一种炔诺酮衍生物及其中间体的杂质检测分析方法【
技术领域：
】[0001]本发明涉及一种酱体化合物的杂质分析方法，特别是涉及一种快诺丽衍生物及其中间体的杂质检测分析方法。【
背景技术：
】[0002]快诺丽类药物为一类孕激素，可W用来治疗经前综合症、痛经、经期出血量过多、经期不正常、更年期综合症，也常用来作为口服短效避孕药。快诺丽是首个可W合成的口服高效孕激素，其醋化衍生物具有同样的药理作用，而且延长了作用的时间。常见的快诺丽醋化衍生物有醋酸快诺丽、己酸快诺丽、庚酸快诺丽，辛酸快诺丽等，其中庚酸快诺丽与戊酸雌二醇复方注射液作为长效避孕药可W持续避孕1个月，是一种非常理想的避孕制剂。作为复方庚酸快诺丽注射液主要成分的庚酸快诺丽，其杂质检测方法各国药典均没有收载，且文献报告极少。[0003]现有技术中关注点多为庚酸快诺丽的制剂含量检测方法，或者使用液质联用检测方法检测快基类酱体化合物，诸如：文献"薄层扫描测定复方快诺丽庚酸醋注射液中快诺丽庚酸醋的薄层层析条件探讨"，金宜効，《中国现代应用药学》，1988，3:004,公开了用薄层扫描测定复方快诺丽庚酸醋注射液中主药和两个辅料的方法。[0004]文献"HPLCAnalysisofInjectableContraceptivePreparationContainingNorethisteroneEnanthateandEstradiolValerate'，，Journalofliquidc虹omatography,1990，13(17):3473-3479,公开了一种复方庚酸快诺丽注射液的高效液相色谱分析方法，方法为；色谱柱；2Z化baX-Cgcolumn(250X46mmI.化）；检测波长：222nm;柱温；15°C;流动相；甲醇；水=85;1。此方法主要用来分析复方庚酸快诺丽注射液中庚酸快诺丽与戊酸雌二醇的含量。[0005][0006]众所周知，药物杂质对用药安全影响非常大，药物副作用在很大比例上都来自杂质的问题。药物杂质来源一般包括药物制备工艺中的中间体、副产物W及降解产物。现有公开文献中研究对象多为庚酸快诺丽的制剂含量检测方法，或者使用液质联用检测方法检测快基类酱体化合物，对于实际原料药生产过程中潜在的杂质，如中间体、降解产物等均没有涉及，也没有相关的杂质分析方法可W同时适用于快诺丽衍生物产品和合成该类产品所涉及到的中间体的杂质检测。【
发明内容】[0007]针对上述现有技术存在的不足和缺点，本发明所要解决的技术问题是提供一种快诺丽衍生物及其中间体的HPLC杂质分析方法。该方法研究参照并符合《中国药典》2010版二部附录VD对高效液相色谱法的规定。[0008]具体说来，发明人提供如下的技术方案：一种快诺丽衍生物及其中间体的杂质检测分析方法，包括：(OHPLC色谱分析主要参数：a、色谱柱选用十八烷基娃焼键合硅胶为填充剂的色谱柱；K流动相梯度洗脱，其中；流动相的组成为水、甲醇和己腊，0~25min，按体积百分比，流动相水：甲醇：己腊=45%~20%:0%~35%:30%~73%，水+己醇+己腊=100〇/〇;C、检测波长为230~254nm;(2)检测方法：取测试样品快诺丽衍生物或其中间体适量，精密称定甲醇溶解并稀释成一定浓度的样品溶液，摇匀，进样，在适当流速和柱温下进行高效液相色谱分析，记录色谱图。[0009]作为优选，所述的快诺丽衍生物选自符合式I结构的化合物，所述的中间体选自符合式II结构的化合物，其中，R为-COCH3,-C0(CH2)4CH3,-C0(CH2)5CH3,-C0(CH2)eCH3;其中R'为-Η,-CH2OH。