专利名称：炔诺酮elisa检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及检测炔诺酮残留量的试剂盒，特别是检测动 物组织、饲料中炔诺酮残留量的酶联免疫试检测(ELISA)试剂盒，ELISA(Enzyme Linked Immunosorbnent Assay)是酶联免疫吸附剂测定的简称，它是继免疫荧光和放射免疫技术 之后发展起来的一种酶免技术。( 二)背景技术炔诺酮(Norethindrone)属于留类同化激素，被大量用于促进反 刍动物的生长。但由于炔诺酮存在明显的致癌性，欧美等国家已相继禁止或严格禁止使用。 我国农业部公告第235号文规定，动物源性食品中炔诺酮的残留限量为不得检出。因此，检 测炔诺酮在动物性食品中的残留量非常重要。目前，常用于炔诺酮残留检测的方法主要有气相色谱。由于气相色谱(GC)分析法 样本前处理及测定操作繁琐且费用高，使推广应用受到限制。(三)实用新型内容本实用新型所要解决的问题是提供一种小巧轻便的炔诺酮 残留量检测试剂盒，其操作简便，检测快速、准确、灵敏度高，成本低，稳定性好，需要的技术 含量不高，可进行一次连续多个样品中炔诺酮残留量的测定，减少了检测样本所需要的时 间。本实用新型的技术方案是一种炔诺酮ELISA检测试剂盒，包括盒体和盒内的一 块96孔的酶标板、一张盖板膜、14瓶试剂和放试剂的下凹瓶位、一个自封袋、一份说明书和 一份质检报告，其特征在于酶标板采用96孔试剂板作为固相载体，在试剂盒微孔条上预 包被炔诺酮偶联抗原制成的检测板，14瓶试剂分别7瓶标准品溶液、酶标二抗、抗体工作 液、显色液A液、显色液B液、终止液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液，下凹瓶位共15个。酶标板由外框支撑架及放置其上的可拆的12条酶标反应微孔条组成，每个可拆 装酶标反应微孔条有8个反应孔，放入真空铝箔袋中，盒体为硬纸盒，下凹瓶位由塑料泡沫 制成，以塑料硬膜为盖板膜，盖板膜大小与酶标板横切面大小一致，将14瓶试剂用不同大 小、不同颜色的塑料瓶和玻璃瓶盛装并固定在下凹瓶位中与酶标板、盖板膜、自封袋、说明 书、质控报告一同封装在硬纸盒内，以便于携带和运输。14瓶试剂分别为7瓶Iml梯度浓 度的标准品溶液、12ml酶标二抗、7ml炔诺酮抗体工作液、7ml显色液A液、7ml显色液B液、 7ml终止液、40ml浓缩洗涤液、50ml浓缩复溶液。每一个试剂盒中的试剂足够进行96次测 定(包括标准分析孔)，既可进行一次连续多个样品的检测，也可以将板孔拆开多次检测。 将剩下的放回铝箔袋中用自封袋密封，这样可以保证试剂盒检测结果的准确性。检测时，样 本中的炔诺酮将和酶标板微孔条上预包被的炔诺酮偶联抗原竞争抗炔诺酮抗体，加入酶标 二抗后，用TMB底物显色，样本吸光度值与样本中所含炔诺酮的残留量成负相关，与标准曲 线比较再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样品中炔诺酮残留量，其操作简便易行。经实验表明本试剂盒具有很高的灵敏度组织样本的最低检测限为2 μ g/kg、饲 料样本的最低检测限为50μ g/kg ；组织样本的回收率为80士 15% ；饲料样本的回收率为 90士20% ；相对于其他炔诺酮检测方法，本试剂盒所需仪器较少，只需要酶标仪、氮气吹干 装置、涡旋仪、离心机、振荡机和微量加样器等，同类实验室一般均有配备，所需成本较低。本实用新型的有益效果是能快速、简便、灵敏、准确地用于炔诺酮残留量的检测。
图1为本实用新型酶联板的侧面纵剖面图(长为8. 55cm)；图2为本实用新型酶联板的侧面横剖面图(长为12. 8cm)；图3为本实用新型酶联板的俯视图；图4为本实用新型盖板膜平面图；图5为本实用新型试剂瓶纵剖面平面图；图6为本实用新型固定泡沫模具的俯视图；图7为本实用新型盒体与固定泡沫模具的侧视图。