专利名称：富硒保健品中硒形态的测定方法
技术领域：
本发明涉及一种富硒保健品硒形态的测定方法，特别是涉及一种富硒保健品进行前处理后进行硒形态的测定方法。
背景技术：
硒是人体必需的微量元素之一，是谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的组成成分， 具有抗氧化、抗癌、防衰老、提高人体免疫力、保护心脑血管等作用(Rotruck J T，Pope A L, Ganther H E, et al Selenium :biochemicalrole as a component of glutathione peroxidase. Science, 1973,179, 588-590.) 我国有 2/3 的地区缺硒，其中有 1/3 的地区为严重缺硒地区。人和动物体缺硒会导致克山病，大骨节病，动物的白肌病等，除此以外一些癌症，地方性甲状腺障碍等疾病也与低硒环境密切相关(Ip C. Lessons frombasic research in selenium and cancer prevention.Journal Nutrition,1998,128, 1845-1854.)。人们日常饮食中的硒包括无机硒和有机硒，其中无机硒毒性较大，中毒量与需要量的界限非常接近，而且吸收和利用率差，生物有效性低，因而被严格限制其使用量。 有机硒更利于人体吸收利用，生物活性强，毒性低(卢岚，鲁兵，王春娥.保健食品中有机硒和无机硒的分析探讨.中国卫生检验杂志.2010，2(K4) :767-769.),是更高效、安全的人体补硒形式。硒的生物学功能的发挥主要依赖于其存在形态，特别是有机硒(硒代氨基酸) 的形态。因此，准确的检测分析硒代氨基酸的形态具有重大的意义，不仅能指导消费者科学补硒，还能进一步了解硒的生物化学特性和硒在自然界迁移变化的规律。
目前，我国测定有机硒含量的方法主要为差减法(秦昉.植物中有机硒含量的测定.无锡轻工业大学学报.1998，17 (4) :74-77.),差减法的原理是先利用不同的试剂将待测样品中的有机硒和无机硒分离，因无机硒主要以硒酸根(Se042_)和亚硒酸根(Se032_) 阴离子形式存在，易溶于水。有机硒主要是与蛋白质、纤维素和碳水化合物中的C、N等结合，以大分子的有机物形态存在，所以可利用环己烷或甲苯等有机溶剂萃取出有机硒，再通过测定总硒和无机硒的含量，差减得到有机硒的含量。此方法操作步骤繁琐，重复性差，只能得到有机硒的总量，对于具体的有机硒形态并不清楚，且所用的环己烷、甲苯等有机溶剂存在一定的毒性。硒形态研究属于前沿研究，目前国内、外并无硒形态研究方法的标准。本发明利用温和的提取方式，提取含硒化合物，利用酶水解含硒化合物后再利用液相色谱进行有效分离，最后利用高灵敏度的原子荧光(AM)进行不同形态硒的测定，最后得到有机硒的含量。此方法的优点是能测定富硒植物中不同形态的硒含量和有机硒含量，能进一步了解植物富集吸收硒的转化规律，此方法简单易操作，重复性好，精确度高，所用试剂无毒、 无污染。
国外对硒形态测定的前处理方法也有报道，Selenium species in leavesof chicory, dandelion, lamb' s lettuce and parsley(Darja Mazej, VekoslavaStibilj, et al. Food Chemistry, 2008,107 :75-83.)公开了一种单独利用蛋白酶水解样品然后进行硒形态测试的方法，该方法蛋白酶用量与样品的比例为1 2 1 5，成本很高。
所以，开发一种针对以硒代氨基酸为主要分析目标、低成本高效率的样品前处理及测试方法十分有必要。发明内容
本发明的目的是克服现有硒形态测定技术特别是提取技术中存在的不足，提供一种操作简便，提取效率高，重复性好，成本低的富硒保健品中硒形态的测定方法。
为了解决现有技术中的这些问题，本发明提供的技术方案如下
一种富硒保健品中硒形态的测定方法，其特征在于所述方法包括以下步骤
