专利名称：分离自芥菜的诱导型启动子的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程领域，其涉及一种植物启动子。具体地说，涉及从芥菜分离到的受伤害、茉莉酸甲酯(MeJA)诱导的启动子。
背景技术：
植物体因为不能自主移动，只能被动地适应环境。经过长期的进化，植物体建立了一套保护机制，以抵御不利因子如病虫害的侵害，如形成很厚的细胞壁等物理屏障；以及快速的启动一些基因的表达，用以抵御病、虫害的攻击，如几丁质酶基因、蛋白酶抑制剂基因，以及病程蛋白基因等。人们发现病虫害发生时植物体内的激素，如茉莉酸甲酯(MeJA)、脱落酸(ABA)、水杨酸(SA)等的含量发生显著的变化，推测这些激素在植物抗病虫害过程中发挥了重要作用，因此这些激素被用于抗病虫，以及基因的表达调控研究。不同的品种、个体抗病虫的能力不一，人们通过选择、杂交等传统的方法培育抗病虫品种，为农作物的高产、稳产做出了巨大贡献。随着分子生物学的发展，植物抗病虫机制得以在分子水平上进行描述，分子育种得以实现并日益引起人们的重视。
利用基因工程的方法，人们将特定的基因导入植物中，提高植物的抗虫能力。如孟山都公司将CaMV35S启动子驱动的Bt基因导入棉花，实现了棉花对棉铃虫的有效控制。近年转基因植物产业化步伐不断加快。1996年全球转基因作物的面积170万公顷，2003年6770万公顷，7年增长近40倍。到2005年，转基因作物面积已达15亿亩，占全球总种植面积的10％。美国在此领域处于绝对优势，种植面积占全球总面积的60％以上。但近年发展中国家转基因作物种植面积增幅非常快，例如印度2005年的转基因棉花面积比2004年增加260％，达到130多万公顷；巴西的转基因大豆面积比2004年增加88％，达到930多万公顷。我国种植转基因棉花280万公顷，占全球总面积的4％，占我国棉花总面积的66％。目前全世界已有21个国家种植转基因作物。从这些发展趋势看，转基因作物品种“常规化”只是时间问题。20多年来，植物基因工程中较为广泛使用的启动子有来自花椰菜花叶病毒的CaMV35S启动子，来自木薯叶脉花叶病毒的CsVMV35S启动子，来自植物本身的Adh1、Act1、Ubi1等启动子。这些均是组成型启动子。
由于组成型启动子驱动的基因在植物不同组织器官中均有不同程度的表达，应用中逐渐暴露出一些问题。在多数情况下，人们并不希望外源基因在转基因植物整个植株、整个生育期中广泛表达，因为一方面会增加植株的代谢负担，另一方面，有些外源蛋白对植物并非必需甚至有毒，不利于植物正常生长；另外，在一些植物器官中，组成型启动子的表达活性不强(任茂智等，一个棉花生殖器官优势表达基因的启动子功能分析，中国科学C辑生命科学，2005，35(1)22-28)。
植物诱导型启动子的研究很多，是植物生物技术领域的一个研究热点。研究内容主要集中在两个方面，一是关于天然的诱导型启动子的研究，包括对光、温、水、盐、创伤、病原菌侵袭等应答的启动子，多偏向于研究基因表达的调控机理。二是关于人工诱导型启动子的研究，即利用对天然启动子的研究成果，构建外源基因可诱导表达系统(Xu Bet al，Methyl jasmonate induced expression of the tobacco putrescine N-methyltransferase genes requires both G-box and GCC-motif elements，PlantMolecular Biology，2004，55(5)743-61；路静等，高等植物启动子及其应用研究进展，自然科学进展，2004，14(8)856-862)。具体而言，例如Guevara-Garcia等和Ni等分析了Ti质粒上甘露碱合成酶基因启动子的创伤诱导元件(Ni，M.et al.，Sequence-specific interaction of wound-inducible nuclear factors with mannopinesynthase 2’promoter wound-responsive elements，Plant Molecular Biology，1996，30(1)77-96)；Siebertz等(1989)，Zhu等(1993)，Rouster等(1997)，Devoto等(1998)，Xu等(2004)分别研究了马铃薯wunl基因、水稻几丁质酶基因RCH10、大麦脂肪氧合酶基因、大豆多聚合半乳糖醛酸酶抑制酶基因和烟草腐胺N-甲基转移酶基因启动子序列与创伤或JA诱导的关系(Devoto，A.et al.