一种检测猪肉组织中残留的头孢噻呋的高效液相色谱方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种检测猪肉组织中头孢噻呋残留的高效液相色谱方法，属于生物检测领域。
【背景技术】
[0002]头孢噻呋(ceft1fur)又名赛得福，是第1个动物专用的第3代头孢菌素类抗生素。1988年，FDA批准了头孢噻呋钠用于治疗牛呼吸道细菌性疾病，此时该药在美国首次上市。此后FDA又陆续批准了头孢噻呋钠、盐酸头孢噻呋及头孢噻呋晶体自由酸用于1日龄鸡、火鸡，猪、肉牛、奶牛、马、山羊及绵羊等的呼吸道疾病的治疗。加拿大、日本及欧洲一些国家也相继正式批准用于猪、肉牛、奶牛、羊的呼吸道疾病的治疗。头孢噻呋抗菌谱广，抗菌活性强，对革兰阳性菌、阴性菌及厌氧菌都有很强的抗菌活性，而且对胃酸和β内酰胺酶较稳定，过敏反应少，体内残留非常低，在世界范围内得到广泛应用。目前，国内有多家公司相继研制出头孢噻呋注射液，但制剂的溶剂体系均为植物油、大豆油等油性介质。华南农业大学联合洛阳惠中兽药有限公司在国内首先研制出水性头孢噻呋注射液，由于其溶剂体系为水性，流动性好，易于吸收，肌注时不容易堵塞针头，对动物的刺激性小，具有广阔的市场应用前景。
[0003]目前，在肉类组织中，对于头孢噻呋的检测方法有许多，液制连用(LC一MS)、气质连用(GC-MS)、ELISA等等。但是这些方法速度慢，容易受较多因素影响，准确率不高。
[0004]而高效液相色谱法分离效率高，选择性好，检测灵敏度高，操作自动化分析精确度高，应用范围广；不受试样的挥发性和热稳定性限制，应用范围广；流动相种类多，可通过流动相的优化达到高的分离效率，因此越来越被重视和采用。目前还没有针对头孢噻呋残留检测的高效液相色谱法的专利。
【发明内容】
[0005]为解决以上技术问题，本发明的目的之一在于提供一种检测猪肉组织中头孢噻呋残留的高效液相色谱分析方法。
[0006]本发明的目的之一是这样实现的:检测头孢噻呋残留的高效液相色谱分析仪，其关键在于色谱条件的设定和使用前柱子的清洗与活化。
[0007]本发明主要采用高效液相色谱分析法检测猪肉组织中的头孢噻呋的残留，采用高效液相分析法的技术主要有三个方面，第一，净化条件的选择，提取、衍生后的样液净化采用C18柱、SAX阴离子交换柱和SCX阳离子交换柱3种不同的固相萃取柱。C18柱主要去除中性杂质，SAX柱主要去除阳离子化合物，SCX柱主要去除阴离子化合物。本实验考察了 1根柱(C18柱)、2根柱(C18柱和SAX柱)和3根柱(C18柱、SAX柱和SCX柱)的净化效果，发现单独使用C18柱和使用C18与SAX柱的净化效果均不理想，样液中其它组分对测定有干扰。同时使用3根固相萃取柱，净化和富集效果较好。第二，流动相的选择，流动相采用乙腈-水(该体系均含0.1% TFA)或甲醇-水(含0.1% TFA)体系，发现乙腈-水体系优于甲醇_水体系。以乙臆_水(体积比10: 90)和乙臆_水(体积比90: 10)进行梯度洗脱，或以乙腈-水(体积比15: 85)等度洗脱，头孢噻呋衍生物(DCA)的分离效果都比较好，样液中的其他组分对测定无干扰。由于梯度洗脱进样前需要平衡，分析时间较长，故选择等度洗脱。流动相中乙腈比例增加，头孢噻呋衍生物(DCA)出峰提前，但分离度变差。第三，衍生化:头孢噻呋在动物体内主要以脱呋喃甲酸头孢噻呋(DFC)代谢物存在，DFC可与体内生物大分子(如血浆蛋白)结合。结合态的DFC不容易被水性溶液提取，因此要将结合态变成游离态。二硫赤藓糖醇可以把蛋白结合的DFC及母体药转化为DFC，游离的DFC与碘乙酰胺反应，生成具有紫外吸收的衍生物脱呋喃甲酸头孢噻呋乙酰胺(DCA)。
[0008]有益效果:本发明检测方法具有分辨率高、速度快、重复性高、自动化操作分析精确度高，在室温下就可进行检测等优点。
【附图说明】
[0009]图1头孢噻呋标准溶液。
[0010]图2空白肌肉HPLC色谱图。
[0011]图3空白肌肉添加1 μ g/g的HPLC色谱图。
[0012]图4连续给药后肌肉样品HPLC色谱图。