(1)富硒保健品的预处理使用提取缓冲液Tris-HCl对富硒保健品样品进行提取，提取处理后依次加入有效量的蛋白酶K、蛋白酶XIV进行水解提取得到待测样品溶液；
(2)采用氢化物发生——原子荧光光谱法与高效液相色谱法联用分别对标准硒形态溶液和待测样品溶液进行测定；用峰高或峰面积进行定量，用数据处理中的外标法，绘制标准工作曲线后保存，然后将样品峰积分处理，利用外标法校正，按照公式(1)可计算得到待测样品溶液中硒代胱氨酸(Se-Cys2)、硒甲基半胱氨酸(SeMeCys)、Se (IV)、硒代蛋氨酸 (SeMet)的含量；
X = CXV/m (1)
其中X为样品中待测物质的含量，单位为微克每千克(yg/kg) ；C为待测液中该物质的浓度，单位为微克每升(yg/L) ；V为测定液体总体积，单位为毫升(mL) ；F为稀释倍数；m为称样质量(体积)，单位为克(g/mL)。
优选的，所述方法中提取缓冲液Tris-HCl的浓度为lOOmmol/L，pH7. 5，液体保健品样品与提取液的比例(V V)为1 5 1 10或者固体保健品样品与提取液的比例 (m V)为 1 25 1 100。
优选的，所述方法中提取方法采用超声提取，提取时间为10 30min。
优选的，所述方法中蛋白酶K与液体保健品样品的比例(m V)为1 100 1 2000或者蛋白酶K与固体保健品样品的比例(m m)为1 20 1 100 ；水解温度控制在40 55 °C。
优选的，所述方法中蛋白酶XIV与液体保健品样品的比例(m V)为1 100 1 2000，蛋白酶XIV与固定保健品样品的比例(m m)为1 20 1 100 ；水解温度控制在30 45 °C。
优选的，所述方法中水解处理后样品溶液在0 10°C下，离心处理后上清液过 0. 2 0. 5 μ m的滤膜，制得待测上清液。
优选的，所述方法中高效液相色谱法和氢化物发生——原子荧光光谱法联用时液相色谱及原子荧光条件为
流动相(4(toimol/L(NH4)2HP04，pH6. 0)；流速 lmL/min ；进样体积 100 μ L ；蠕动泵转速65rpm ；灯电流/辅阴极100mA，45mA ；光电倍增管负高压300V ；载气流速300mL/min ； 屏蔽气流速700mL/min。
优选的，所述方法中高效液相色谱法和氢化物发生——原子荧光光谱法联用时氢化物发生条件是
还原剂成分0.35 % NaOH+1. 2 % NaBH4,流速:6mL/min ；氧化剂成分0. 35 %Na0H+0. 8% H2O2，流速6mL/min ；载流10% HCl，流速6mL/min。
优选的，所述方法开机后对液相色谱及原子荧光进行设置，待仪器稳定后，先做标准曲线，然后测定处理好的样品溶液，在上述条件下硒代胱氨酸(Se-Cys2)、硒甲基半胱氨酸(SeMeCys)、Se(IV)、硒代蛋氨酸(SeMet)的保留时间依次为2. 6min,3. 2min,4. Omin, 5. Omin，待测样品中的硒代胱氨酸(Se-Cys2)、硒甲基半胱氨酸(SeMeCys)、Se (IV)、硒代蛋氨酸(SeMet)的色谱峰保留时间与标准溶液相比变化范围在士5%之内即认为为该待测定物质。
本发明涉及一种富硒保健品中硒形态的测定方法，是利用超声提取后，再结合温和的酶水解，使富硒保健品中的含硒化合物充分水解以利于硒形态的测定。所述的以硒代氨基酸为主要硒形态指标的前处理方法，其步骤描述如下
(1)先移取混勻或称取研磨过筛的富硒保健品于塑料离心管中，加入提取缓冲液 Tris-HCl (100mmOl/L，pH7. 5)，混勻。液体富硒保健品与提取液的比例(V V)为1 5 1 10，固体保健品与提取液的比例(m V)为1 25 1 100 ；
(2)将混合液放入超声清洗器超声提取10 30min ；
(3)再加入蛋白酶K，50°C条件下恒温振荡(转速150 200rpm，使塑料离心管中的液体能充分振荡)提取4 12h。蛋白酶K与液体样品的比例(m V)为1 100 1 2000，蛋白酶K与固体样品的比例(m m)为1 20 1 100;
