专利名称：一种鉴别毛白杨2n配子植株的方法
技术领域：
本发明涉及一种鉴别2n配子植株的方法，尤其涉及一种利用分子标记来鉴别毛白杨2n雌雄配子植株的方法，属于植物遗传育种领域。
背景技术：
在林木多倍体育种中，三倍体具有很高的利用价值，尤其是在纸浆用材等纤维材新品种选育中，多倍体细胞的巨大性不仅带来三倍体的生长提速，同时由于三倍体纤维细胞增长变大，单位材积的纤维细胞数以及细胞表面积相应减小，导致细胞壁木质素等含量降低，而纤维素含量则相对提高，可保证整个产业链的综合效益最大化，具有重要的开发利用潜力(康向阳.毛白杨细胞遗传与三倍体选育，北京中国环境科学出版社，2002；康向阳.林木多倍体育种研究进展.北京林业大学学报，2003，25(4)70-74)。
三倍体诱导途径包括利用四倍体与二倍体杂交、利用天然或人工未减数二倍性(2n)花粉杂交、胚乳培养、体配细胞融合等(康向阳.毛白杨细胞遗传与三倍体选育，北京中国环境科学出版社，2002；康向阳.林木多倍体育种研究进展.北京林业大学学报，2003，25(4)70-74)，其中利用天然2n配子是获得三倍体的一条最为经济、快捷的途径(康向阳.毛白杨2n花粉发生机制的研究.北京林业大学学报，2002，24(5/6)67-70；康向阳，朱之悌，林惠斌.1999.杨树花粉染色体加倍有效处理时期的研究.林业科学，35(4)21～24；康向阳，朱之悌.白杨2n花粉生命力测定方法及萌发特征的研究，云南植物研究，1997，(4)395-401；康向阳，朱之悌，林惠斌.白杨不同倍性花粉的辐射敏感性及其应用.遗传学报，2000，27(1)78-82)。
在被子植物中，未减数2n配子(Unreduced gametes)发生极为普遍，但大多是通过2n花粉与正常花粉的形态差异观察而发现的。由于2n雌配子难以象2n大花粉那样能够通过形态观察检出，因此有关植物中发生未减数2n雌配子的报道，往往是根据对后代倍性分析得出的推论(Mok W S，Peloquin S J.Three mechanismsof 2n pollen formation in diploid potatoes.Can.J.Genet Cytol.，1975，17217-225；Ramanna M S.A reexamination of the mechanisms of 2n gametes formation in potatoand its implications for breeding.Euphytica，1979，28537-561；Veilleux R E.2ngametes in diploid Solanum tuberosum frequency and types of spindle abnormalities.Can J Genet Cytol，1982，24301-314)。
有关研究表明，环境因素对2n配子的出现频率有一定影响，而起决定作用的是遗传因素。Satina等(1935)最早研究指出，曼佗罗(Datura)的2n配子发生是受一个隐性基因控制的(Jacobsen E.Increase of diplandroid formation and seedset in 4x×2x crosses in potatoes by genetical manipulation of dihaploids and sometheoretical consequences.Z.Pflanzenzucht，1980，85110-121)。此后众多的植物遗传学研究形成普遍性认识，即2n配子的产生主要由单个隐性基因控制的，产生2n配子的性状可以高度遗传。但也有研究表明2n配子发生受控于一个主基因和数个微效基因(王倩，王斌.DNA分子标记在果树遗传学研究上的应用.遗传，2000，22(5)339-344；张博，黄敏仁，诸葛强，等.美洲黑杨抗黑斑病基因的RAPD标记筛选和连锁分.遗传，2002，24(5)543-547；李仕贵，马玉清，王文明，等.一个新的水稻迟熟性基因的遗传分析和分子标记定位.遗传学报，2000，27(2)133-138)。
由于2n雌配子不存在单倍性配子竞争问题，受精后这些2n雌配子可100％形成三倍体，因此，即使其发生的比率较低，仍具有非常高的研究与利用价值，然而难处在于如何采取一定的技术方法检出这些天然2n雌配子植株。