，The promoter of a geneencoding a polygalacturonase-inhibiting protein of Phaseolus vulgaris L.Isactivated by wounding but not by elicitors or pathogen infection.Planta，1998，205(2)165-174；Rouster，J.et al.，Identification of a methyl jasmonate-responsiveregion in the promoter of a lipoxygenase l gene expression in barley grain，Plant Journal，1997，11(3)513-523；Xu B et al，Methyl jasmonate induced expressionof the tobacco putrescine N-methyltransferase genes requires both G-box andGCC-motif elements，Plant Molecular Biology，2004，55(5)743-61)。目前已鉴定出的与创伤诱导有关的启动子模序(motif)至少有6种AG-motif(AGATCCAA)、13-bp(TGGTAGGTGAGAT)、G-box(CACGTG)、L-box(ATTCTCACCTACCA)、P-box(CTCCAACAAACCCCTTC)和A-box(CCGTCC)；与茉莉酸(JA)诱导有关的启动子模序至少有4种G-box、13-bp、Hexamer-motif(TGACGT)和GCC-box。上述模序有助于研究人员对获得的启动子片段进行预测，以初步确定是否属于诱导型启动子。
本发明的部分人员参与的关于芥菜几丁质酶的研究中(Zhao和Chye，Methyljasmonate induces expression of a novel Brassica juncea chitinase with twochitin-binding domains，Plant Molecular Biology，1999，Vol 40，p1009-1018)，涉及在芥菜中克隆一个几丁质酶基因(BjCHI1)。BjCHI1与先前的植物几丁质酶基因的重要区别在于具有两个几丁质结合域编码区，并在随后的研究中表明该基因编码的蛋白质兼具几丁质酶活性和凝集素活性，能够抑制真菌的生长(Fung等，Tobacco-expressedBrassica juncea chitinase BjCHI1 shows anti-fungal activity in vitro，PlantMolecular Biology，2002，Vol 50，p283-294；欧阳石文等，芥菜新型几丁质酶BjCHI1的结构与功能关系的研究，2002年，博士论文；Tang等，Functional analyses of thechitin-binding domains and the catalytic domain of Brassica juncea chitinaseBjCHI1，Plant Molecular Biology，2004，Vol 56，p285-298)，因而可能具有多种功能和用途。在对BjCHI1基因进行研究时，研究人员已经注意到①BjCHI1正常情况下保持沉默，但遇到JA(jasmonate)、创伤、虫(Pieris rapae)食、真菌(Aspergillus niger)侵袭，就会迅速、强劲地启动表达(Fung KL，Zhao，KJ，等，Tobacco-expressed Brassicajuncea chitinase BjCHI1 shows anti-fungal activity in vitro，Plant MolecularBiology，2002，50(2)283-294；Zhao，K.J等，Methyl jasmonate induces expressionof a novel Brassica juncea chitinase with two chitin-binding domains，PlantMolecular Biology，1999，40(6)1009-1018)；②其双元CBD结构特征决定它兼具几丁质酶和凝集素的双重特性，在植物病虫防御系统中具独特作用(Chye