一种高硒真菌中硒形态测定的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种高砸真菌中砸形态的测定方法，属于分析测试领域。
【背景技术】
[0002]砸是人体必需的微量元素，是谷胱甘肽过氧化物酶的必需成分，砸有抗氧化的作用，与人体健康息息相关，砸具有抗癌、保护心脏、抗肝坏死、防治近视和白内障、解毒、提高免疫力、延缓衰老和增强生殖功能等多种药理作用。据不完全统计，世界上有40多个国家和地区缺砸，而我国有72%的地区属于缺砸地区，因此，寻找和开发富砸产品，以保证人体摄入充足的砸，正被各国科学工作者关注。
[0003]真菌，是一种真核生物。最常见的真菌是各类蕈类，另外真菌也包括霉菌和酵母，真菌的细胞有含甲壳素(又叫几丁质、甲壳素、壳多糖)为主要成分的细胞壁，和植物的细胞壁主要是由纤维素组成的不同。目前，酵母、食用菌等真菌已开始被应用于砸营养强化领域，市场上出现了许多富砸酵母、富砸食用菌等产品。研究表明，真菌对砸具有良好的富集效果，可被应用于尚砸营养强化，制成尚砸广品，应用于砸添加领域。
[0004]目前，关于样品中砸的测定主要分为总砸测定和形态测定，总砸测定用于评价反映样品中总的砸的含量，目前已有较为完善可靠的科学测定方法。而关于砸形态测定方法，则研究的较少，而且砸在不同样品中的结合形式不同，有的以蛋白结合态为主，有的则与多糖类结合，这样就导致不同样品的砸提取释放方法不一，因而很难形成针对所有样品的统一的处理测定方法。“富砸植物材料中砸形态的测定方法”(专利申请号:201110428248.4)、“富砸食用菌中砸形态的测定方法”(专利申请号:201110428249.9)等专利介绍了植物样品和食用菌子实体中砸形态的处理测定方法，这些方法采用对样品加入缓冲液或超声破壁或酶法破壁，然后利用蛋白酶K和XIV进行酶解，将样品中各组分的砸温和的释放出来，然后利用高效液相色谱与原子荧光光谱法联用(HPLC-HG-AFS)上机测定砸形态；“富砸大米中有机砸、蛋白砸、多糖砸或RNA砸含量测定方法”(专利申请号:201310135560.3)则将大米的各组分分别进行提取，然后利用氢化物原子荧光法(AFS)测总砸的方法确定各组分的砸含量；“微波消解-1CP-MS法直接测定海产品中有机砸、蛋白砸或多糖砸的测定方法”(专利号:ZL201210458397.1)则采用对样品进行提取分离，将含砸的各组分分离后，然后利用ICP-MS上机测定各组分总砸含量，从而确定样品中的砸不同结合组分的含量；“一种富砸酵母中砸蛋氨酸的测定方法”(专利申请号:201110177717.X)首先将富砸酵母利用物理方法进行破壁处理，然后利用酶及其他化学试剂对酵母中的砸蛋氨酸进行分离提取，然后利用HPLC-FLD法测定富砸酵母中砸蛋氨酸的含量；“一种砸的测定方法”(专利申请号:201310658482.5)介绍了利用HPLC-HG-AFS测定砸形态的方法，该方法通过测定样品中的总砸与无机砸含量，然后利用差减法得到样品有机砸的含量。该方法仅简单的利用总砸与无机砸的差值确定为有机砸含量，不仅结果不精确，而且也无法确定具体的有机砸为何种形式的砸；“植物砸形态的测定方法”(专利申请号:201210215457.5)则首先将样品利用酶进行酶解，然后利用HPLC-1CP-MS上机测定各砸形态的含量；“从富砸酵母中提取含砸蛋白的方法”(专利申请号:201110440135.6)则介绍了一种利用pH值11~14的碱溶液对富砸酵母中含砸蛋白的提取的方法，但该法利用的强碱类溶液会对砸形态造成破坏，不利于砸形态的测定。上述这些形态测定方法主要针对植物或水样等易水解样品，但利用这些方法对高砸真菌类样品测定时，其提取率与检出率均比较低，而且由于砸胁迫作用的存在，导致高砸真菌类样品的细胞壁变厚，再加上细胞壁结构与植物细胞壁的不同，故植物类样品的砸形态测定方法不适用于高砸真菌类形态检出。