【具体实施方式】
[0013]1.溶液配制:
头孢噻呋储备液(100 mg/L):称取10.0 mg头孢噻呋标准品于100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，-20 °C保存，可使用6个月；
头孢噻呋中间液(5 mg/L):吸取250 μ L 100 mg/L头孢噻呋储备液至5 mL容量瓶中，用0.025 mol/L磷酸缓冲液(pH 7.0)定容，摇匀(现配现用);
0.025 mol/L磷酸缓冲液(pH 7,0):将3.4 g磷酸二氢钾溶于900 mL水中，用450 g/L氢氧化钾溶液调节pH值至710，用水定容至1 L ；
0.05 mol/L硼酸缓冲液:称取19 g硼酸钠和3.7 g氯化钾，用水定容到1 L ；
4g/L 二硫赤藓糖醇溶液:称取1.0 g 二硫赤藓糖醇，溶于250 mL 0.05 mol/L硼酸缓冲液中(现配现用)；
40 g/L碘乙酰胺溶液:称取2.0 g碘乙酰胺，溶于50 mL 0.025 mol/L磷酸缓冲液中(现配现用)。
[0014]2.色谱条件:C18柱(250 mm X416 mm, 5 μ m);流动相:乙腈-水-三氟乙酸(体积比15: 85: 011);流速:110 mL /min ;柱温:30 V ;紫外检测波长:266 nm ;进样量:25 μ L。
[0015]3.样品处理:
提取与衍生:称取110 g组织样品于50 mL离心管中，加入14 mL 4 g/L 二硫赤藓糖醇溶液，均质，然后放入恒温振荡水槽仪中37 °C保温20 min。加入3 mL 4%碘乙酰胺溶液，摇勻，室温下静置衍生30 min,离心10 min ( 4 °C,20 000 r /min),取出上清液于25 mL比色管中。残渣中加入6 mL01025 mol/L磷酸缓冲液，混匀，离心10 min (4 °C，20 000 r/min)，合并上清液，用25%磷酸溶液调节pH值至2.5?2.6，用水定容至25 mL。取出10.0mL 定容液，离心 15 min (4 °C, 20000 r /min)；
净化:将提取与衍生最后所得的上清液过C18固相萃取柱，保持流速1?2 mL /min,再依次用5mL磷酸缓冲液和3 mL 0.01 moL /L氢氧化钠溶液淋洗，用2 mL乙腈-水(体积比15: 85)洗脱并收集于含5 mL水的试管中，保持抽真空2 min。取出收集的试管，力口入5 mL水，摇匀，过SAX固相萃取柱，保持流速1?2 mL /min，用1 mL水润洗试管，加入柱中，用2.5 mL乙腈-体积分数为5%乙酸(体积比5: 95)洗脱并收集于另一含5 mL水的试管中，保持抽真空2 min。取出收集的试管，加入5mL水，摇匀，过SCX固相萃取柱，保持流速1?2 mL/min,用1 mL水润洗试，加入柱中，用2.5mL乙腈-0.1 mol/L氯化钠(体积比
5: 95)洗脱并收集，保持抽真空2 min。取出收集的试管，摇匀，供测定；
标准品处理:移取适量头孢噻呋中间液至50 mL离心管，加入14 mL 4 g/L 二硫赤藓糖醇溶液，然后放入恒温振荡水槽仪中37 °C保温20 min。加入3 mL 40 g/L碘乙酰胺溶液，摇匀，室温下静置衍生30 min，加入6 mL 0.025 mol/L磷酸缓冲液，用25% (体积分数)磷酸调节pH值至2.5?2.6，用水定容样液至25 mL。其余操作步骤同“净化”操作；
标准曲线制作:准确称取空白匀浆组织适量，添加100μ L头孢噻呋系列标准工作液，使得样品中头孢噻呋浓度分别为0.1,0.25,0.5、1、2.5、5、10μ g/g。按“净化”方法处理和测定，将去呋喃羰基头孢噻呋乙酰胺的色谱峰面积(A)与相对应的药物浓度(C)作线性回归，求得标准曲线方程和相关系数，共作3个批次；
检测限和定量限:准确称取适量空白匀浆组织，添加头孢噻呋系列标准工作液适量，配置成系列加标样品，按“净化组织样品前处理方法”处理样品，再按设定的色谱条件进行HPLC分析测定。以最低检出浓度计算，S/N彡3时的加标样品浓度为检测限，S/N彡10时的加标样品浓度为定量限。