ML，Zhao KJ等，An agglutinating chitinase with two chitin-binding domains confers fungalprotection in transgenic potato，Planta，2005，220(5)717-730)；Tang CM，ChyeML，Ramalingam S，Ouyang SW，Zhao KJ等，Functional analyses of the chitin-bindingdomains and the catalytic domain of Brassica juncea chitinase BjCHl1，PlantMolecular Biology，2004，56(2)285-98；欧阳石文，赵开军等，兼具凝集素活性的植物几丁质酶BjCHI1，生物工程学报，2002，18(5)51-56)。发明者深感调控BjCHI1基因的启动子极具研究价值。通过发明者的努力，终于成功地分离到在芥菜中控制BjCHI1基因的启动子(称为BjC-p)，并且通过实验证明该启动子受创伤的强烈诱导。
发明内容
本发明的目的是提供一种在植物例如烟草中能发挥有效作用的诱导型启动子。这是本发明者经过潜心努力，从芥菜基因组中分离到的一种强诱导型启动子，从而完成本发明。
本发明涉及来源于芥菜(Brassica juncea)的诱导型启动子，它控制几丁质酶基因BjCHIl的表达，其具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。此处的诱导是指伤害诱导(如虫害)和茉莉酸甲酯诱导。
研究表明，本发明的启动子还包括由SEQ ID NO1中第92至1378位所示核苷酸序列组成的启动子、由SEQ ID NO1中第302至1378位所示核苷酸序列组成的启动子、由SEQ ID NO1所示第456至1378位核苷酸组成的启动子、或SEQ ID NO1所示第556至1378位核苷酸组成的启动子。它们仍然具备受伤害或JA诱导的启动子活性。
本发明还提供上述各启动子的互补序列。
本发明的启动子还包括在严格条件下与SEQ ID NO1所示核苷酸序列、SEQ ID NO1中第92至1378位核苷酸序列、SEQ ID NO1中第302至1378位核苷酸序列、SEQ IDNO1所示第456至1378位核苷酸序列或SEQ ID NO1所示第556至1378位核苷酸序列，以及它们的互补序列杂交的分离DNA，且仍然具备受伤害或JA诱导的启动子活性。其中，所述严格杂交条件，包括典型为在约2X至约10X SSC(由20X SSC母液中释稀得到，该母液包含3摩尔/升氯化钠和0.3摩尔/升柠檬酸钠的蒸馏水溶液，pH 7.0)、约2.5X至约5X Denhardt’s溶液(由50X母液释稀得到，该母液包含1％(w/v)牛血清白蛋白，1％(w/v)ficoll及1％(w/v)聚乙烯吡咯烷酮于蒸馏水中)、约10毫克/毫升至约100毫克/毫升鱼精子DNA及约0.02％(w/v)至约0.1％(w/v)SDS中于约50℃至约70℃温育数小时至过夜以完成核酸杂交。高严谨条件优选为6X SSC、5X Denhardt’s溶液、100毫克/毫升鱼精子DNA及0.1％(w/v)SDS中于55℃温育数小时。
本发明提供了一种包含本发明启动子的重组表达载体，在所述启动子的控制下，该载体可以含有其他的结构基因，作为例子，优选的如抗虫基因如Bt蛋白基因，抗病基因如几丁质酶基因等。上述重组载体可以导入到合适的宿主细胞中。选取合适的宿主细胞是本领域技术人员公知的。例如，所述宿主细胞包括真核或原核细胞。对于原核细胞而言，优选为大肠杆菌；对于真核细胞，优选为酵母细胞、植物细胞等。其中，构建重组表达载体及导入到宿主细胞可利用本领域常规采用的方法来完成。
本发明进一步提供一种产生转化植物的方法，包括
(a)提供上述重组表达载体；(b)用所述重组表达载体转化植物，获得转化植株，并且获得的转化植物在受到虫害时能够诱导表达所述外源基因。
因而，通过上述方法将本发明的重组表达导入宿主植物体，优选的植物体为双子叶植物，可以获得有用的转化植物。由于本发明的启动子属于诱导型启动子，当外源基因是抗虫基因时，当转化植物受到虫咬伤时即能够表达所述抗虫基因以获得对虫害的抗性。
本发明还提供一种在植物中表达外源基因的方法，包括(a)提供上述的重组表达载体；(b)用所述重组表达载体转化植物，获得转化植株；(c)培育所述转化植物；(d)用伤害或茉莉酸甲酯处理所述转化植物，以诱导表达导入的外源基因。