参见附图酶标反应微孔条(2)预包被炔诺酮偶联抗原(3)固定于酶标板的外框 支撑架(1)上，酶标反应微孔条(2)可随要求拆卸；盖板膜(4)用于酶标板置水浴或恒温 箱内反应时封盖酶标反应微孔条O)，盖板膜大小与酶标板横切面大小一致；透明帽的半 透明PE塑料瓶( 用于封装40ml浓缩洗涤液；蓝色帽的半透明PE塑料瓶( 用于封装 50ml浓缩复溶液；白色帽(6)的白色PE塑料瓶(7)用于封装7ml显色液A液，红色帽(6) 的黑色PE塑料瓶(7)用于封装7ml显色液B液，黄色帽(6)的白色PE塑料瓶(7)用于封装 7ml终止液，红色帽的白色PE塑料瓶(8)用于封装12ml酶标二抗，绿色帽的白色PE塑料瓶 (8)用于封装7ml炔诺酮抗体工作液，白色帽的棕色玻璃试剂瓶(9)用于封装Iml/瓶的标 准品溶液；泡沫塑料模具(10)有15个瓶位，放置位置依次为40ml浓缩洗涤液瓶位(18)， 50ml浓缩复溶液(11)，7ml显色液A液瓶位(14)，7ml显色液B液瓶位(1 ，7ml终止液瓶 位(1 ，7ml炔诺酮抗体工作液瓶位(16)，12ml酶标二抗瓶位(1 ，7个Iml/瓶各种浓度 的标准品溶液瓶位(17)，盒体为(19)是硬纸盒。
具体实施方式
一、样本的前处理1.配液:配液1:C液0. 36M 二水合亚硝基铁氰化钠(Nape (CN) 5 · NO · 2H20)溶液 称取10. 7g 二水合亚硝基铁氰化钠去离子水溶解定容至IOOml配液2 :D液IM七水合硫酸锌(ZnS04 · 7H20)溶液称取28. 8g七水合硫酸锌加去离子水溶解定容至IOOm配液3 :0. IM氢氧化钠溶液称取0. 4g氢氧化钠加去离子水溶解定容至IOOml配液4 乙腈-0. IM氢氧化钠溶液量取8細1乙腈加入到16ml 0. IM氢氧化钠溶液中混勻。配液5 乙腈-0. IM氢氧化钠溶液量取80ml乙腈加入到20ml 0. IM氢氧化钠溶液中混勻。配液6:复溶工作液用去离子水将2X浓缩复溶液按1 1体积比进行稀释(1份2X浓缩复溶液+1份去离子水)用于提取样本的复溶，复溶工作液在4°C环境可保存一个月。配液7 洗涤工作液用去离子水将20 X浓缩洗涤液按1 19体积比进行稀释(1份20X浓缩洗涤液 +19份去离子水)用于酶标板的洗涤，洗涤工作液在4°C环境可保存一个月。2. (a)组织(鸡肉/肝、猪肉/肝、虾、鱼等)样本处理步骤用均质器均质组织样本；称取2. 0士0. 05g均质物至50ml聚苯乙烯离心管中，加入 7ml乙腈-0. IM氢氧化钠溶液，分别加入C、D液500 μ 1，用振荡器振荡IOmin, 3000g以上， 室温(20-25°C )离心IOmin ；取Iml上清液至IOml干净的玻璃试管中，于50 60°C氮气流 下吹干；把提取得到的样本液以5倍稀释(100 μ 1样本液+400 μ 1复溶工作液混合均勻)； 取50 μ 1用于分析。(b)饲料样本处理步骤称取1.0士0.05g饲料样本至50ml聚苯乙烯离心管中，加入IOml乙腈_0. IM氢氧 化钠溶液，用振荡器振荡5min，3000g以上，室温(20_25°C )离心5min ；取0. 5ml上清液至 IOml干净的离心管中，加入0. 5ml 0. IM氢氧化钠(见配液3)，涡动20s，加入5ml氯仿，用 振荡器振荡5min，3000g以上，室温(20_25°C )离心5min ；取Iml下层清液至IOml干净的 玻璃试管中，于50 60°C氮气流下吹干；取Iml复溶工作液复溶干燥的残留物；把提取得 到的样本液与复溶工作液按1 4体积比进行稀释(取100 μ 1样本液+400 μ 1复溶工作 液)，涡动混勻；取50 μ 1用于分析。二、使用试剂盒的操作步骤1、将所需试剂从冷藏环境中取出，置于室温(20_25°C )平衡30min以上，注意每种 液体试剂使用前均须摇勻。2、取出需要数量的微孔板，将不用的微孔板放入自封袋，保存于2_8°C。3、洗涤工作液在使用前也需回温。4、编号将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记 录标准孔和样本孔所在的位置。5、加标准品工作液/样本溶液加标准品工作液/样本溶液50 μ 1到对应的微孔 中，再加入抗体工作液50μ 1/孔，轻轻振荡混勻，用盖板膜盖板后置于37°C避光环境中反 应 30min。6、洗板小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液250 μ 1/孔，充分洗涤 4-5次，每次间隔10s，用吸水纸拍干(拍干后未被清除的气泡可用未使用过的枪头戳破)。7、加酶标二抗加入酶标二抗100 μ 1/孔，轻轻振荡混勻，用盖板膜盖板后置37°C 避光环境中反应30min，取出重复洗板步骤6。