将离心管水平放置于37°C恒温振荡摇床中培养18-24h。
[0027](5)样品分离后再酶解:将上述酶解后的样品于冷冻高速离心机中进行离心分离，转速为10000 rpm,离心时间15_30min，取离心后的上清液过0.22 μ m水系膜待测，将离心后的沉淀部分继续加入5ml缓冲液，调节pH值至7.0-8.0，加入50 mg胰蛋白酶，然后将离心管水平放置于37°C恒温振荡摇床中培养18-24h。
[0028](6)样品分离:将上述酶解后的样品于冷冻高速离心机中进行离心分离，转速为10000 rpm，离心时间15_30min，取离心后的上清液过0.22 μ m水系膜待测。
[0029](7)上机测定:对上述两步骤中过膜后的酶解液采用高效液相色谱法与氢化物发生-原子荧光光谱法(HPLC-HG-AFS)联用上机测定样品中的砸形态。
[0030]实施效果:
经过形态分析测定，灵芝样品中形态以砸代甲硫氨酸(SeMet)和砸代半胱氨酸(SeCys)为主，形态提取率达到72%。
[0031]实施例3:高砸酵母样品砸形态测定实施例选用的高砸酵母总砸含量为2000 mg/kg (Dff)o
[0032](1)样品破壁处理:称取10g酵母干粉，加入100 ml的0.01mol/L氢氧化钠溶液，置于磁力搅拌器上搅拌20min。然后以5000 rpm的转速离心15min，去除碱溶液，取沉淀部分放入透析袋内用超纯水进行透析处理，去除样品残留的氢氧化钠；
(2)样品球磨:称取lg上述经过碱破壁处理的样品，加入50mlpH值为7.5的PBS缓冲液进行球磨处理，球磨频率为30Hz，球磨时间为4h ;
(3)样品酶解:取上述球磨后的样品5ml于15ml离心管中，调节pH值至1.5-2.5，加入45 mg胃蛋白酶，然后将离心管水平放置于37°C恒温振荡摇床中培养18_24h。
[0033](4)样品分离后再酶解:将上述酶解后的样品于冷冻高速离心机中进行离心分离，转速为10000 rpm,离心时间15_30min，取离心后的上清液过0.22 μ m水系膜待测，将离心后的沉淀部分继续加入5ml缓冲液，调节pH值至7.0-8.0，加入45 mg胰蛋白酶，然后将离心管水平放置于37°C恒温振荡摇床中培养18-24h。
[0034](5)样品分离:将上述酶解后的样品于冷冻高速离心机中进行离心分离，转速为10000 rpm，离心时间15_30min，取离心后的上清液过0.22 μ m水系膜待测。
[0035](6)上机测定:对上述两步骤中过膜后的酶解液采用高效液相色谱法与氢化物发生-原子荧光光谱法(HPLC-HG-AFS)联用上机测定样品中的砸形态。
[0036]实施效果:
经过形态分析测定，灵芝样品中形态以砸代甲硫氨酸(SeMet)为主，占总砸的60%，形态提取率达到80%。
[0037]实施例4:高砸刺芹侧耳样品砸形态测定实施例选用的高砸刺芹侧耳菌丝体总砸含量为100 mg/kg (ffff)o
[0038](1)高砸灵芝样品的预处理:对液体深层发酵培养得到的高砸刺芹侧耳样品利用
18.2ΜΩ超纯水进行清洗，去除表面残留的无机砸；
(2)样品破壁处理:称取10g刺芹侧耳菌丝体鲜样，加入80ml的0.05mol/L氢氧化钠溶液，置于磁力搅拌器上搅拌20min。然后以5000 rpm的转速离心15min，去除碱溶液，取沉淀部分放入透析袋内用超纯水进行透析处理，去除样品残留的氢氧化钠；
(3)样品球磨:称取2g上述经过碱破壁处理的样品，加入60mlpH值为7.5的Tris-HCl缓冲液进行球磨处理，球磨频率为30Hz，球磨时间为3h ；
(4)样品酶解:取上述球磨后的样品5ml于15ml离心管中，调节pH值至1.5-2.5，加入50 mg胃蛋白酶，然后将离心管水平放置于37°C恒温振荡摇床中培养18-24h。
[0039](5)样品分离后再酶解:将上述酶解后的样品于冷冻高速离心机中进行离心分离，转速为10000 rpm,离心时间15_30min，取离心后的上清液过0.22 μ m水系膜待测，将离心后的沉淀部分继续加入5ml缓冲液，调节pH值至7.0-8.0，加入50 mg胰蛋白酶，然后将离心管水平放置于37°C恒温振荡摇床中培养18-24h。
[0040](6)样品分离:将上述酶解后的样品于冷冻高速离心机中进行离心分离，转速为10000 rpm，离心时间15_30min，取离心后的上清液过0.22 μ m水系膜待测。
[0041](7)上机测定:对上述两步骤中过膜后的酶解液采用高效液相色谱法与氢化物发生-原子荧光光谱法(HPLC-HG-AFS)联用上机测定样品中的砸形态。
[0042]实施效果:
经过形态分析测定，刺芹侧耳样品中形态以砸代甲硫氨酸(SeMet)和砸代半胱氨酸(SeCys)为主，形态提取率达到50%。
[0043]实施例5:尚砸毛头鬼伞样品砸形态测定实施例
选用的高砸毛头鬼伞菌丝体总砸含量为159.4 mg/kg (ffff)o
[0044](1)高砸毛头鬼伞样品的预处理:对液体深层发酵培养得到的高砸毛头鬼伞菌丝体用18.2 ΜΩ超纯水进行清洗，去除表面残留的无机砸；