对于将重组表达载体导入植物基因组的技术在本领域众所周知的。例如，使用包括农杆菌介导的转化、用DNA包裹的钨或金颗粒biolistic轰击、电穿孔或聚乙二醇(PEG)介导的原生质体DNA转化、真空渗透和其它机械DNA转移技术在内的各种方法将根据本发明所述的重组表达载体有效地导入靶植物细胞的基因组。含有本发明的启动子的转基因植物细胞可以在适当的条件进行繁殖。并可以使用已知方法和条件从原始转基因细胞制备成完整植物或植物的繁殖材料。
附图的简要说明
图1BjC-p启动子全长(SEQ ID NO1中第92至1378位核苷酸序列，载体pBICHP0)驱动GUS基因在烟草叶片中伤害处理前后表达的GUS组织化学染色结果。
图示说明A作为阴性对照的野生型烟草K326叶片，左为伤害0小时，右为伤害3小时取的样；B转化pBICHP0的烟草叶片，左为伤害0小时，右为伤害3小时取的样C作为阳性对照的转化pBI121的烟草叶片，左为伤害0小时，右为伤害3小时取的样。
图2BjC-p启动子不同长度的截短片段驱动GUS基因在烟草叶片中伤害处理前后，GUS表达活性的组织染色和荧光分析结果。
图示说明上部分为GUS组织染色结果，A，转化pBICHP1的烟草叶片，左为伤害0小时，右为伤害3小时取的样；B，转化pBICHP2的烟草叶片，左为伤害0小时，右为伤害3小时取的样；C，转化pBICHP3的烟草叶片，左为伤害0小时，右为伤害3小时取的样。下部分为GUS活性荧光分析结果，纵轴为GUS表达量，横轴为载体名，Wt是作为阴性对照的野生型烟草K326。
具体实施例方式
常规分子生物学实验方法可参见分子克隆实验指南，J.Sambrook，等编著，第二版，冷泉港实验室出版，冷泉港，N.Y.，1989。试剂和其它物质来自商业来源或如特别指出的。
实施例1通过接头PCR从芥菜基因组分离BjCHI1基因启动子(BjC-p)1.1芥菜基因组DNA的制备种植于室内一个月的芥菜(Brassica juncea)，取嫩叶约3克，参考McCouch等的方法(McCouch S.P.，et al.，Molecular mapping of rice chromosome，Theor Appl Genet，1988，76815-829)采用SDS法提取基因组DNA。所提取的芥菜基因组DNA，经琼脂糖凝胶电泳检测，紫外分光光度计测量浓度后于-20℃保存。
1.2芥菜基因组DNA的酶切及与接头连接参照Siebert等人的方法(Siebert P.D.，et al.，An improved PCR method for walking inuncloned genomic DNA，Nucleic Acids Research，1995，23(6)1087-1088)，取2微克芥菜基因组DNA，分别用限制性内切酶EcoRV、Dra I和Sma I完全切割，20微升酶切体系中分别加入上述酶各60U，37℃保温9小时。酶切产物经等体积的酚氯仿抽提一次，70％乙醇沉淀，20微升TE缓冲液复溶。纯化后的酶切产物与接头连接，接头长链序列5′-CTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG CTC GAG CGG CCG CCC GGG CAG GT-3′(SEQID NO2)，接头短链序列5′-ACC TGC CC-NH2-3′(SEQ ID NO3)。连接体系20微升体系里含接头(25微摩尔/升)4微升，纯化的酶切产物8微升，10倍连接缓冲液2微升，T4连接酶(3U/μL)2微升，超纯水2微升。16℃连接12小时。
1.3PCR过程根据接头序列设计上游引物(接头引物)AP1和AP2，序列分别为AP15′-GGA TCCTAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC-3′(SEQ ID NO4)，AP25′-AAT AGG GCT CGAGCG GC-3′(SEQ ID NO5)；根据BjCHI1基因cDNA序列设计下游引物(基因特异引物)GSP1和GSP2，序列分别为GSP15′-ACA CTG CGG GGT TGG AGG A-3′(SEQ IDNO6)，GSP25′-GCA TAG ACC GTT GGG GCA G-3′(SEQ ID NO7)。以芥菜基因组DNA酶切连接产物为模板，以AP1和GSP1为引物进行第一轮PCR，PCR程序为94℃，4分钟；94℃，45秒；62℃，2分钟；72℃，3分钟；35个循环；72℃，15分钟。以第一轮PCR产物为模板，以AP2和GSP2为引物，进行第二轮PCR，PCR程序同第一轮，但只进行30个循环。