8、显色加入底物液A液50μ 1/孔，再加底物液B液50μ 1/孔，轻轻振荡混勻，用 盖板膜盖板后置37°C避光环境中反应15min。9、测定加入终止液50 μ 1/孔，轻轻振荡混勻，设定酶标仪于450nm处(建议用双 波长450/630nm检测，请在5min内读完数据)，测定每孔OD值。三、结果判定结果判定有两种方法，粗略判定可用第1种方法，定量判定用第2种方法。注意样 本吸光值与炔诺酮含量成负相关。[0051]1、用样本的平均吸光度值与标准品吸光度值比较即可得出其浓度范围(yg/L)。 假设样本ι的吸光度值为0. 310，样本2的吸光度值为0. 820，标准液吸光度值分别是 0 μ g/L 为 2. 020 ；0. 1 μ g/L 为 1. 512 ；0. 3 μ g/L 为 0. 957 ；0. 9 μ g/L 为 0. 506 ；2. 7 μ g/L 为 0. 172 ；8. 1 μ g/L为0. 080。则样本1的浓度范围是0. 9 μ g/L-2. 7 μ g/L再乘以其对应的稀 释倍数即可得出样本中炔诺酮残留的浓度范围；样本2的浓度范围是0. 3 μ g/L-0. 9 μ g/L, 再乘以其对应的稀释倍数即可得出样本中炔诺酮残留的浓度范围。2、定量分析(1)百分吸光率的计算，标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的百分吸 光度值的平均值(双孔)除以第一个标准(0标准)的吸光度值，再乘以100%，即
权利要求1.一种炔诺酮ELISA检测试剂盒，包括盒体和盒内的一块96孔的酶标板、一张盖板膜、 14瓶试剂和放试剂的下凹瓶位、一个自封袋、一份说明书和一份质检报告，其特征在于酶 标板是采用96孔试剂板作为固相载体，在试剂盒微孔条上预包被炔诺酮偶联抗原制成的 检测板，14瓶试剂分别7瓶标准品溶液、酶标二抗、抗体工作液、显色液A液、显色液B液、终 止液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液，下凹瓶位共15个。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于盒体是硬纸盒；96孔的聚苯乙烯酶标 板，放于真空铝箔袋内；盖板膜是塑料硬膜；标准品溶液用白色帽的棕色玻璃瓶，酶标二抗 用红色帽的白色PE塑料瓶，抗体工作液用绿色帽的白色PE塑料瓶，显色液A液用白色帽的 白色PE塑料瓶，显色液B液用红色帽的黑色PE塑料瓶，终止液用黄色帽的白色PE塑料瓶， 浓缩洗涤液用透明帽的半透明PE塑料瓶，浓缩复溶液用蓝色帽的半透明PE塑料瓶，下凹瓶 位由塑料泡沫制成。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于酶标板是由外框支撑架及放置其上的 可拆的12条酶标反应微孔条组成，每个可拆装酶标反应微孔条有8个反应孔；盖板膜大小 与酶标板横切面大小一致；标准品溶液7瓶，Iml/瓶；酶标二抗1瓶，12ml ；抗体工作液1 瓶，7ml ；显色液A液1瓶，7ml ；显色液B液1瓶，7ml ；终止液1瓶，7ml ；浓缩洗涤液1瓶， 40ml ；浓缩复溶液1瓶，50ml。
专利摘要本实用新型涉及一种检测动物组织、饲料中炔诺酮残留量的酶联免疫试剂盒。该试剂盒组成包括96孔酶标板、酶标二抗、炔诺酮抗体工作液、炔诺酮7个浓度的标准品溶液、底物显色液、终止液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液、盖板膜、自封袋、说明书和质检报告。采用间接竞争ELISA方法，在酶标板微孔条上预包被偶联抗原，样本中含有的炔诺酮将和微孔条上预包被的偶联抗原竞争抗炔诺酮抗体，加入酶标二抗后，用TMB底物显色，样本吸光度值与标准曲线比较再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样品中炔诺酮的残留量。与仪器分析技术相比具有使用方便、高灵敏度等特点，可在动物组织、饲料中炔诺酮的残留量检测中发挥重要作用。
文档编号G01N33/543GK201852837SQ201020586610
公开日2011年6月1日 申请日期2010年10月27日 优先权日2010年10月27日
发明者何丽霞, 何方洋, 段盈盈, 王建霞, 罗贵昆, 蒲小容, 赵正苗 申请人:北京勤邦生物技术有限公司