一种培养cPGCs的完全培养基以及其使用方法与流程

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种培养cPGCs的完全培养基以及其使用方法。

背景技术：

原始生殖细胞细胞(Primordial Germ Cells,PGCs)是配子的前体并且是繁殖的中心。生殖细胞谱系的精确自我更新是生育和繁殖成功的基础。在禽类物种中，PGCs在胚胎发生期间比在哺乳动物中更早形成,在雌性中它最终发育为卵细胞,在雄性中最终发育为精子。在胚胎中的迁移途径—通过血液循环后移植入性腺,使它能成为冷冻保种的目标细胞,同时成为转基因禽类制备中的良好载体。由于PGCs能够发育成为有功能的配子,它作为载体携带外源基因,制造性腺嵌合体乃至制备转基因动物,具有较高的研究价值。

目前在鸡原始生殖细胞(Chicken Primordial Germ Cells，cPGCs)的培养中大量采用有血清、饲养层培养体系培养，而这种培养体系存在一定的缺陷，如何获得一种更方便、无不明确物质成分的体外培养方法显然成为cPGCs培养的关键。血清是一种成分极其复杂的外源物质，在实验和应用中无法确定是血清中何种组分影响了细胞行为。饲养层细胞是指一些特定细胞经有丝分裂阻断剂处理后得到的细胞单层。目前所采用的饲养层主要有STO细胞株、鸡胚胎原代成纤维细胞(PCEF)、性腺基质细胞(SCs)、小鼠胚胎原代成纤维细胞(PMEF)等，均能不同程度促进细胞增殖和分泌白血病抑制因子(LIF)以及产生其他分泌物以抑制其分化。由于这些分泌物质成分尚不清楚，在研究细胞分化的分子机制方面产生一定的干扰；在基因修饰的研究中，需要通过药物筛选获得稳定表达目的基因的cPGCs，通常采用含有抗性基因的饲养层来进行培养筛选，而这种有饲养层体系的培养将实验复杂化，增加了实验的操作难度，且药物筛选后对饲养层造成的破坏也会影响细胞生长；另一方面，这些细胞需要丝裂霉素处理阻断其有丝分裂后用作饲养层细胞，即使是极其微量的丝裂霉素残留也会对cPGCs细胞的生长造成影响；非禽类的异源细胞用作饲养层饲养时，也会对cPGCs细胞产生一定的影响；动物源性的血清和饲养层细胞的污染物会污染细胞自身的应用。此外，饲养层的使用以及血清的添加也一定程度的延长了实验的时间，增加了实验经费的投入。

因此，建立cPGCs无血清、无饲养层培养体系可以为以后在胚胎发育基础研究、转基因禽类生产、药物筛选、家禽育种等方面提供巨大贡献。

技术实现要素：

本发明克服了现有技术中的缺点，提供了一种培养cPGCs的完全培养基以及其使用方法，其具有成分明确、方便操作、减少污染、降低成本、避免细胞受损等优势，应用前景广阔。

为了解决上述技术问题，本发明是通过以下技术方案实现的：

一种培养cPGCs的完全培养基，包括KO-DMEM、B-27supplement、NAA、nucleosides、GlutaMAX II、β-巯基乙醇、卵清蛋白、OVT、肝素钠、Activin A、TGF-β1、BMP4、FGF-2、IGF-1。

进一步，以KO-DMEM为基础培养基，并添加20-30ng/ml的BMP4、20-30ng/ml的TGF-β1、20-30ng/ml的Activin A、5-20ng/ml的OVT、1-5ng/ml的FGF-2。

进一步，以KO-DMEM为基础培养基，还包括其1-2％的50X B-27supplement、1％的100X NAA、1％的100X nucleosides、2.0mM GlutaMAX II、0.1mMβ-巯基乙醇、1-2％卵清蛋白、0.5％-2％肝素钠，均为体积比。

进一步，还含有以KO-DMEM为基础培养基，体积比0.5％-2％的三抗，所述三抗由青霉素、链霉素、两性霉素B组成。

一种培养cPGCs的完全培养基的使用方法，包括以下步骤：

(1)采集的14HH鸡胚血液置入含有cPGCs完全培养液的培养体系中培养，原代培养10-15d即可纯化细胞；

(2)将纯化后cPGCs细胞重新置入cPGCs完全培养基进行体外培养扩增；

(3)对体外培养扩增的cPGCs进行计数、间接免疫荧光检测，包括SSEA-1和DAZL表面标记。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

(1)本发明打破了有血清、有饲养层的传统培养方法，培养基的成分明确，便于研究细胞分化的分子机制。

(2)本发明避免了异源细胞作为饲养层后产生的不利影响。

(3)本发明避免了制备饲养层时一些药物残留，降低了对细胞的不良影响。

(4)本发明不需要培养饲养层细胞，降低了细胞培养时的污染风险。

(5)本发明简化了实验操作步骤，节省了时间。

(6)本发明一定程度上的降低了实验开支。

附图说明

附图用来提供对本发明的进一步理解，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制，在附图中：

图1是cPGCs在无血清、无饲养层培养条件下的细胞形态图；

图2是放大100倍的cPGCs在无血清、无饲养层培养条件下的细胞形态图；

图3是放大200倍的cPGCs在无血清、无饲养层培养条件下的细胞形态图

图4是无血清、无饲养层培养条件下的cPGCs的生长曲线。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