1.4克隆和序列分析琼脂糖凝胶回收第二轮PCR产物，连入克隆载体pGEM-T Easy载体，导入大肠杆菌JM109，测序。所得序列在NCBI网站上用B1ast工具进行同源比对，并与BjCHI1基因的cDNA序列进行两两比对，确证所得新序列为BjCHI1基因的上游序列。除去BjCHI1基因cDNA的5′端序列后，所得BjCHI1基因的上游序列长度为1378bp，其序列参见SEQID NO1。
实施例2启动子功能的验证通过将启动子与报告基因连接，之后转入植物体，检测报告基因的表达来进行。
2.1重组表达载体pBICHP0的构建pBICHP0用BjC-p启动子(由SEQ ID NO1所示第92至1378位核苷酸)序列取代表达载体pBI121中GUS基因上游的35S启动子序列构建而成。作为表达载体的植物双元表达载体pBI121含新霉素磷酸转移酶基因(Npt II)和作为报告基因的β-葡糖醛酸酶(GUS)基因。通过PCR的方法从芥菜基因组获得BjC-p启动子序列(由SEQ ID NO1所示第92至1378位核苷酸)，所用PCR引物对KjXeB115′-TAA AGC TTT CTC AAA TAT GAG GTT TTA CTA TTC AT-3′(SEQID NO8)KjWXF75′-TAG GAT CCG TTT CTC TGA GCT GTA TGG TTG-3′(SEQ ID NO9)由于分别在引物的5′端增加了HindIII和BamH I酶切位点，故对PCR扩增片段用HindIII和BamH I酶切，将其与同样经HindIII和BamH I酶切的pBI121大片段连接，电击法转入大肠杆菌DH5α，再从DH5α提取质粒，经酶切、测序验证序列无误后，重组质粒命名为pBICHP0，再电击转入根癌农杆菌EHA105。
2.2农杆菌介导的植物转化构建好的植物表达载体pBICHP0通过农杆菌介导法转入烟草K326中。烟草种子用70％乙醇泡40秒，0.1％升汞泡2分钟，播种于1/2MS培养基，25℃，16小时光照/天。40天后取嫩叶切成0.5×0.5厘米大小的叶盘，用含pBICHP0的EHA105的菌液浸泡，搅拌，5分钟后取出，无菌滤纸吸干，置于共培养基(MS培养基附加1毫克/升6-BA和0.1毫克/升NAA)上，25℃，暗培养60小时。含pBICHP0的EHA105菌液的准备在附加50毫克/升Kan和25毫克/升Rif的LB培养基(每升含有10克胰蛋白胨，5克酵母提取物，5克氯化钠)上划单菌落，挑取新鲜单菌落于2毫升附加50毫克/升Kan和25毫克/升Rif的LB培养基中摇菌，28℃，200转/分钟摇12小时，再取出100微升于100毫升附加50毫克/升Kan和25毫克/升Rif的LB培养基中摇菌，28℃，200转/分钟摇至OD600值为0.8，3000g，15分钟离心收集菌体，用MS液体培养基稀释至OD600值为0.8。暗培养结束后，叶盘先用无菌水洗15分钟，再用含500毫克/升Car的无菌水洗15分钟，最后用含500毫克/升Car的液体MS洗20分钟，之后将叶盘移入芽诱导培养基上(MS培养基附加100毫克/升Kan和500毫克/升Car以及1毫克/升6-BA和0.1毫克/升NAA)，25℃，16小时光照/天，每两星期换一次新鲜培养基。等芽长为1厘米左右，将芽切下，移入生根培养基(MS培养基附加100毫克/升Kan和250毫克/升Car以及0.1毫克/升IAA)，25℃，16小时光照/天，每两星期换一次新鲜培养基。等根的长度约为两厘米时，将小苗移入灭菌的土中温室中培养，直至收获种子。
2.3pBICHP0转化的转基因植株的GUS表达活性分析GUS组织化学染色取转基因烟草T1代叶片进行GUS组织化学染色。方法，待烟苗长出5个真叶时，在第3个真叶上进行伤害处理以中叶脉为分界，剪下一半作为伤处理0小时的样品，同时，另一半用针扎孔，3小时后取样，作为伤处理3小时的样品。将叶片剪成约3毫米×3毫米的碎片，置于冰上用90％丙酮浸泡30分钟，之后用1摩尔/升的磷酸盐(200毫升超纯水中含NaH2PO47.78克，Na2HPO451.624克，pH 7.2)洗两次，每次15分钟；之后加入X-Gluc反应液(含终浓度为Na2HPO4，50毫摩尔/升；NaH2PO4，50毫摩尔/升；EDTA，1毫摩尔/升；Triton-X100，0.4％；K4Fe(CN)6，1毫摩尔/升；K3Fe(CN)6，1毫摩尔/升；X-Gluc，0.5毫克/升)37℃反应24小时；将反应液吸出，用70％乙醇脱色，肉眼观察及显微照相。
