专利名称：磺基异硫氢酸苯酯作化学修饰剂在多肽序列测定中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种化学修饰试剂，具体涉及一种磺基异硫氢酸苯酯作为化学修饰剂的应用。
背景技术：
在蛋白质化学及蛋白质组学研究中，为了增加蛋白质鉴定的可信度，获得一段蛋白质肽片段内部序列信息通常是非常重要的。对于蛋白质及多肽的序列测定，传统的方法是采用Edman降解方法，而该方法最大的不足之处在于费时太长(一个残基需花费30-40分钟)。近年来，随着质谱技术的飞速发展，尤其是多级质谱(MS/MS)以及源后裂解(PSD)等技术的发展，应用质谱测序已成为一种流行的方法。但是常用的多级质谱以及源后裂解技术在进行序列测定时，所得肽片段的图谱较为复杂，经高能裂解的片段离子峰既包含a+、b+、c+系列离子，也包含x+、y+、z+系列离子，甚至还包含内部肽片段离子，且离子系列峰又不完全，给质谱图的从头解析即序列的读取造成了一定的困难。多肽片段质谱测定中质谱图解析困难问题是多肽序列测定中急待解决的关键技术。
发明内容
本发明提出了用磺基异硫氢酸苯酯(4-sulfophenyl isothiocyanate，SPITC)作化学修饰试剂，对所测样品进行修饰，以解决常用的MS/MS以及PSD技术在进行序列测定时所得肽片段的图谱较复杂、谱图解析较困难的问题。
上述发明目的是通过以下技术方案实现的将磺基异硫氢酸苯酯溶解在PH7.2-8.2的缓冲液中，制备成浓度为1-10mg/ml的溶液，取5-15ul于0.2mlEP管中，再将载有待测样品的ZipTip柱在其中吸上压下数次，使溶液保持在柱上，50℃保温15-20分钟，过量的修饰剂溶液用0.1％三氟乙酸水溶液洗5-10次，衍生物用2.5ml质谱分析洗脱液洗脱后作质谱分析用。
下面结合附图对本发明作进一步说明。
图1为本发明衍生反应原理图。
图2为质谱在PSD测序时磺基异硫氢酸苯酯帮助裂解示意图。
图3(1-2)为SPITC对HGTVVLTALGGILK多肽修饰前后的PSD序列测定结果图。
图4为SPITC对ADSGEGDFLAEGGGVR多肽修饰后的PSD测定结果图。
图5(1-4)为本发明应用在蛋白质组示研究中2D-胶上蛋白质点鉴定的测定结果图。
磺基异硫氢酸苯酯(异硫氢酸苯酯磺酸钠)分子量255.25道尔顿，分子式NaO3SC6H4NCS.H2O，当磺基异硫氢酸苯酯与样品进行反应后，它修饰样品的N端，使其N端接上一个磺酸基团，由此引入了一个负电荷到肽段的N端(图1)。在进行质谱分析时，若要形成正电荷模式，样品质子化过程中需引入两个质子到肽片段上，其中一个主要位于肽片段的C端，另一个则在肽骨架上游动帮助肽链断裂(图2)。经修饰后的样品在低能的PSD模式下也非常容易断裂，且只在肽键处断裂，即只得到b+和y+系列离子；而在b+离子C端的正电荷被b+离子N端的磺酸负电荷中和后整个肽段呈中性，在质谱分析中不会出现信号，只有带有正电荷的y+离子系列方能被检测，其背景非常干净，信噪比也非常高。具体操作步骤如下新鲜溶解磺基异硫氢酸苯酯(SPITC)在Tris-HCl(25-100mM，PH7.2-8.2)缓冲液中，制备成浓度为1-10mg/mL的溶液；取5-15μl于0.2ml EP管中，另将预先载有待测样品的ZipTip柱在其中吸上压下数次(注意不要产生气泡)，最后使溶液保持在柱上，50℃保温15-20分钟。过量的试剂用0.1％三氟乙酸水溶液洗脱5-10次，最后将衍生物用2.5μl洗脱液(80％乙腈∶0.5％三氟乙酸＝1∶1)洗脱下来用做质谱分析。
本发明利用磺基异硫氢酸苯酯化学辅助的质谱PSD微量蛋白质及多肽序列测定技术具有快速、简便、高灵敏度、高准确性的特点，每个样品的磺酸化反应(包括样品和化学试剂的吸附，衍生样品的冲洗和洗脱)可在数分钟之内完成，且一次可平行处理多个样品，适合蛋白质样品的高通量分析；且衍生后的肽片段在PSD测定时只产生唯一的y+离子系列，有利于蛋白质酶解肽片段序列的从头解析，能为微量蛋白质的准确鉴定提供强有力的依据，在蛋白质化学及蛋白质组学的研究中具有广阔的应用前景。