(4)再加入蛋白酶XIV，37°C，恒温振荡(转速150 200rpm，使塑料离心管中的液体能充分振荡)提取4 12h。蛋白酶XIV与液体样品的比例(m V)为1 100 1 2000，蛋白酶XIV与样品的比例(m m)为1 20 1 100;
(5)将1 4步中获得的溶液在4°C下，以转速10000转/分离心30min，取上清液过0. 22 μ m的滤膜，得到待测的溶液。
(6)设定液相色谱及原子荧光条件
流动相(40mmol/L(NH4)2HP04, pH 6. 0)；流速 lmL/min ；进样体积 100 μ L ；蠕动泵转速65rpm ；灯电流/辅阴极100mA，45mA ；光电倍增管负高压300V ；载气流速300mL/ min ； 屏蔽气流速700mL/min。
氢化物发生条件
还原剂成分0.35 % NaOH+1. 2 % NaBH4,流速:6mL/min ；氧化剂成分0. 35 % NaOH+O. 8% H202，流速6mL/min ；载流10% HCl，流速6mL/min。
(7)开机后按上述条件对液相色谱及原子荧光进行设置，待仪器稳定后，先做标准曲线，然后测定处理好的样品溶液，在上述条件下硒代胱氨酸(Se-Cys2)、硒甲基半胱氨酸(SeMeCys)、Se(IV)、硒代蛋氨酸(SeMet)的保留时间依次为2. 6min,3. 2min,4. Omin, 5. Omin，待测样品中的硒代胱氨酸(Se-Cys2)、硒甲基半胱氨酸(SeMeCys)、Se (IV)、硒代蛋氨酸(SeMet)的色谱峰保留时间与标准溶液相比变化范围在士5%之内即认为为该待测定物质。
(8)用峰高或峰面积进行定量，用数据处理中的外标法，绘制标准工作曲线后保存，然后将样品峰积分处理，利用外标校正，即可得到待测溶液中硒代胱氨酸6e-Cys2)、硒甲基半胱氨酸(SeMeCys) Je (IV)、硒代蛋氨酸(SeMet)的浓度。
(9)按照公式(1)可计算得到待测样品中硒代胱氨酸6e-Cys2)、硒甲基半胱氨酸(SeMeCys)、Se (IV)、硒代蛋氨酸(SeMet)的浓度。
X = CXV/m ..................(1)
式中
X-样品中待测物质的含量，单位为微克每千克(μ g/kg)；
C-待测液中该物质的浓度，单位为微克每升(μ g/L)；
V—测定液体总体积，单位为毫升(mL)；
F-稀释倍数；
m-称样质量(体积)，单位为克(g/mL)。
本发明利用温和的提取方式，超声提取含硒化合物后再多种酶结合使用使含硒化合物彻底水解，这样不仅使用的酶用量少，成本低廉而且水解效果好。此方法的优点是简单易操作，提取效率高，重复性好，成本低，所用试剂无毒、无污染。
相比现有技术，本发明具有以下有益效果
1、选择温和的提取试剂pH近中性的Tris-HCl，使含硒化合物在提取过程中形态保持稳定。
2、提取过程中采用超声提取，使含硒化合物更多的溶入提取液中，提高了提取效率。
3、超声提取在加酶之前，一是不破坏酶的结构，影响酶的活性，二是使含硒化合物更多的溶入提取液后，更利于酶的水解。
4、使用2种蛋白酶水解，含硒化合物水解更彻底，与1种蛋白酶水解相比提取效率提高40%以上，且提取率均可达80%以上，所需使用的蛋白酶的量更少，成本节约10倍以上。
5、本发明方法简单易操作，重复性好，所用试剂无毒、无污染。
下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述
图1为硒形态标准分离谱图；谱图中揭示了硒代胱氨酸(％-Cys2)、硒甲基半胱氨酸(SeMeCys)、％ (IV)、硒代蛋氨酸(SeMet)的依次出峰顺序、保留时间及浓度梯度。
图2为本发明实施例1某知名品牌的富硒保健品的测定结果图；由图2可知，采用本发明的提取条件及利用高灵敏度的形态分析仪器可测定该品牌的富硒保健品存在4种硒形态，根据峰面积计算可得到各形态的含量及占总硒的比例。