结果如图1所示，GUS活性强的显示出很深的蓝色，无蓝色则表示无GUS活性或GUS活性很低。转化pBICHP0和作为阳性对照转化pBI121的烟草叶片能染出很蓝的颜色来，而作为阴性对照的野生型烟草叶片则无蓝色。说明由SEQ ID NO1中第92至1378位核苷酸所示序列具有很强的伤害诱导的启动子活性。
实施例3截短的启动子活性分析研究者认为上述全长启动子中存在活性区域，因此对由SEQ ID NO1所示的全长启动子(SEQ ID NO1所示第92至1378位核苷酸)进行了截短，获得相应的截短启动子，以分析它们的活性。
3.1重组表达载体的构建以pBICHP0质粒为模板，使用相应的引物对进行PCR扩增得到三个截短的启动子序列，构建以下表达载体1)SEQ ID NO1所示第302至1378位核苷酸作为启动子，由引物KjXeB1和KjWXF7扩增得到，构建的载体称pBICHP1；2)SEQ ID NO1所示第456至1378位核苷酸作为启动子，由引物KjXeB2和KjWXF7扩增得到，构建的载体称pBICHP2；3)SEQ ID NO1所示第556至1378位核苷酸作为启动子，由引物KjXeB3和KjWXF7扩增得到，构建的载体称pBICHP3；KjXeB15′-TAA AGC TTC CCA TCC AAA AGAGTC CAA A-3′(SEQ ID NO10)；KjXeB25′-TAA AGC TTT TTT CGC CAA AAC CAT AAA ATA-3′(SEQ ID NO11)；KjXeB35′-TAA AGC TTC AAG CGA ACC CAT CCT ATT G-3′(SEQ ID NO12)；KjWXF75′-TAG GAT CCG TTT CTC TGA GCT GTA TGG TTG-3′(SEQ ID NO9)具体操作过程可参照实施例2。
3.2农杆菌介导的植物转化具体操作过程可参照实施例2。
3.3GUS活性分析GUS组织化学染色取样取转基因烟草的T1代种子，种于土中，温室内培养，28℃，16小时光照/天。待烟苗长出5个真叶时，在第3个真叶上进行伤害处理以中叶脉为分界，剪下一半作为伤处理0小时的样品，同时，另一半用针扎孔，3小时后取样，作为伤处理3小时的样品，进行GUS组织化学染色。具体染色方法同实施例2。
结果如图2上部分所示，对于上述三个重组表达载体转化的烟草植株而言，在伤害处理3小时后，蓝色明显比0小时的要强，说明pBICHP1、pBICHP2、pBICHP3中包含的启动子片段均具有伤害诱导性。
GUS活性荧光分析取转基因烟草的T1代种子，种于土中，温室内培养，28℃，16小时光照/天。待烟苗长出5个真叶时，在第3个真叶上进行伤害处理以中叶脉为分界，剪下一半作为伤处理0小时的样品，另一半用针扎孔，3小时后取样，作为伤处理3小时的样品。取下的样品保存在-70℃冰箱中。烟叶样品在液氮下研磨成粉末，转入1.5毫升离心管置于冰上，加入400微升抽提缓冲液每100毫克样品(抽提缓冲液组成50毫摩尔/升NaH2PO4，10毫摩尔/升EDTA，0.1％TritonX-100，0.1％十二烷基肌氨酸钠，10毫摩尔/升β-巯基乙醇)，用研棒研成浆，之后4000转每分钟离心10分钟，取上清，-70℃保存。取10微升上清液用于测定GUS活性。200微升的反应体系，190微升反应液(抽提缓冲液中含有终浓度为1毫摩尔/升的4-MUG)中加入10微升上清液，混匀后置于37℃的水浴中，从中每10分钟取出20微升并用180微升0.2摩尔/升的碳酸钠终止反应。在96微孔板上进行测定，使用GENios多功能酶标仪，激发光波长340纳米，吸收光波长465纳米。以4-MUP作标准物制作标准曲线。样品蛋白含量的测定使用Bradford法，用BSA制作标准曲线，加入考马斯亮蓝R-250混匀后测其595纳米处的OD值。GUS活性以皮摩尔4-MU/分/毫克蛋白质表示。
结果如表1或图2下部分所示表1 转基因烟草GUS活性分析
注pBICHP1、pBICHP2、pBICHP3表示是用载体pBICHP1、pBICHP2、pBICHP3、转化烟草所得；所分析的转基因植株全部为其T1代，数据为三棵不同T1代植株的平均值；Wt是作为阴性对照的野生型烟草K326。
表1及图2的结果表明，重组表达载体pBICHP1、pBICHP2和pBICHP3转化烟草植株，荧光分析中都表现出伤害诱导表达活性。