具体实施例方式实例一磺基异硫氢酸苯酯对HGTVVLTALGGILK的多肽修饰及修饰前后PSD测定结果。
新鲜溶解磺基异硫氢酸苯酯(SPITC)在Tris-HCl(100mM，pH8.2)缓冲液中，制备成浓度为1mg/mL的溶液；取10μl于0.2ml EP管中，将预先载有多肽样品的ZipTip柱在其中吸上压下数次，最后使溶液保持在柱上，50℃保温15分钟左右。过量的试剂用0.1％三氟乙酸水溶液洗脱10次，最后将衍生物用2.5μl洗脱液(80％乙腈∶0.5％三氟乙酸＝1∶1)洗脱下来用做质谱分析。
由图3可见，未经修饰图3(1)的肽片段的PSD图谱较为复杂，片段离子峰既包含a+、b+、c+系列离子，也包含x+、y+、z+系列离子，甚至还包含内部肽片段离子，且离子系列峰又不完全，给质谱图的从头解析造成了一定的困难；而修饰后的肽片段的PSD图谱3(2)中只出现了y+离子系列，且肽的14个氨基酸的y1+至y14+离子基本出齐，肽片段离子峰的信噪比较高，图谱极为清晰，因此能毫不含糊地从头解析该肽片段的氨基酸序列。
实例二磺基异硫氢酸苯酯对序列为ADSGEGDFLAEGGGVR的多肽修饰及修饰后的PSD测定结果。
新鲜溶解磺基异硫氢酸苯酯(SPITC)在Tris-HCl(50mM，pH7.2)缓冲液中，制备成浓度为10mg/mL的溶液；取10μl于0.2ml EP管中，将预先载有多肽样品的ZipTip柱在其中吸上压下数次(注意不要产生气泡)，最后使溶液保持在柱上，50℃保温15分钟左右。过量的试剂用0.1％三氟乙酸水溶液洗脱10次，最后将衍生物用2.5μl洗脱液(50％乙腈∶0.1％三氟乙酸＝1∶1)洗脱下来用做质谱分析。
由图4可见，肽16个氨基酸的y1+至y16+离子全部出齐，肽片段离子峰的信噪比高，背景清晰；极易从头解析该肽片段的氨基酸序列。
实例三2DE分离的蛋白质点原位酶解后用磺基异硫氢酸苯酯化学修饰及测定结果。
磺基异硫氢酸苯酯(SPITC)在Tris-HCl(25mM，pH7.5)缓冲液中，制备成浓度为2.5mg/mL的溶液；取10μl于0.2ml EP管中，将预先载有样品的ZipTip柱在其中吸上压下数次，最后使溶液保持在柱上，50℃保温20分钟左右。过量的试剂用0.1％三氟乙酸水溶液洗脱10次，最后将衍生物用2.5μl洗脱液(70％乙腈∶0.1％三氟乙酸＝1∶1)洗脱下来用做质谱分析。
图5(1)为经修饰的2D-胶上蛋白质点的PMF图谱，与未经修饰的图谱对照发现图中用星号标出的峰有可能为被修饰的肽片段，图5(2)(3)(4)三张图展示的就是其中3个片段峰的PSD测定图谱，均得到了清晰的y+离子信号，且所有的y+离子峰全部出齐，可以清晰地读出全部氨基酸序列，经网上搜寻目的蛋白均为磷酸化酶b。从图中还可发现，即使是在峰强度非常低的情况下，其PSD图谱仍然有较高的信噪比，这说明该方法适宜于微量水平下的分析，对于2D-胶微量蛋白质点的鉴定尤为适用。
权利要求
1.磺基异硫氢酸苯酯作化学修饰剂在多肽序列测定中的应用，其特征在于将磺基异硫氢酸苯酯溶解在PH7.2-8.2的缓冲液中，制备成浓度为1-10mg/ml的溶液，取5-15ul于0.2mlEP管中，再将载有待测样品的ZipTip柱在其中吸上压下数次，使溶液保持在柱上，50℃保温15-20分钟，过量的修饰剂溶液用0.1％三氟乙酸水溶液洗5-10次，衍生物用2.5ml质谱分析洗脱液洗脱后作质谱分析用。
全文摘要
本发明涉及磺基异硫氢酸苯酯作化学修饰剂的应用。将磺基异硫氢酸苯酯溶解在pH7.2－8.2缓冲液中，制备成浓度1－10mg/ml的溶液，取5－15ul于0.2mlEP管中，将载有待测样品的ZipTip柱经加样器，使修饰剂溶液保持在柱上，经50℃保温，洗脱过量的修饰剂溶液，用质谱分析洗脱液洗脱下衍生物得质谱分析。本发明应用在采用质谱源后衰变(PSD)技术进行蛋白质及多肽的序列测定前的化学修饰，修饰后肽片段的PSD图谱中只出现y
文档编号G01N30/00GK1563978SQ200410023089
公开日2005年1月12日 申请日期2004年4月8日 优先权日2004年4月8日
发明者梁宋平, 陈平 申请人:湖南师范大学