(2)样品破壁处理:称取5g毛头鬼伞鲜样，加入50ml的0.02mol/L氢氧化钠溶液，置于磁力搅拌器上搅拌20min。然后以5000 rpm的转速离心15min，去除碱溶液，取沉淀部分放入透析袋内用超纯水进行透析处理，去除样品残留的氢氧化钠；
(3)样品球磨:称取2g上述经过碱破壁处理的样品，加入50mlpH值为7.5的Tris-HCl缓冲液进行球磨处理，球磨频率为30Hz，球磨时间为4h ；
(4)样品酶解:取上述球磨后的样品5ml于15ml离心管中，调节pH值至1.5-2.5，加入40 mg胃蛋白酶，然后将离心管水平放置于37°C恒温振荡摇床中培养18-24h。
[0045](5)样品分离后再酶解:将上述酶解后的样品于冷冻高速离心机中进行离心分离，转速为10000 rpm,离心时间15_30min，取离心后的上清液过0.22 μ m水系膜待测，将离心后的沉淀部分继续加入5ml缓冲液，调节pH值至7.0-8.0，加入40 mg胰蛋白酶，然后将离心管水平放置于37°C恒温振荡摇床中培养18-24h。
[0046](6)样品分离:将上述酶解后的样品于冷冻高速离心机中进行离心分离，转速为10000 rpm，离心时间15_30min，取离心后的上清液过0.22 μ m水系膜待测。
[0047](7)上机测定:对上述两步骤中过膜后的酶解液采用高效液相色谱法与氢化物发生-原子荧光光谱法(HPLC-HG-AFS)联用上机测定样品中的砸形态。
[0048]实施效果:
经过形态分析测定，毛头鬼伞样品中砸形态以砸代甲硫氨酸(SeMet)为主，占总砸比例的80%，形态提取率达到76%。
[0049]以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
【主权项】
1.一种高硒真菌中硒形态测定的方法，其特征在于包含以下步骤:(1)样品破壁处理:称取高硒真菌样品，加入弱碱性溶液进行破壁处理，离心以去除碱溶液，并对沉淀部分进行透析处理，去除样品残留的碱溶液；(2)样品球磨:称取步骤(1)经过弱碱性溶液破壁处理后的高硒真菌，加入缓冲液进行球磨处理；(3)样品酶解:取步骤(2)球磨后的混合液，调节pH值至1.5-2.5,加入胃蛋白酶，进行酶解；(4)样品分离后再酶解:将步骤(3)酶解后得到的混合物，离心分离，取离心后的上清液过0.22 μ m水系膜待测，将离心后的沉淀部分继续加入缓冲液，调节pH值至7.0-8.0,加入胰蛋白酶，进行酶解；(5)样品分离:将步骤(4)酶解后得到的混合物，进行离心分离，取离心后的上清液过0.22 μ m水系膜待测；(6)上机测定:对上述两步骤中过膜后的酶解液采用高效液相色谱法与氢化物发生-原子荧光光谱法联用上机测定样品中的硒形态。2.根据权利要求1所述的高硒真菌中硒形态测定的方法，其特征在于，步骤(1)所述弱碱性溶液为氢氧化钠水溶液或氢氧化钾水溶液，其浓度为〇.01?〇.05 mol/L。3.根据权利要求2所述的高硒真菌中硒形态测定的方法，其特征在于，步骤(1)所述高硒真菌样品与所述弱碱性溶液的质量比为1:5?1:10。4.根据权利要求2所述的高硒真菌中硒形态测定的方法，其特征在于，步骤(1)中破壁处理的时间为10-20 min。5.根据权利要求1所述的高硒真菌中硒形态测定的方法，其特征在于，步骤(2)所述样品球磨时的缓冲液为pH值为7.5的0.05mol/L的PBS缓冲液或Tir-HCl缓冲液，所述经过碱破壁处理后的高硒真菌与所述缓冲液的质量比1:20?1:50。6.根据权利要求1所述的高硒真菌中硒形态测定的方法，其特征在于，步骤(2)的球磨时间为2-4小时。7.根据权利要求所述的高硒真菌中硒形态测定的方法，其特征在于，步骤(3)中胃蛋白酶与步骤(2)球磨后的混合液的体积质量比为20~50 mg: 5~10 mL，37°C恒温培养18~24h〇8.根据权利要求所述的高硒真菌中硒形态测定的方法，其特征在于，步骤(4)中缓冲液与步骤(2)球磨后的混合液的质量体积比为5~10 mL: 5 mL，胰蛋白酶与步骤(2)球磨后的混合液的体积质量比为20~50 mg: 5~10 mL，37°C恒温酶解18~24 h。9.根据权利要求1所述的高硒真菌中硒形态测定的方法，其特征在于，所述高硒真菌是指经过液体深层富硒发酵培养得到的高硒真菌菌丝体，总硒含量在100 mg/kg (鲜重)以上。10.根据权利要求1所述的高硒真菌中硒形态测定的方法，其特征在于，所述高硒真菌为高硒酵母菌、高硒灵芝或高硒毛头鬼伞。
【专利摘要】本发明公开了一种高硒真菌中硒形态测定的方法。通过对高硒样品进行弱碱破壁处理与球磨后，利用处理过的样品，采用分步连续提取的方式进行酶解，然后将各步酶促反应得到的酶解液过膜后利用HPLC-HG-AFS上机测定硒形态。采用本法对高硒真菌类样品测定硒形态，其提取率可高达50～80%，且样品本身的硒形态稳定，反应过程中不会出现硒形态的变化。
【IPC分类】G01N30/02, G01N30/06
【公开号】CN105277636
【申请号】CN201510656845
【发明人】尹雪斌, 袁林喜, 侯遇珠
【申请人】中国科学技术大学苏州研究院
【公开日】2016年1月27日
【申请日】2015年10月12日