本领域技术人将理解在不背离本发明广泛限制和范围的情况下，可以对上述举例说明的启动子和含启动子的构建体进行许多变化。
序列表<110>中国农业科学院作物研究所<120>分离自芥菜的诱导型启动子<130>
<140>
<141>
<160>
<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>1387<212>DNA<213>芥菜(Brassica juncea)<400>1ATTAATATAA TTATATGTAA GTTACTAAAT CATAAAAGCT AAAATAAAAA ATAAATAGCA 60TTTTAAAATT TTGAATAACA GAATAATAGA ATCTCAAATA TGAGGTTTTA CTATTCATAC120CTTTAAAATT AGAAGGTTTA AAAATCTGTT AAAAAGTTAA AATTCTCAAA ATTTAAATGT180TTAAAAATCT ATTGAGAATG CTCTAAAAAC AAATATGTTT ATCGTTAACA TAGGAATCAT240CCAAATGATC CATCCAGATA AATTTTAAGA TTTTAATTTT AAATAAAATT CATCAAAATA300ACCCATCCAA AAGAGTCCAA AATAACAAAT GACAATTTCA CCTTTATTTT AACAAAAATT360ATATTCAAAC TAGACAAACA TGATAATTGT GATATAGTTT CTCAACAAGT TTCAAAAACA420ATTATAGTTT TCCACCATAA TTGTAAACAC ACATATTTTC GCCAAAACCA TAAAATATAT480CTTCTCGCTA AAACAACAAG AAAAACATTT GTCCGTGAAT TCCATCTCTT CTCATAAACT540TCATCTTCCA TCGTATCAAG CGAACCCATC CTATTGGGGG GTATGTGATT CATGAGCCTT600AATTAGGGTG GTACAGTCAG CGACTCCTGA GCTTCAGAGA GGGTAGTCCA GCAGCTAGTG660ACTCTGCTAG AGATAGTGTG GTCCAGCTAG TGAGTAGTGA CTCATGAGGT AGAGAGAGGG720TGGTCCATCA TATATCGTGT TAGACAAATT CTATATAGAC AATGAGGTAA ATGTGGGATA780TGAAGGTGGT GGCAAATTTT AGAACAATTA GTATTTAAGT ATAGTAAACA TAAAAACAAA840CCAGCACTGC TTATCTTCGA TTCTATCAAG CGAACCCACC TTATATTGAA TTAATTTATG900GTAGCAGTGA TTCGTGAACG TCAGAGAGGG TGGTCCCTCT AGTGACTCAT GAGCTAGAGA960GAGGGTGGTC CAGCTATCGT GTAGAAATAT TCTATAGACC ATTAGATAAA CGTGCCAAAT 1020
GAACTTGGTG GTGACAAAAT AGAAGTTTAG AATGTTTGGG TTCCCGGTAA AAAGGTGAAA1080CCACCTTTTT TTTTTTTTTT TTTTACCAAC GTTGAATTGG CCTAATGATA AAAGGGTTAC1140GCTTGTAACT ACCGCCACCC AGGTTTAATT CACGGTGGGA GAGACTATTT ATAATGCTTA1200GGTTTCTGGC AAAGAAGTGA AACCACTTTT TTTCTTTCCA GAAAAAATAG AAGTCTAGAA1260AACATAAAAA CAAGTATATA AAATTCGATG TGATTTAACA CTAACTGATT TTGTACATTG1320CATGTTGCTA TATATACCCT TACTTGCCTC TTAAAACAAC CATACAGCTC AGAGAAAC 1378<210>2<211>44<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>2CTAATACGAC TCACTATAGG GCTCGAGCGG CCGCCCGGGC AGGT 44<210>3<211>8<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>3ACCTGCCC-NH28<210>4<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物
