专利名称：玉米赤霉醇elisa检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本实用新型涉及检测玉米赤霉醇残留量的试剂盒，特别是 检测饲料、牛奶、尿液中玉米赤霉醇残留量的酶联免疫试剂盒，ELISA (EnzymeLinked ImmunosorbnentAssay)是酶联免疫吸附剂测定的简称，它是继免疫荧光和放射免疫技术之 后发展起来的一种酶免技术。背景技术：
玉米赤霉醇(Zeranol)是自然环境中的镰刀菌产生的玉米赤霉 烯酮的还原产物，属于雌性激素，具有维持副性征和代蛋白同化效应，除一般治疗用途外， 还被广泛用于促进生长。其促生长效果对反刍动物最为显著，可增重10% 40%，因此在 养牛业中被大量应用。由于雌激素类物质具有明显的致癌效应，已被大部分国家禁止用于 促生长目的，不得在食品中检出。目前，常用于玉米赤霉醇残留检测的方法主要有仪器分析法。仪器分析法主要有 高效液相色谱分析法(HPLC)、液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)，这些方法的前处理过程繁 琐、检测费用较高，不宜用于大量样本筛查，推广使用受到限制。(三)实用新型内容本实用新型所要解决的问题是提供一种小巧轻便的玉米赤 霉醇残留量检测试剂盒，其操作简便，检测快速、准确、灵敏度高，成本低，稳定性好，需要的 技术含量不高，可进行一次连续多个样品中玉米赤霉醇残留量的测定，减少了检测样本所 需要的时间。本实用新型的技术方案是一种玉米赤霉醇ELISA检测试剂盒，包括盒体和盒内 的一块96孔的酶标板、一张盖板膜、14瓶试剂和放试剂的下凹瓶位、一个自封袋、一份说明 书和一份质检报告，其特征在于酶标板采用96孔试剂板作为固相载体，在试剂盒微孔条 上预包被玉米赤霉醇偶联抗原制成的检测板，14瓶试剂分别为7瓶标准品溶液、酶标二抗、 抗体工作液、显色液A液、显色液B液、终止液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液，下凹瓶位共15个。酶标板由外框支撑架及放置其上的可拆的12条酶标反应微孔条组成，每个可拆 装酶标反应微孔条有8个反应孔，放入真空铝箔袋中，盒体为硬纸盒，下凹瓶位由塑料泡 沫制成，以塑料硬膜为盖板膜，盖板膜的大小与酶标板横切面的大小一致，将14瓶试剂用 不同大小、不同颜色的塑料瓶和玻璃瓶盛装并固定在下凹瓶位中与酶标板、盖板膜、自封 袋、说明书、质控报告一同封装在硬纸盒内，以便于携带和运输。14瓶试剂分别为7瓶Iml 标准品溶液、12ml酶标二抗、7ml玉米赤霉醇抗体工作液、7ml显色液A液、7ml显色液B液、 7ml终止液、40ml浓缩洗涤液、50ml浓缩复溶液。每一个试剂盒中的试剂足够进行96次测 定(包括标准分析孔)，既可进行一次连续多个样品的检测，也可以将板孔拆开多次检测。 将剩下的放回铝箔袋中用自封袋密封，这样可以保证试剂盒检测结果的准确性。检测时，样 本中的玉米赤霉醇将和酶标板微孔条上预包被的玉米赤霉醇偶联抗原竞争抗玉米赤霉醇 抗体，加入酶标二抗后，用TMB底物显色，样本吸光度值与样本中所含玉米赤霉醇的含量成 负相关，与标准曲线比较再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样品中玉米赤霉醇残留量，其 操作简便易行。经实验表明本试剂盒具有很高的灵敏度饲料样本的最低检测限为10 μ g/kg、尿 液样本的最低检测限为0. 5 μ g/kg、牛奶样本的最低检测限为2 μ g/kg、牛肉样本的最低检测限为0.5 μ g/kg;饲料样本的回收率为80% 士20% ；尿液样本的回收率为75% 士 15% ； 牛奶样本的回收率为75% 士 15%;牛肉样本的回收率为80% 士20%;相对于其他玉米赤霉 醇检测方法，本试剂盒所需仪器较少，所需仪器同类实验室一般均有配备，所需成本较低。本实用新型的有益效果是能快速、简便、灵敏、准确地用于玉米赤霉醇残留量的 检测。