[0010]作为优选，所述的步骤（2)中流速为1~2ml/min。更优选1.5ml/min。[0011]作为优选，所述的步骤（2)中柱温为20~4(TC。更优选3(TC。[001引作为优选，所述的样品溶液的浓度为0.5~2mg/ml。更优选Img/ml。[0013]作为优选，所述的进样中的进样量为?Τ20μL。更优选10μL。[0014]作为优选，所述的流动相梯度洗脱之后，进行第二梯度洗脱；25~50min，水、甲醇和己腊组成流动相，梯度洗脱的体积百分比为：流动相水：甲醇：己腊=40%~0%:35%~0〇/〇:30%~100%，水+甲醇+己腊=100〇/〇。[0015]更优选的是，所述的第二梯度洗脱之后，进行第Η梯度洗脱；50~60min，水、甲醇和己腊组成流动相，梯度洗脱的体积百分比为：流动相水：甲醇：己腊=0%~40%:0%:100%~60%，水+甲醇+己腊=100〇/〇。[0016]本发明还提供该了一种庚酸快诺丽及其中间体的HPLC杂质检测分析方法：a、色谱柱选用十八烷基娃焼键合硅胶为填充剂的色谱柱；K流动相梯度洗脱，其中；流动相的组成为水、甲醇和己腊，0~25min，按体积百分比，流动相水：甲醇：己腊=45%~20%:0%~35%:30%~73%，水+甲醇+己腊=100〇/〇;C、检测波长为230-254nm;t取庚酸快诺丽或其中间体1适量，精密称定甲醇溶解并稀释成浓度为0.5-2mg/ml的样品溶液，摇匀，进样10μL在l-2ml/min的流速和25-4(TC的柱温下进行高效液相色谱分析，记录色谱图，所述的中间体为符合式?结构的化合物，其中R'为-Η，-邸2地。[0017]作为优选，在所述流动相梯度洗脱之后，进行第二梯度洗脱；25~50min，水、甲醇、己腊Η相流动相梯度洗脱的体积百分比为：流动相水：甲醇：己腊=40%~0%:35%~0〇/〇:30%~100%，水+甲醇+己腊=100〇/〇;作为更优选，在所述第二梯度洗脱之后，进行第Η梯度洗脱；50~60min，水、甲醇、己腊Η相流动相梯度洗脱的体积百分比为：流动相水：甲醇：己腊=0%~40%:0%:100%~60%，水+甲醇+己腊=100%。[001引本发明中，作为优选的检测波长为240皿。[0019]本发明的杂质检测分析方法，仅第一梯度的洗脱方法就能够实现主成分与杂质有效分离，检测时间短，可大大提高检测效率。[0020]本发明的杂质检测分析方法，第一梯度和第二梯度的洗脱方法能够实现主成分与杂质有效分离，较快速准确得到样品中主要杂质及杂质总量结果，同时可W更有效地监控样品储存过程中出现单个杂质增大的情况。[0021]本发明的杂质检测分析方法，Η个梯度的洗脱方法，能够实现主成分和可能存在的所有杂质的有效分离。[0022]在实际应用中因需求不同而对杂质的关注程度不同，一般药典方法对主要杂质及杂质总量有要求，而对单个小杂质并不要求准确定量，而在进一步提高产品质量的研发或生产过程中会对单个小杂质有不同的要求，因此本发明包含了上述Η种不同的梯度体系。[0023]W庚酸快诺丽及其中间体为例，发明人对本发明方法的精密性和有效性做了验证。