【发明内容】
[0005]本发明的目的就是要提供一种高砸真菌中砸形态的测定方法，旨在解决利用传统测形态方法过程中砸的提取率不高的问题。
[0006]本发明提供的高砸真菌中砸形态测定的方法，包含以下步骤:
(1)样品破壁处理:称取高砸真菌样品，加入弱碱性溶液进行破壁处理，离心以去除碱溶液，并对沉淀部分进行透析处理，去除样品残留的碱溶液；
(2)样品球磨:称取步骤(1)经过弱碱性溶液破壁处理后的高砸真菌，加入缓冲液进行球磨处理；
(3)样品酶解:取步骤(2)球磨后的混合液，调节pH值至1.5-2.5，加入胃蛋白酶，进行酶解；
(4)样品分离后再酶解:将步骤(3)酶解后得到的混合物，离心分离，取离心后的上清液过0.22 μ m水系膜待测，将离心后的沉淀部分继续加入缓冲液，调节pH值至7.0-8.0，加入胰蛋白酶，进行酶解；
(5)样品分离:将步骤(4)酶解后得到的混合物，进行离心分离，取离心后的上清液过0.22 μ m水系膜待测；
(6)上机测定:对上述两步骤中过膜后的酶解液采用高效液相色谱法与氢化物发生-原子荧光光谱法联用上机测定样品中的砸形态(包括:四价砸(Se4+)、六价砸(Se6+)、砸代胱氨酸(SeCys2)、砸代蛋氨酸(SeMet)、砸甲基砸代胱氨酸(SeMeCys ))。
[0007]优选地，步骤(1)所述弱碱性溶液为氢氧化钠水溶液或氢氧化钾水溶液，其浓度为0.01 ?0.05 mol/Lo
[0008]优选地，步骤(1)所述高砸真菌样品与所述弱碱性溶液的质量比为1:5?1:10。
[0009]优选地，步骤(1)中破壁处理的时间为10-20 min。
[0010]优选地，步骤(2)所述样品球磨时的缓冲液为pH值为7.5的0.05mol/L的PBS缓冲液或Tir-HCl缓冲液，所述经过碱破壁处理后的高砸真菌与所述缓冲液的质量比1:20?1:50ο
[0011]优选地，步骤(2 )的球磨时间为2-4小时。
[0012]优选地，步骤(3)中胃蛋白酶与步骤(2)球磨后的混合液的体积质量比为20~50mg: 5-10 mL，37°C恒温培养 18~24 h。
[0013]优选地，步骤(4)中缓冲液与步骤(2)球磨后的混合液的质量体积比为5~10 mL:5mL，胰蛋白酶与步骤(2)球磨后的混合液的体积质量比为20~50 mg: 5-10 mL，37°C恒温酶解18?24 ho
[0014]本发明中高砸真菌是指经过液体深层富砸发酵培养得到的高砸真菌菌丝体，总砸含量在100 mg/kg (鲜重)以上。优选为高砸酵母菌、高砸灵芝或高砸毛头鬼伞。
[0015]相对于现有技术的方案，本发明的优点在于:
(1)经过弱碱性溶液的破壁与球磨处理后，样品的细胞壁被完全打开，有助于细胞内蛋白的释放，利于后续的酶解过程；
(2)酶解时离心管采用水平放置的方式，加大了比表面积，有助于酶促反应的发生；
(3)本发明中酶促反应采用不同的酶对样品进行分步连续提取，排除不同酶之间的相互干扰，同时也将酶解后的酶解液与反应体系分离开，保证了酶解后样品中各游离形态砸的稳定性，同时也有利于下一步的酶促反应。