图1为本实用新型酶联板的侧面纵剖面图(长为8. 55cm)；图2为本实用新型酶联板的侧面横剖面图(长为12. 8cm)；图3为本实用新型酶联板的俯视图；图4为本实用新型盖板膜平面图；图5为本实用新型试剂瓶纵剖面平面图；图6为本实用新型固定泡沫模具的俯视图；图7为本实用新型盒体与固定泡沫模具的侧视图。参见附图酶标反应微孔条(2)预包被玉米赤霉醇偶联抗原(3)固定于酶标板的 外框支撑架(1)上，酶标反应微孔条(2)可随要求拆卸；盖板膜(4)用于酶标板置水浴或恒 温箱内反应时封盖酶标反应微孔条O)，盖板膜大小与酶标板横切面大小一致；透明帽的 半透明PE塑料瓶( 用于封装40ml浓缩洗涤液；蓝色帽的半透明PE塑料瓶( 用于封装 50ml浓缩复溶液；白色帽(6)的白色PE塑料瓶(7)用于封装7ml显色液A液，红色帽(6) 的黑色PE塑料瓶(7)用于封装7ml显色液B液，黄色帽(6)的白色PE塑料瓶(7)用于封 装7ml终止液，红色帽的白色PE塑料瓶(8)用于封装12ml酶标二抗，绿色帽的白色PE塑料 瓶(8)用于封装7ml玉米赤霉醇抗体工作液，白色帽的棕色玻璃试剂瓶(9)用于封装Iml/ 瓶的标准品溶液；泡沫塑料模具(10)有15个瓶位，放置位置依次为40ml浓缩洗涤液瓶位 (18)，50ml浓缩复溶液(ll)，7ml显色液A液瓶位(14)，7ml显色液B液瓶位(i;3)，7ml终止 液瓶位(1 ，7ml玉米赤霉醇抗体工作液瓶位(16)，12ml酶标二抗瓶位(1 ，7个Iml/瓶 各种浓度的标准品溶液瓶位(17)，盒体为(19)是硬纸盒。
具体实施方式
一、样本的前处理1.配液:配液1 :0. OlM氢氧化钠缓冲液称取0. 4g氢氧化钠，加去离子水溶解定容至IOOml配液2 IM氢氧化钠缓冲液称取4. Og氢氧化钠，加去离子水溶解定容至IOOml配液3 乙腈-0. IM氢氧化钠缓冲液量取90ml乙腈和IOml 0. IM氢氧化钠缓冲液混合均勻配液4 :6M磷酸缓冲液量取IOOml 85%浓磷酸加入到150ml的去离子水中混合均勻配液5:复溶工作液[0028]用去离子水将2X浓缩复溶液按1 1体积比进行稀释(1份2X浓缩复溶液+1 份去离子水)用于提取样本的复溶，复溶工作液在4°C环境可保存一个月。配液6 洗涤工作液用去离子水将20X浓缩洗涤液按1 19体积比进行稀释(1份20X浓缩洗涤液 +19份去离子水)用于酶标板的洗涤，洗涤工作液在4°C环境可保存一个月。2. (a)饲料样本处理步骤取适量样本用勻浆机4000r/min以上勻浆Imin ；称取2. 0士0. 05g均质物，加入 IOml乙腈-0. IM氢氧化钠溶液，振荡lOmin，室温3000g以上，离心IOmin ；取Iml上清液 在50°C氮气流下完全干燥；用0. 5ml三氯甲烷充分溶解，加入aiil IM氢氧化钠溶液，振荡 5min室温3000g以上，离心IOmin ；取出Iml上清液，加入100 μ 16M磷酸(调pH = 6. 5)，再 加入5ml三氯甲烷，振荡lOmin，室温3000g以上，离心lOmin，取2. 5ml下层有机相在50°C 氮气流下完全干燥；用Iml稀释后的复溶液溶解干燥的残留物；再取出溶解后的样本提取 液与稀释后的复溶液按1 9体积比进行稀释1稀释后的复溶液+50 μ 1样本提取 液)；取50 μ 1用于分析。(b)尿液样本处理步骤取2ml尿液到离心管中，室温3000g以上离心IOmin ；取Iml上清尿液到离心管中， 加入10 μ 1 Glucuronidase/Arylsulfatase (葡萄糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶)，在37°C水浴 3h,再加入5ml三氯甲烷，振荡lOmin，室温3000g以上，离心lOmin，取2. 5ml下层有机相在 50°C氮气流下完全干燥；用Iml稀释后的复溶液溶解干燥的残留物；取出50 μ 1溶解后的 样本提取液与稀释后的复溶液按1 4体积比进行稀释(50 μ 1样本提取液+200 μ 1稀释 后的复溶液充分混合)；取50 μ 1用于分析。