在遗传学研究中，通常将可识别的等位基因称为遗传标记。分子标记是以DNA分子多态性为基础的遗传标记，实质就是特定的DNA序列(王明庥主编.林木遗传育种学.北京中国林业出版社，2001)，分子标记的方法主要有RFLP(Restriction Fragment Length Polymorpnism)、RAPD(Random AmplifiedPolymorpnism DNA)、AFLP(Amplified Fragments Length Polymorpnism)等。分子标记具有信息量大、扫描遗传位点多、不受生物组内基因互作、外部环境、人为操作以及基因表达与否等因素影响等特点，正成为植物遗传学研究和育种的有效工具。
扩增片段多态性(Amplification fragment length polymorphism，AFLP)是由Vos于1995年所提出，其作用原理为首先将基因组DNA以两种限制性内切酶切开，之后再以带有前述所使用的限制性内切酶专一序列的两个双股转接子(adaptor)分别黏于被切出之DNA片段的两端，以产生模板DNA再进行后续的PCR扩增。扩增程序分两段进行，第一个扩增程序称为前扩增，系以带有一个选择性核甘酸延伸序列的引物行扩增反应；第二个扩增程序称为选择性扩增，系以带有较长选择性核甘酸延伸序列的引物行扩增反应。最后利用聚丙烯酰胺胶体电泳进行PCR产物分离，再用银染方式分析结果。AFLP分子标记方法具有重现性好、安全快捷、简便经济等优点，可广泛应用于基因鉴定、基因作图，表达等方面。
天然毛白杨2n配子植株与非2n配子植株间存在DNA多态性差异，采用AFLP分子标记方法，可以快速、准确的将二者区分开来，但其前提是需要筛选得到特异的可用作标记的引物序列。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种鉴别毛白杨2n雌雄配子植株的方法。
本发明所要解决的技术问题是通过以下技术途径来实现的一种鉴别毛白杨2n雌或雄配子植株的方法，包括以下步骤以SEQ ID NO1和SEQ ID NO2所示的核苷酸序列(简称为E50-M38)作为分子标记的引物组合，采用常规的扩增片段多态性(Amplification fragment lengthpolymorphism，AFLP)分子标记方法对需鉴定的毛白杨无性系植株进行分子标记，如果从待鉴别的毛白杨植株中没有扩增出1条大小为246bp的多态性条带，则该毛白杨植株是2n雌或雄配子植株；或以SEQ ID NO3和SEQ ID NO4所示的核苷酸序列(简称为E31-M50)作为分子标记的引物组合，采用常规的AFLP标记方法对需鉴别毛白杨植株进行分子标记，如果从待鉴别的毛白杨植株中扩增出1条大小为204bp的多态性条带，则该待鉴别毛白杨植株是2n雌或雄配子植株。
本发明以毛白杨雄株为参照系，根据未减数2n花粉比正常减数花粉形态巨大的特性，采用花粉粒镜检技术对毛白杨2n花粉发生情况进行观察，选择典型雄性无性系，分成2n花粉植株与不产生2n花粉正常植株两个集群，分别等量混合提取DNA，构建一对2n花粉型与正常型近等基因池；利用AFLP等DNA分子标记技术，对构建好的毛白杨2n花粉型与正常型近等基因池进行分析，筛选、确定得到与2n花粉发生相关的分子标记的引物序列组合(SEQ ID NO1和SEQID NO2；SEQ ID NO3和SEQ ID NO4)。本发明用上述所筛选的特定引物组合，采用常规扩增片段多态性分子标记方法对需要鉴别的植株进行分子标记，根据标记结果中特定多态性条带的有或无，可以准确、快速地鉴别出毛白杨2n雌雄配子植株以及实现子代2n配子植株早期鉴定，对于毛白杨三倍体的育种具有重要的意义。同时，本发明方法对其它相似植物2n雌配子植株的选择也有借鉴价值。
图1为引物组合E50-M38在毛白杨无性系中的多态性。
图2为引物组合E31-M50在毛白杨无性系中的多态性。
图1，图2中左边第1泳道为DNA Marker；第2、3泳道分别为产生2n花粉与不产生2n花粉的混合，第4至第22泳道为产生2n花粉的20个毛白杨无性系，第23至第29泳道为不产生2n花粉的6个毛白杨无性系，箭头所指为扩增出的多态性条带。
具体实施例方式
以下通过实施例来进一步描述本发明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的范围。