[0016](4)采用本发明对高砸真菌样品进行测定，提取率达到50-80%，而采用传统的植物样品形态测定方法，直接利用蛋白酶K与蛋白酶XIV对样品进行酶解处理，其提取率不到20%，本发明在此基础上，将提取率提高了近4倍。
[0017](5)本发明中各步骤反应条件温和，实验采用的弱碱、球磨处理等前处理过程、以及酶解等步骤均不会改变样品体内的砸形态，不会导致砸形态变化，更能真实的反映样品内砸形态的分布。
【具体实施方式】
[0018]下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
[0019]实施例1:尚砸灵芝样品砸形态测定实施例选用的高砸灵芝菌丝体总砸含量为209.8 mg/kg (ffff)o
[0020](1)高砸灵芝样品的预处理:对液体深层富砸发酵培养得到的高砸灵芝样品利用
18.2ΜΩ超纯水进行清洗，去除表面残留的无机砸；
(2)样品破壁处理:称取10g灵芝鲜样，加入50mL的0.01mol/L氢氧化钠溶液，置于磁力搅拌器上搅拌20min。然后以5000 rpm的转速离心15min，去除碱溶液，取沉淀部分放入透析袋内用超纯水进行透析处理，去除样品残留的氢氧化钠；
(3)样品球磨:称取lg上述经过碱破壁处理的样品，加入50mlpH值为7.5的Tris-HCl缓冲液进行球磨处理，球磨频率为30Hz，球磨时间为2h ；
(4)样品酶解:取上述球磨后的样品5ml于15ml离心管中，调节pH值至1.5-2.5，加入20 mg胃蛋白酶，然后将离心管水平放置于37°C恒温振荡摇床中培养18-24h。
[0021](5)样品分离后再酶解:将上述酶解后的样品于冷冻高速离心机中进行离心分离，转速为10000 rpm,离心时间15_30min，取离心后的上清液过0.22 μ m水系膜待测，将离心后的沉淀部分继续加入5ml缓冲液，调节pH值至7.0-8.0，加入20 mg胰蛋白酶，然后将离心管水平放置于37°C恒温振荡摇床中培养18-24h。
[0022](6)样品分离:将上述酶解后的样品于冷冻高速离心机中进行离心分离，转速为10000 rpm，离心时间15_30min，取离心后的上清液过0.22 μ m水系膜待测。
[0023](7)上机测定:对上述两步骤中过膜后的酶解液采用高效液相色谱法与氢化物发生-原子荧光光谱法(HPLC-HG-AFS)联用上机测定样品中的砸形态。
[0024]实施效果:
经过形态分析测定，灵芝样品中形态以砸代甲硫氨酸(SeMet)和砸代半胱氨酸(SeCys)为主，形态提取率达到60%。
[0025]实施例2:尚砸灵芝样品砸形态测定实施例选用的高砸灵芝菌丝体总砸含量为209.8 mg/kg (ffff)o
[0026](1)高砸灵芝样品的预处理:对液体深层发酵培养得到的高砸灵芝样品利用18.2ΜΩ超纯水进行清洗，去除表面残留的无机砸；
(2)样品破壁处理:称取10g灵芝鲜样，加入100ml的0.05mol/L氢氧化钠溶液，置于磁力搅拌器上搅拌20min。然后以5000 rpm的转速离心15min，去除碱溶液，取沉淀部分放入透析袋内用超纯水进行透析处理，去除样品残留的氢氧化钠；
(3)样品球磨:称取2g上述经过碱破壁处理的样品，加入40mlpH值为7.5的PBS缓冲液进行球磨处理，球磨频率为30Hz，球磨时间为2h ;
(4)样品酶解:取上述球磨后的样品5ml于15ml离心管中，调节pH值至1.5-2.5，加入50 mg胃蛋白酶，然后