(c)牛奶取新鲜牛奶1ml，加入8μ 1葡萄糖苷酸酶/芳基硫酸酯酶，37 °C酶解池；取出 25 μ 1，加入975 μ 1复溶液进行稀释；取50 μ 1用于分析。(d)牛肉称取1. O 士0. Ig样本，加入2ml去离子水，加入8 μ 1葡萄糖苷酸酶/芳基硫酸酯 酶混勻，37°C酶解；取出加入8μ 1乙腈，振荡10min，3000g以上离心5min ；取上清5ml， 加入2ml三氯甲烷，加入6ml正己烷，涡动振荡lOmin，3000g以上离心5min ；去上层正己 烷，取中间层吹干；加入Iml复溶液涡动溶解，取200 μ 1加入800 μ 1复溶液混合；取50 μ 1 用于分析。二、使用试剂盒的操作步骤1、将所需试剂从冷藏环境中取出，置于室温Q0-25°C )平衡30min以上，注意每种 液体试剂使用前均须摇勻。2、取出需要数量的微孔板，将不用的微孔板放入自封袋，保存于2_8°C。3、洗涤工作液在使用前也需回温。4、编号将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准品做2孔平行，并记 录标准孔和样本孔所在的位置。5、加标准品工作液/样本溶液加标准品工作液/样本溶液50 μ 1到对应的微孔 中，再加入抗体工作液50 μ 1/孔，轻轻振荡混勻，用盖板膜盖板后置于37°C避光环境中反应 30min。 6、洗板小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液250 μ 1/孔，充分洗涤 4-5次，每次间隔10s，用吸水纸拍干(拍干后未被清除的气泡可用未使用过的枪头戳破)。7、加酶标二抗加入酶标二抗100 μ 1/孔，轻轻振荡混勻，用盖板膜盖板后置37°C 避光环境中反应30min，取出重复洗板步骤6。8、显色加入底物液A液50μ 1/孔，再加底物液B液50μ 1/孔，轻轻振荡混勻，用 盖板膜盖板后置37°C避光环境中反应15min。9、测定加入终止液50 μ 1/孔，轻轻振荡混勻，设定酶标仪于450nm处(建议用双 波长450/630nm检测，请在5min内读完数据)，测定每孔OD值。三、结果判定结果判定有两种方法，粗略判定可用第1种方法，定量判定用第2种方法。注意样 本吸光值与玉米赤霉醇残留量成负相关。1、用样本的平均吸光度值与标准品吸光度值比较即可得出其浓度范围(yg/L)。 假设样本ι的吸光度值为0. 6，样本2的吸光度值为1. 0，标准液吸光度值分别是0 μ g/L 为 1. 500 ；0. 05 μ g/L 为 1. 380 ；0. 1 μ g/L 为 1. 200 ；0. 2 μ g/L 为 0. 900 ；0. 4 μ g/L 为 0. 700 ； 0. 8 μ g/L为0. 400。则样本1的浓度范围是0. 2 μ g/L-0. 4 μ g/L再乘以其对应的稀释倍数 即可得出样本中玉米赤霉醇残留的浓度范围；样本2的浓度范围是0. 1 μ g/L-0. 2 μ g/L再 乘以其对应的稀释倍数即可得出样本中玉米赤霉醇残留的浓度范围。2、定量分析(1)百分吸光率的计算，标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的百分吸 光度值的平均值(双孔)除以第一个标准(0标准)的吸光度值，再乘以100%，即
B
百分吸光度值(％) = - X 100%
B0B-标准溶液或样本溶液的平均吸光度值B0-O μ g/L标准溶液的平均吸光度值(2)标准曲线的绘制与计算以标准品百分吸光率为纵坐标，以玉米赤霉醇标准品浓度(μ g/L)的半对数为横 坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对 应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中玉米赤霉醇实际残留量。四、测定前的注意事项1、室温低于20°C或试剂及样本没有回到室温(20_25°C )会导致所有标准的OD值 偏低。