说明以下实施例中未作具体说明的分子生物学实验方法，均参照《分子克隆试验手册》(Sambrook等编著，科学出版社，1992年版)一书中所列的具体方法进行，或者按照试剂盒和产品说明书进行。
一、试验材料1)毛白杨2n雄配子植株158株；2)毛白杨单倍性雄配子植株140株。产地包括北京、河北、河南、山西、陕西和甘肃。
二、试验方法1、分别提取毛白杨2n雄配子植株和单倍性雄配子植株的基因组DNA，提取方法如下1>液氮研磨约2g叶片，转移到2ml的离心管中，加入1000ul经65℃预热的SDS提取缓冲液和终浓度为2％的β-巯基乙醇，65℃水浴30分钟。
2>加入等体积的酚，轻摇15分钟，静置5分钟，1200rpm离心10分钟。
3>抽取上清，加入等体积的氯仿-异戊醇(24∶1)，摇匀静置5分钟后1200rpm离心10分钟。
4>抽取上清，加入2倍体积的异丙醇，轻摇至沉淀产生，静置片刻后1000rpm离心5分钟。
5>弃去异丙醇，加入600ul含有50ng/mlRNA酶的TE缓冲液，轻摇止沉淀溶解，37℃水浴30分钟。
6>加入等体积的酚，充分混匀，静置片刻后1200rpm离心10分钟。
7>抽取上清，加入等体积氯仿，充分混匀，静置片刻后1200rpm离心10分钟。
8>抽取上清，加入1/10体积NaAc和2倍体积的无水乙醇，-20℃沉淀30分钟，-4℃，1200rpm离心10分钟。
9>弃去上清，70％酒精洗涤3次，风干后用适量TE缓冲液溶解，取适量在0.8％琼脂糖凝胶电泳检测。
2、分别对所提取的毛白杨2n雄配子植株和单倍性雄配子植株基因组DNA进行酶切，分别将酶切片段与接头连接，具体方法如下1>反应体系DDH2O 13.05ulT4ligase缓冲液(10×) 2.0ulEcoR I adaper(50pmol/ul) 1.0ulMse I adaper(5pmol/ul) 1.0ulEcoR I 20U/ul) 0.15ulMse I 10U/ul)0.3ulT4ligase酶(10U/ul) 0.5ul所提取的DNA(200ng/ul)2.0ul反应总体积 20ul2>反应条件37℃恒温酶切连接4小时。
3、分别进行预扩增(酶切连接液稀释6倍)1>反应体系DDH2O 12.1ul
PCR缓冲液(10×)2.0uldNTP(25mM/ul) 1.5ul引物1(SEQ ID NO1，50ng/ul) 1.0ul引物2(SEQ ID NO2，50ng/ul) 1.0ulTaq DNA聚合酶(5U/ul) 0.4ul酶切连接液稀释液 2.0ul总体积 20ul2>PCR条件程序194℃3min程序294℃30s56℃30s72℃1min程序2共30个循环；程序372℃5min程序44℃。
4、分别进行选择性扩增(预扩增产物稀释20倍)1>反应体系DDH2O 10.1ulPCR缓冲液(10×) 2.0uldNTP(25mM/ul)1.5ul引物1(SEQ ID NO1，50ng/ul) 1.0ul引物2(SEQ ID NO2，50ng/ul) 1.0ulTaq DNA聚合酶(5U/ul) 0.4ul预扩增稀释液 4.0ul总体积 20ul2>PCR条件程序194℃3min程序294℃30s65℃30s(-0.7℃/循环)72℃1min
13个循环(Touchdown-PCR)。
程序394℃30s56℃30s72℃1min25个循环；程序475℃5min程序54℃。
5、聚丙烯凝胶电泳选择性扩增产物加入5ul上样缓冲液(loading buffer)混合后，95℃变性5分钟后，立刻转移到冰浴中冷却，取6ul上样到6％的聚丙烯凝胶电泳，90W恒功率电泳90分钟。
6、银染1>固定，塑料盒中倒入1.5L新配制的10％冰醋酸，轻摇至凝胶脱色后用蒸馏水漂洗10分钟。
2>染色，将玻璃板从塑料盒中拿出，放入1gAgNO3/H2O并加入1.5ml甲醛的硝酸银水溶液。
3>水洗，用DDH2O洗胶板不超过5秒。
4>显影，胶板移至2L预冷的显影液中，轻摇至带纹出现。
5>定影，带纹出现后放入固定液，固定5分钟。
6>冲洗，用DDH2O洗胶板5分钟。
7>胶的干燥，室温下自然干燥后照相。
三、试验结果所有的毛白杨2n雄配子植株中均没有扩增出1条大小为246bp的多态性条带，与之相反，所有的毛白杨单倍性雄配子植株中均扩增出1条大小为246bp的多态性条带(SEQ ID NO5)(图1)。
一、试验材料和方法试验材料和方法均与试验例1相同，唯一不同的是进行分子标记时的引物组合的序列为SEQ ID NO3和SEQ ID NO4。