如图1至图4所示，本发明所述一种培养cPGCs的完全培养基以及其使用方法。

一、cPGCs完全培养基的配制

cPGCs完全培养液的配方包括86.9％Ko-DMEM、1％B-27supplement、1％100X NEAA、1％nucleosides、1％肝素钠、1％OVT、1％TGF-β1、1％GlutaMAX II、1％BMP4、0.1％β-巯基乙醇、1％Activin A、1％IGF-1、1％FGF-2、1％三抗、1％卵清蛋白，均为体积比。

各种因子的添加无严格的顺序，在常温操作即可，配制的过程无需加热，但培养基整个配制过程需在无菌条件下进行。

KO-DMEM：Knock out-DMEM一种胚胎干细胞培养基，NAA：非必需氨基酸；Nucleosides：核酸；GlutaMAX II：β-谷氨酰胺。

B-27supplement是无血清培养基添加因子，通常用于海马神经元和其他中枢神经系统(CNS)神经元的生长和保持其短期或长期活性，利于细胞的增值和自我更新；OVT是卵转铁蛋白，主要作用为提供细胞生长所需要的营养物质，促进细胞增殖、分化，同时OVT能与Fe³⁺形成稳定的配合物，清除Fe³⁺，抑制自由基产生的细胞毒性；肝素钠，与生长因子协同作用，同时抗凝血；Activin A即激活素A，是转化生长因子(TGF)β家族的一种分泌蛋白，可控制胚胎轴发育为有功能的前肠源性组织，调解多种细胞的生长和分化；转化生长因子-β1(Transforming growth factor-β1，TGF-β1)是具有多功能生物活性的细胞因子,可调节细胞的增殖、分化、衰老、粘附等；类胰岛素生长因子(insulin-like growth factor I，IGF-1)是肝细胞合成和分泌的一种重要生长刺激因子，在细胞增殖、分裂及凋亡过程中发挥重要影响；成纤维细胞生长因子-2((fibroblast growth factor 2，FGF-2)是一个有效的促细胞分裂剂，可增加细胞的体外增殖能力，获得更多的细胞数量，这种作用在低细胞密度时更明显，FGF-2也可维持cPGCs的体外多分化潜能；骨形成蛋白4(Bone morphogenetic protein 4，BMP4)是一种多功能的细胞因子，属于转化生长因子β(TGF-β)超家族，由早期胚胎外胚层释放，对生殖细胞的发育和功能发挥起着重要作用。

其中，非必需氨基酸(NAA)、B-27supplement、β-巯基乙醇、肝素钠、卵转铁蛋白(OVT)、卵清蛋白均购自Sigma公司；核苷(Nucleosides)购自Millipore公司；

二、cPGCS的无血清无饲养层培养

(1)胚血注射至含cPGCs无饲养层培养体系的48孔板中，37℃，5％CO₂培养箱培养；

(2)培养至第十天，取培养板中的细胞至500μL的离心管中，3000rpm离心5min，弃上清，以去除血细胞，完全培养液重悬细胞至48孔培养板中，37℃，5％CO₂培养箱培养。

三、cPGCs的鉴定

1.cPGCs形态观察

如图1至3所示，倒置荧光显微镜下观察无饲养层cPGCs，放大100倍、200倍观察细胞形态。

2.cPGCs的免疫荧光染色鉴定

(1)取第2代的cPGCs，3000rpm离心5min，弃上清，含5％FBS的PBS重悬细胞，3000rpm离心5min，弃上清；

(2)分别加入一抗(鼠抗SSEA-1，1:2000和兔抗DAZL，1：100)，4℃避光过夜，3000rpm离心5min，弃上清，含5％FBS的PBS重悬细胞，3000rpm离心5min，弃上清；

(3)分别加入FITC标记的二抗(羊抗鼠IgG和羊抗兔IgG，1：500)，37℃避光孵育30min，3000rpm离心5min，弃上清，含5％FBS的PBS重悬细胞，3000rpm离心5min，弃上清；

(4)加入1μg/mL DAPI避光复染5min，3000rpm离心5min，弃上清；加入抗荧光淬灭剂，倒置荧光显微镜下观察染色结果并拍照。

四、cPGCs的生长曲线的绘制

(1)取第2代的cPGCs细胞，(密度为1.0×10⁶个/mL)于24孔板中，置于37.5℃、5％CO₂培养箱培养；

(2)每2d抽取3个孔计数，每孔计3次数取平均值，持续11d；绘制生长曲线，横坐标为培养时间，纵坐标为细胞数，如图4所示。

最后应说明的是：以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换，但是凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。