2、在洗板过程中如果出现板孔干燥的情况，则会出现标准曲线不成线性，重复性 不好的现象。所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。3、每加一种试剂前需将其摇勻。4、反应终止液为2M硫酸，避免接触皮肤。5、不要使用过了有效日期的试剂盒；也不要使用过了有效期的试剂盒中的任何试 齐U，掺杂使用过了有效期的试剂盒会引起灵敏度的降低；不要交换使用不同批号试剂盒中的试剂。6、储存条件保存试剂盒于2_8°C，不要冷冻，将不用的酶标板微孔板放进自封袋重新密封。标 准物质和无色的发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。7、试剂变质的迹象发色试剂有任何颜色表明发色剂变质，应当弃之。0标准的吸光度G50/630nm)值 小于0. 5 (A450nm < 0. 5)时，表示试剂可能变质。8、在加入底物液A液和底物液B液后，一般显色10-15min即可。若颜色较浅，可 延长反应时间到20min(或更长)，但不得超过30min。反之，则减短反应时间。9、该试剂盒最佳反应温度为37°C，温度过高或过低将导致检测吸光度值和灵敏度 发生变化。
权利要求1.一种玉米赤霉醇ELISA检测试剂盒，包括盒体和盒内的一块96孔的酶标板、一张盖 板膜、14瓶试剂和放试剂的下凹瓶位、一个自封袋、一份说明书和一份质检报告，其特征在 于酶标板是采用96孔试剂板作为固相载体，在试剂盒微孔条上预包被玉米赤霉醇偶联抗 原制成的检测板，14瓶试剂分别为7瓶标准品溶液、酶标二抗、抗体工作液、显色液A液、显 色液B液、终止液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液，下凹瓶位共15个。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于盒体是硬纸盒；96孔的聚苯乙烯酶标 板，放于真空铝箔袋内；盖板膜是塑料硬膜；标准品溶液用白色帽的棕色玻璃瓶，酶标二抗 用红色帽的白色PE塑料瓶，抗体工作液用绿色帽的白色PE塑料瓶，显色液A液用白色帽的 白色PE塑料瓶，显色液B液用红色帽的黑色PE塑料瓶，终止液用黄色帽的白色PE塑料瓶， 浓缩洗涤液用透明帽的半透明PE塑料瓶，浓缩复溶液用蓝色帽的半透明PE塑料瓶，下凹瓶 位由塑料泡沫制成。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于酶标板是由外框支撑架及放置其上的 可拆的12条酶标反应微孔条组成，每个可拆装酶标反应微孔条有8个反应孔；盖板膜大小 与酶标板横切面大小一致；标准品溶液7瓶，Iml/瓶；酶标二抗1瓶，12ml ；抗体工作液1 瓶，7ml ；显色液A液1瓶，7ml ；显色液B液1瓶，7ml ；终止液1瓶，7ml ；浓缩洗涤液1瓶， 40ml ；浓缩复溶液1瓶，50ml。
专利摘要本实用新型涉及一种检测饲料、牛奶、尿液中玉米赤霉醇残留量的酶联免疫试剂盒。该试剂盒组成包括96孔酶标板、酶标二抗、玉米赤霉醇抗体工作液、玉米赤霉醇7个浓度的标准品溶液、底物显色液、终止液、浓缩洗涤液、浓缩复溶液、盖板膜、自封袋、说明书和质检报告。采用间接竞争ELISA方法，在酶标板微孔条上预包被偶联抗原，样本中残留的玉米赤霉醇将和微孔条上预包被的偶联抗原竞争抗玉米赤霉醇抗体，加入酶标二抗后，用TMB底物显色，样本吸光度值与标准曲线比较再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样品中玉米赤霉醇的残留量。与仪器分析技术相比具有使用方便、高灵敏度等特点，可在饲料、牛奶、尿液中玉米赤霉醇的残留量检测中发挥重要作用。
文档编号G01N33/545GK201852836SQ20102058660
公开日2011年6月1日 申请日期2010年10月27日 优先权日2010年10月27日
发明者何方洋, 余厚美, 冯月君, 刘福林, 段盈盈, 王建霞, 蒲小容 申请人:北京勤邦生物技术有限公司