图3为本发明实施例2某品牌硒酵母片的测定结果图；由图3可知，采用本发明的提取条件及利用高灵敏度的形态分析仪器可测定该品牌硒酵母片中仅存在两种硒氨基酸形态，根据峰面积计算各形态的含量及占总硒的比例。
具体实施例方式
以下实施例用于说明本发明，但不能用来限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可以根据具体厂家的条件作进一步调整，未说明的实施条件通常为常规实验中的条件。
目前，市场上的富硒保健品种类繁多，因其在生产过程中添加的硒源(无机硒源或有机硒源)及量不同，最终的富硒保健品中硒的含量及存在形式也存在很大的差别，市场上富硒保健品中硒的含量和硒究竟以什么样的形式存在，消费者该如何选择安全、有效的富硒保健品存在很多疑惑，因此对此类产品中硒含量及形态的测定也提出了更高的要求，本发明选择了占国内富硒保健品市场份额较高的产品进行了测定。
实施例1某知名品牌的富硒保健品(液体)中硒形态测定
对某知名品牌的富硒保健品(液体)的硒形态测定前处理方法步骤进行了优化， 优化过程及结果如下
移取ImL富硒保健品于15mL塑料离心管中，加入5mL提取缓冲液Tris-HCl，超声提取15min，加入Img蛋白酶K，50°C，恒温振荡培养他，再加入Img蛋白酶XIV，37°C，恒温振荡培养他后4°C下，每分钟转速10000转，离心30min，上清液过0. 22 μ m的滤膜后，制备得到上机待测液。将液相色谱条件设置为流动相(40mmol/L(NH4)2HP04，pH 6.0)；流速ImL/ min ；进样体积100 μ L ；蠕动泵转速65rpm ；灯电流/辅阴极100mA，45mA ；光电倍增管负高压300V ；载气流速300mL/min ；屏蔽气流速700mL/min。氢化物发生条件设置为还原剂成分0. 35% NaOH+1. 2% NaBH4，流速:6mL/min ；氧化剂成分0. 35% Na0H+0. 8% H202，流速 6mL/min ；载流10% HCl，流速6mL/min。
开机后按上述条件对液相色谱及原子荧光进行设置，待仪器稳定后，先做标准曲线，然后测定处理好的样品溶液，在上述条件下硒代胱氨酸(Se-Cys2)、硒甲基半胱氨酸(SeMeCys)、Se(IV)、硒代蛋氨酸(SeMet)的保留时间依次为2. 6min,3. 2min,4. Omin, 5. Omin，待测样品中的硒代胱氨酸(Se-Cys2)、硒甲基半胱氨酸(SeMeCys)、Se (IV)、硒代蛋氨酸(SeMet)的色谱峰保留时间与标准溶液相比变化范围在士5%之内即认为为该待测定物质。
用峰高或峰面积进行定量，用数据处理中的外标法，绘制标准工作曲线后保存，然后将样品峰积分处理，利用外标校正，即可得到待测溶液中硒代胱氨酸6e-Cys2)、硒甲基半胱氨酸GeMeCys)、Se (IV)、硒代蛋氨酸(SeMet)的浓度。并根据公式计算样品硒形态数据。
表1优化条件筛选及效果
超声时间(min)O 5 10 15 20 30 40 60~
权利要求
1.一种富硒保健品中硒形态的测定方法，其特征在于所述方法包括以下步骤(1)富硒保健品的预处理使用提取缓冲液Tris-HCl对富硒保健品样品进行提取，提取处理后依次加入有效量的蛋白酶K、蛋白酶XIV进行水解提取得到待测样品溶液；(2)采用氢化物发生——原子荧光光谱法与高效液相色谱法联用分别对标准硒形态溶液和待测样品溶液进行测定；用峰高或峰面积进行定量，用数据处理中的外标法，绘制标准工作曲线后保存，然后将样品峰积分处理，利用外标法校正，按照公式(1)可计算得到待测样品溶液中硒代胱氨酸(Se-Cys2)、硒甲基半胱氨酸(SeMeCys)、Se (IV)、硒代蛋氨酸 (SeMet)的含量；X=CXV/m (1)其中X为样品中待测物质的含量，单位为微克每千克(μ g/kg);C为待测液中该物质的浓度，单位为微克每升(μ g/L);V为测定液体总体积，单位为毫升(mL); F为稀释倍数； m为称样质量(体积)，单位为克(g/mL)。