二、试验结果从所有的毛白杨2n雄配子植株中扩增出1条大小为204bp的多态性条带(SEQID NO6)，与之相反，所有的毛白杨单倍性雄配子植株中均未扩增出1条大小为204bp的多态性条带(图2)。
试验结果表明，本发明方法能够快速、准确地鉴别出毛白杨2n雌雄配子植株，可应用于生产或科研实践中毛白杨2n雌雄配子植株的鉴别。
序列表<110>北京林业大学<120>一种鉴别毛白杨2n配子植株的方法<130>p0898<160>6<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>19<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>
<400>1gactgcgtac caattccat 19<210>2<211>19<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>
<400>2gatgagtcct gagtaaact 19<210>3<211>19<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>
<400>3gactgcgtac caattcaaa 19<210>4<211>19<212>DNA<213>Artificial<220>
<223>
<400>4gactgcgtac caattcaaa 19<210>5<211>246<212>DNA<213>(Poppulus tomentosa Carr.)<400>5gatgagtcct gagtaaactg atgaaggctt gttgagctta tgcattccaa ccataattgt 60gtttcttcag caaattggtg aggggtttac taatgatccc aaaatgtcat atgaacttcc120tataataccc agccaacccc aggaatcctc gtaattcctt caaggattgc aaagtaggcc180aattgtccac aacttcaatt ttcttcctat tggttgccac tccttctatg gaattggtac240gcagtc 246
<210>6<211>204<212>DNA<213>(Poppulus tomentosa Carr.)<400>6gactgcgtac caattcaaat ggttctacca gggtagtgaa attccagaat ggttcggtga 60caaaggaatt ggatcttcac ttaccataca gttgccctca aattgttatc agctcaaggg120aattgctttt tgccttgtct ttctactcca tcttccctcc tataaaatgg tatattttga180ttaccatgtt actcaggact catc 20权利要求
1.一种鉴别毛白杨2n雌或雄配子植株的方法，包括以下步骤以SEQ IDNO1和SEQ ID NO2所示的核苷酸序列作为分子标记的引物组合，采用常规的扩增片段多态性分子标记方法对需要鉴别的毛白杨无性系植株进行分子标记，如果从待鉴别的毛白杨植株中没有扩增出1条大小为246bp的多态性条带，则该待鉴别毛白杨植株是2n雌或雄配子植株；或以SEQ ID NO3和SEQ ID NO4所示的核苷酸序列作为分子标记的引物组合，采用常规的扩增片段多态性分子标记方法对需要鉴别的毛白杨植株进行分子标记，如果从待鉴别的毛白杨植株中扩增出1条大小为204bp的多态性条带，则该待鉴别毛白杨植株为2n雌或雄配子植株。
全文摘要
本发明公开了一种鉴别毛白杨2n雌雄配子植株的方法，属于植物遗传育种领域。本发明采用常规的扩增片段多态性作为分子标记的方法，以筛选得到的特定核苷酸序列组合作为分子标记的引物，对需鉴别的毛白杨无性系植株进行AFLP分子标记，根据标记结果中特定多态性条带的有或无，能够快速、准确地鉴别出毛白杨2n雌雄配子植株。本发明方法对于毛白杨三倍体育种具有重要的意义，同时，对其它相似植物2n配子植株的选择也有一定的借鉴价值。
文档编号C12Q1/68GK1858257SQ200610064959
公开日2006年11月8日 申请日期2006年3月20日 优先权日2006年3月20日
发明者康向阳, 张正海 申请人:北京林业大学