[0024]一种庚酸快诺丽及其中间体的HPLC杂质检测分析方法：a、色谱柱选用十八烷基娃焼键合硅胶为填充剂的色谱柱；K流动相中A为水、B为甲醇、C为己腊，流动相梯度洗脱，0~25min，按体积百分比，流动相A:B:C=45%~20%:0%~35%:30%~73%，A+B+C=100〇/〇;C、检测波长为240nm;t取庚酸快诺丽或其中间体1;适量，精密称定甲醇溶解并稀释成浓度为Img/ml的样品溶液，摇匀，进样10μL在1.5ml/min的流速和3(TC的柱温下进行高效液相色谱分析，记录色谱图，所述的中间体为符合式?结构的化合物，其中R'为-Η，-邸2地。[0025]上述的庚酸快诺丽及其中间体的HPLC杂质检测分析方法，在所述梯度洗脱之后，进行第二梯度洗脱：25~50min，水、甲醇、己腊Η相流动相梯度洗脱的体积百分比为：流动相A:B:C=40%~0%:35%~0%:30%~100%，A+B+C=100〇/〇;上述的庚酸快诺丽及其中间体的HPLC杂质检测分析方法，在所述第二梯度洗脱之后，进行第Η梯度洗脱；50~60min，水、甲醇、己腊Η相流动相梯度洗脱的体积百分比为：流动相A:Β:C=0%~40%:0%:100%~60%，A+B+C=100〇/〇。[0026]按表1程序梯度洗脱的方法对上述的庚酸快诺丽及其中间体的HPLC杂质检测分析方法进行全面验证。[0027]表1验证项目包括专属性、系统适用性与精密度、准确度、线性、重复性、检测限、定量限、耐用性等项目。验证结果，在专属性试验中，空白溶剂对样品检测无干扰，杂质己帰酸快诺丽、辛酸快诺丽、己酸快诺丽、醋酸快诺丽、快诺丽及各相邻杂质与庚酸快诺丽之间的分离度大于1.5;系统适用性与精密度试验中各个杂质量的相对标准偏差（RSD)均小于2.0%;线性试验中，庚酸快诺丽、己帰酸快诺丽、辛酸快诺丽、己酸快诺丽、醋酸快诺丽、快诺丽在相应的测试浓度范围内相关系数均大于0.999;方法重复性实验中己帰酸快诺丽、己酸快诺丽、辛酸快诺丽、单个未知杂质的RSD均小于10.0%，杂质总量的RSD小于5.0%，中间精密度试验结果良好；方法准确度试验结果表明，其相关杂质的回收率均在90%~110%的范围内；同时通过耐用性试验结果表明色谱条件的微小变化不会影响测定结果的准确性。结果均符合中国药典2010版相关规定，证明该方法精密、有效。[0028]由于快诺丽衍生物结构上只在醋键碳链长短及双键位置有区别，主要合成路线基本一致，可能存在杂质情况类似，所W本发明的分析方法同时可W作为快诺丽衍生物及其中间体的杂质分析，所述的快诺丽衍生物为庚酸快诺丽、辛酸快诺丽、醋酸快诺丽、己酸快诺丽，所述的中间体为19-去甲基孕酱-4-帰-3,17-二丽、19-居基孕酱-4-帰-3,17-二丽。[0029]与现有技术相比，本发明具有W下优点：1、本发明使用普通四元泉高效液相色谱仪即可，对设备无特殊要求。[0030]2、本发明流动相所选择的介质甲醇、己腊、水为最常用的高效液相流动相，简单易得。[0031]3、本发明操作过程简单，对环境如温度、湿度等无特殊要求。[0032]4、本发明包含Η种不同的梯度体系，仅第一梯度的洗脱方法能够实现主成分与杂质有效分离，检测时间短，大大提高检测效率；第一梯度和第二梯度的洗脱方法能够实现主成分与杂质有效分离，较快速准确得到样品中主要杂质及杂质总量结果，同时可W更有效地监控样品储存过程中出现单个杂质增大的情况；Η个梯度的洗脱方法，能够实现主成分和可能存在的所有杂质的有效分离。Η种不同的梯度体系，可W满足研发或生产过程中不同的检测分析需求。[0033]5、本发明适用性好，可W广泛用于快诺丽衍生物的杂质分析，尤其适用于庚酸快诺丽的杂质分析，同时可用于快诺丽衍生物中间体的杂当前第1页1 2