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中提取缓冲液Tris-HCl的浓度为100 mmol/L,pH7. 5，液体保健品样品与提取液的比例(V: V)为1 5 1 10或者固体保健品样品与提取液的比例(m:V)为1:25 1:100。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中提取方法采用超声提取，提取时间为1(T30 min。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中蛋白酶K与液体保健品样品的比例(m:V)为1 :10(Tl :2000或者蛋白酶K与固体保健品样品的比例(m:m)为1 :2(Tl :100 ； 水解温度控制在40 55°C。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中蛋白酶XIV与液体保健品样品的比例(m:V)为1 :10(Tl :2000，蛋白酶XIV与固定保健品样品的比例(m:m)为1 :2(Tl 100 ；水解温度控制在30 45°C。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中水解处理后样品溶液在0 10°C下，离心处理后上清液过0. 2 0. 5 μ m的滤膜，制得待测上清液。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述方法中高效液相色谱法和氢化物发生——原子荧光光谱法联用时液相色谱及原子荧光条件为流动相(40 mmo VL(NH4)2HPO4, pH 6. 0)；流速 1 mL/min ；进样体积 100 μ L ；蠕动泵转速65 rpm ；灯电流/辅阴极100mA，45mA ；光电倍增管负高压300V ；载气流速300mL/ min ； 屏蔽气流速700mL/min。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述方法中高效液相色谱法和氢化物发生——原子荧光光谱法联用时氢化物发生条件是还原剂成分0. 35%Na0H+l. 2%NaBH4,流速6 mL/min ；氧化剂成分 0. 35%Na0H+0. 8%H202，流速6 mL/min ；载流10% HCl，流速6 mL/min。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于所述方法开机后对液相色谱及原子荧光进行设置，待仪器稳定后，先做标准曲线，然后测定处理好的样品溶液，在上述条件下硒代胱氨酸(Se-Cys2 )、硒甲基半胱氨酸(SeMeCys )、k (IV)、硒代蛋氨酸(SeMet)的保留时间依次为2.6 min, 3. 2 min, 4.0 min, 5.0 min，待测样品中的硒代胱氨酸(Se_Cys2)、硒甲基半胱氨酸(SeMeCys)、Se(IV)、硒代蛋氨酸(SeMet)的色谱峰保留时间与标准溶液相比变化范围在士5%之内即认为为该待测定物质。
全文摘要
本发明公开了一种富硒保健品中硒形态的测定方法，其特征在于所述方法包括以下步骤(1)富硒保健品的预处理使用提取缓冲液Tris-HCl对富硒保健品样品进行提取，提取处理后依次加入有效量的蛋白酶K、蛋白酶XIV进行水解提取得到待测样品溶液；(2)采用氢化物发生——原子荧光光谱法与高效液相色谱法联用分别对标准硒形态溶液和待测样品溶液进行测定。该方法简单易操作，重复性好，所用试剂无毒、无污染。
文档编号G01N30/06GK102520090SQ20111042829
公开日2012年6月27日 申请日期2011年12月20日 优先权日2011年12月20日
发明者朱元元 申请人:苏州硒谷科技有限公司