丽戊 二酸 5g/L，mops 40/L，P册.5。E. COli化21 (pET21a)和 E. COli化21 (pSWl)采用 LB 培养基 过夜培养种子，1%接种发酵培养基，加 50ug/ml的氨予青霉素，37°C 22化pm培养2-3h，OD 长至0. 6-0. 8,加入0. 5mM IPTG，28°C 22化pm发酵26h，反式-4-居基-k脯氨酸的产量如 下表，结果显示能够表达k脯氨酸-4-居基化酶的大肠杆菌化21 (pSWl)菌株能够W k脯 氨酸为前体直接发酵生产反式-4-居基-k脯氨酸。
[0101]
[0102] 本实施例证明，包含本发明基因的宿主细胞具有催化生产反式-4-居基-k脯氨 酸的生产意义。
[0103] 实施例5. W葡萄糖为原料从头发酵生产反式-4-居基-k脯氨酸
[0104] 根据文献（Gene. 1988Apr 29 ;64 (2):199-205. Nucleotide sequence of a mutation in the proB gene of Escherichia coli that confers proline overproduction and enhanced tolerance to osmotic stress)报道，大月気杆菌的 proB (NCBI-GI: 16128228)基因107位Asp突变为Asn，即proB74突变体可W解除k脯氨酸 对proB 基因的反馈抑制。根据文献（Shibasaki T,化 shimoto S,Mori H 等，Construction of 曰 novel hydroxyproline-producing recombinant Escherichi曰 coli by introducing a proline 4-hyd;roxylase gene. [J]. J Biosci Bioeng. 2000, 905:522-525)报道，在 大肠杆菌中过表达proB74谷氨酸激酶（Glutamate-5-kinase)和proA谷氨酸半醒脱 氨酶（Glutamate-semialdehyde dehy化Ogenase) (NCBI-GI :16128229)基因可 W 生产 k脯氨酸。因此发明人首先在PUC19质粒（购自宝生物工程（大连）有限公司）基 础上构建了 pr〇B74(谷氨酸激酶（Glutamate-5-kinase))和proA(谷氨酸半醒脱氨酶 (Glutamate-semialdehyde dehy化Ogenase))过表达质粒 pSW2 ;在 pSW2 的基础上进一步 构建过表达本发明的k脯氨酸-4-居基化酶的pSW3质粒，pSW3质粒质粒表达的蛋白不 带有任何标签，质粒构建过程如图2所示。pSW2和pSW3质粒分别导入E. COliD册a获得 ￡.。〇110册(1(95胖2)和￡.。〇110册(1(95胖3)。
[0105] 发酵培养基；葡萄糖lOg/L ;鱼粉蛋白腺8g/L ;硫酸倭5g/L ;磯酸氨二钟Ig/L ;氯 化钢2g/L ;硫酸镇0. 5g/L ;硫酸亚铁0. 278g/L ;氯化巧0. 015g/L ;M0PS 40g/L。发酵条件： 5%接种量，331：，220巧111，3311。
[0106] 其中k脯氨酸的检测方法为；收集菌液，10000巧m离必5min收集上清液，用3% (W/V)礙基水杨酸稀释到合适浓度；取ImL稀释液，加入ImL酸合巧H丽（1. 25g巧H丽溶 于30血冰醋酸和20血6M册P04中，揽拌加热（70°C )溶解，胆于冰箱中）和1血冰醋酸， 100°C沸水浴反应45min ;冷却后，加入2mL甲苯，剧烈振荡Imin,静置，吸取上层脯氨酸甲苯 溶液在520nm测量OD值。采用O-lOOmg/L浓度的k脯氨酸绘制标准曲线，根据标准曲线 计算待测样品的浓度。
[0107] E. COliD册a (pSW2)和E. COliD册a (pSW3)菌株发酵结果如下表所示：
[010 引
[0109] 从上表所示的结果可W看出，E. COliD册a (pSW2)只能产生k脯氨酸，而进一 步过表达本发明的k脯氨酸-4-居基化酶的E. COliD册a (pSW3)能够产生反式-4-居 基-k脯氨酸，从而说明本发明的k脯氨酸-4-居基化酶可W应用于W葡萄糖等糖类原料 直接发酵生产反式-4-居基-k脯氨酸。
[0110] 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独 引用作为参考郝样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可 W对本发明作各种改动或修改，送些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范 围。
【主权项】