<400>4GGATCCTAAT ACGACTCACT ATAGGGC 27<210>5<211>17<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>5AATAGGGCTC GAGCGGC17<210>6<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>6ACACTGCGGG GTTGGAGGA 19<210>7<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>7GCATAGACCG TTGGGGCAG 19<210>8
<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>8TAAAGCTTTC TCAAATATGA GGTTTTACTA TTCAT35<210>9<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>9TAGGATCCGT TTCTCTGAGC TGTATGGTTG 30<210>10<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>10TAAAGCTTCC CATCCAAAAG AGTCCAAA28<210>11<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>11TAAAGCTTTT TTCGCCAAAA CCATAAAATA30<210>12<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物<400>12TAAAGCTTCA AGCGAACCCA TCCTATTG 28
权利要求
1.一种分离的启动子，包含1)SEQ ID NO1所示序列或其互补序列的DNA；2)SEQ ID NO1中第92至1378位核苷酸所示序列或其互补序列的DNA；3)SEQ ID NO1中第302至1378位核苷酸所示序列或其互补序列的DNA；4)SEQ ID NO1中第456至1378位核苷酸所示序列或其互补序列的DNA；5)SEQ ID NO1中第556至1378位核苷酸所示序列或其互补序列的DNA；或6)在严格条件下与1)或2)或3)或4)或5)的DNA杂交的分离DNA，且仍然具备启动子活性。
2.根据权利要求1所述的启动子，其特征在于它分离自芥菜。
3.一种重组表达载体，其特征在于含有权利要求1所述的启动子。
4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于还包含与所述启动子可操作连接的外源基因，所述外源基因的表达受所述启动子的控制。
5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于所述外源基因是抗虫基因或抗病基因。
6.含有权利要求3-5任一项所述的重组表达载体的宿主细胞。
7.权利要求6所述的宿主细胞，其是大肠杆菌。
8.一种产生转化植物的方法，包括(a)提供根据权利要求4的重组表达载体；(b)用所述重组表达载体转化植物，获得转化植株，并且获得的转化植株在受到虫害时，所述启动子被诱导激活，启动所述外源基因的表达。
9.一种在植物中表达外源基因的方法，包括(a)提供根据权利要求4的重组表达载体；(b)用所述重组表达载体转化植物，获得转化植株；(c)培育所述转化植物；(d)用伤害或茉莉酸甲酯处理所述转化植物，以诱导表达导入的外源基因。
全文摘要
一种从芥菜分离到的受伤害、茉莉酸甲酯(MeJA)诱导的启动子。利用它与外源基因可操作性的连接构建成重组表达载体，其转化的植物能够被伤害、MeJA诱导表达外源基因。尤其是当外源基因是抗虫基因时，可以获得有用的转化植物，例如当转化植物受到虫害时即能够诱导表达所述抗虫基因以获得对虫害的抗性。
文档编号C12N15/82GK1831128SQ20061006490
公开日2006年9月13日 申请日期2006年3月16日 优先权日2006年3月16日
发明者赵开军, 吴雪峰, 谢恩倍, 王春连 申请人:中国农业科学院作物科学研究所