[0016]回收率与精密度
本实验以猪肉作为样本，取适量标准品加入到1.0 g样品中，使添加量在猪肉中200、1000和2 000 μ g/kg，每个添加水平各取24份试样，按上述过程进行处理，加标平均回收率为90%?91%，相对标准偏差(RSD) 1.8%?3.5%，结果满意。
[0017]应用
取阳性样品猪肉按照样品处理和测定方法进行处理和测定，样品中其它组分对测定无干扰，据处理功能(间隔为0.5 nm)和Origin 7.5求积分功能，得到J = 5.2X 10 15cm3.L.mol 1 ;再由(2)式求出R。值。一般认为药物对BSA的荧光猝灭作用主要源于212位色氨酸残基。当c ( E): c (BSA) =1: 1 (相对分子质量以2 000计)时，E=1 -1F / I()F = 0.13,由(1)式求出 r 值,得 r = 2.15 nm。
【主权项】
1.一种检测猪肉组织中头孢噻呋的高效液相色谱法其特征由下列部分组成: Waters高效液相色谱系统，510泵体，2487紫外-可见光检测器，717自动进样器，配Empowerpro色谱软件，固相萃取装置(Supelco公司),C18固相萃取柱(500 mg, Varian公司)、SAX固相萃取柱(500 mg, Varian公司)、SCX固相萃取柱(100 mg, Varian公司)，试剂:头孢噻呋标准品、二硫赤藓糖醇、碘乙酰胺、三氟乙酸、乙腈、甲醇(色谱纯)其他试剂为分析纯。2.根据权利要求1所述一种检测猪肉组织中头孢噻呋的高效液相色谱法其特征在于C18固相萃取柱(500 mg, Varian公司)，使用前用4 mL甲醇和5 mL 01025 mol/L憐酸缓冲液淋洗活化；SAX固相萃取柱(500 mg, Varian公司)，使用前依次用2 mL甲醇、2 mL甲醇-Oil mol/L氯化钠(体积比25:75)和2 mL水淋洗活化；SCX固相萃取柱(100 mg,Varian公司)，使用前依次用1 mL甲醇、2 mL甲醇-011 moL /L氯化|丐(体积比25: 75)和4 mL水淋洗活化。3.根据权利要求2所述一种检测猪肉组织中头孢噻呋的高效液相色谱法其特征在于甲醇为色谱纯，他试剂为分析纯。4.根据权利要求1所述种检测猪肉组织中头孢噻呋的高效液相色谱法其特征在于按如下步骤 (1)溶液配制: 头孢噻呋储备液(100 mg/L)； 头孢噻呋中间液(5 mg/L)； .0.025 mol/L 磷酸缓冲液(pH 7,0)； .0.05 mol/L硼酸缓冲液； .4 g/L 二硫赤藓糖醇溶液； . 40 g/L碘乙酰胺溶液； (2)设定色谱条件:C18柱(250mm X416 mm, 5 μ m)；流动相:乙腈-水-三氟乙酸(体积比15: 85: 011);流速:110 mL /min;柱温30 °C;紫外检测波长:266 nm ;进样量:.25 μ L ； (3)样品处理: 提取与衍生、净化、标准品处理。
【专利摘要】本发明公开了一种检测猪肉组织中残留的头孢噻呋的高效液相色谱分析方法(HPLC)。采用高效液相色谱法测定牛、猪肌肉和肾脏中头孢噻呋相关残留量。样品经二硫赤藓糖醇溶液提取，酰胺衍生，固相萃取柱(C18、SAX和SCX)净化，8柱色谱分离，以乙腈-水(体积比15∶85)含0.1%三氟乙酸作流动相等梯度洗脱，6nm紫外检测。头孢噻呋残留量在0.016～1.28mg/L范围内与峰面积呈良好线性，关系数r>0.9999。样品添加浓度在200～8000μg/kg的回收率为90%～91%，对标准偏差为118%～315%。本方法的检出限(信噪比S/N=3)为50μg/kg。所述方法有以下步骤：1.器与试剂2.溶液配制3.样品处理4.标准品处理5.进行试验6.数据处理。
【IPC分类】G01N30/02
【公开号】CN105277631
【申请号】CN201410352139
【发明人】杜霞, 刘静, 洪霞
【申请人】江苏维赛科技生物发展有限公司
【公开日】2016年1月27日
【申请日】2014年7月23日