1. 一种用于催化L-脯氨酸产生反式-4-羟基-L-脯氨酸的L-脯氨酸-4-羟基化酶， 所述L-脯氨酸-4-羟基化酶为以下蛋白 ： (a) 氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示的蛋白；或 (b) 由SEQ ID NO: 1所示氨基酸序列经过一个或数个氨基酸残基的取代、缺失或添加而 形成的且具有（a)所述蛋白的功能的衍生蛋白。2. 如权利要求1所述的L-脯氨酸-4-羟基化酶，其特征在于， (b)所述的衍生蛋白是由SEQ ID NO: 1所示氨基酸序列经过1-50个，更优选1-30个， 还要优选1-10个，最优选1-6个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的且具有（a)所述 蛋白的功能的衍生蛋白。3. 如权利要求2所述的L-脯氨酸-4-羟基化酶，其特征在于， (b)所述的衍生蛋白是由SEQ ID NO: 1所示氨基酸序列经过1-50个，更优选1-30个， 还要优选1-10个，最优选1-6个氨基酸残基的缺失或添加而形成的且具有（a)所述蛋白的 功能的衍生蛋白。4. 如权利要求2所述的L-脯氨酸-4-羟基化酶，其特征在于，（b)所述的衍生蛋白是 在SEQ ID NO: 1所示氨基酸序列的C末端和/或N末端添加或缺失1-50个，更优选1-30 个，还要优选1-10个，最优选1-6个氨基酸残基而形成的且具有（a)所述蛋白的功能的衍 生蛋白。5. -种用于催化L-脯氨酸产生反式-4-羟基-L-脯氨酸的L-脯氨酸-4-羟基化酶， 所述L-脯氨酸-4-羟基化酶为氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示的蛋白。6. -种表达载体，所述表达载体包含编码权利要求1-5中任一项所述蛋白的核苷酸序 列。7. 如权利要求6所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体包含SEQ ID N0:2所示核 苷酸序列。8. -种宿主细胞，所述宿主细胞包含权利要求6或7所述的表达载体，或基因组上整合 有编码权利要求1-5中任一项所述蛋白的核苷酸序列，或基因组上整合有SEQ ID NO:2所 示核苷酸序列。9. 如权利要求8所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞是谷氨酸棒杆 菌（Corynebacterium glutamicum)、大肠杆菌（E.coli)、黄色短杆菌（Brevibac terium flavum)、粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens)、酿酒酵母（Saccharomyce s cerevisiae)、枯草芽抱杆菌（Bacillus subtilis)。10. 如权利要求9所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞是大肠杆菌（E. coli)。11. 如权利要求8-10中任一项所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞中的谷氨 酸激酶（Glutamate-5-kinase)不受L-脯氨酸反馈抑制或L-脯氨酸反馈抑制减弱。12. 如权利要求11中所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞中谷氨酸 激酶（Glutamate-5-kinase)和 / 或谷氨酸半酸脱氢酶（Glutamate-semialdehyde dehydrogenase)的活性增强。13. 权利要求1-5中任一项所述的蛋白或权利要求6或7所述的表达载体或权利要 求8-12中任一项所述宿主细胞的用途，其特征在于，用于催化L-脯氨酸产生反式-4-羟 基-L-脯氨酸及其衍生物。14. 一种生产反式-4-羟基-L-脯氨酸及其衍生物的方法，其特征在于，所述方法包括 以下步骤： 1) 利用权利要求8-12中任一项所述的宿主细胞或权利要求1-5中任一项所述的蛋白 进行发酵或转化，从而产生反式-4-羟基-L-脯氨酸及其衍生物；和 2) 从1)的体系中获得反式-4-羟基-L-脯氨酸及其衍生物。
【专利摘要】本发明公开了一种L-脯氨酸-4-羟基化酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，编码序列如SEQ ID NO:2所示。本发明的L-脯氨酸-4-羟基化酶能够在宿主细胞中高效表达且具有高催化活性，从而提高从葡萄糖生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的水平。本发明还提供了包含所述L-脯氨酸-4-羟基化酶的编码序列的表达载体、包含所述表达载体的宿主细胞以及它们在产生反式-4-羟基-L-脯氨酸中的用途和生产方法。
【IPC分类】C12P13/24, C12R1/19, C12N15/63, C12R1/865, C12R1/43, C12N9/02, C12R1/15, C12R1/125, C12R1/13, C12N1/21
【公开号】CN105713883
【申请号】CN201410740022
【发明人】孙际宾, 郑平, 刘娇, 王兴初, 彭久合, 马延和
【申请人】中国科学院天津工业生物技术研究所, 天津市敬业精细化工有限公司
【公开日】2016年6月29日
【申请日】2014年12月5日