专利名称：从有甲基-三硫代基团的化合物中制备抗肿瘤剂和抗生素的取代的二硫化衍生物及其靶形式的制作方法
技术领域：
本发明涉及LL-33288复合物的α1、α2、α3、α4、β1、β2、γ、δ和假糖苷配基组份的二硫化合物以及它们的衍生物，本发明也涉及称为BBM-1675、FR-900405、FR-900406、PD114759、PD115028、CL-1577A、CL-1577B、CL-1577D、CL-1577E、CL-1724抗生素的二硫化物化合物以及它们的衍生物，通过使抗生素与未取代或取代的烷基硫醇反应而制得这些衍生物。这些二硫化物化合物是有效的抗肿瘤剂。
本发明也阐述了由上列材料制得的二硫化物类似物的载体药物配对物。配对物的载体(具靶向性的)部分可以是下列形式单克隆或多克隆抗体;它们的碎片化学或基因处理过的对应物生长因子;或类固醇。本发明包括载体药物配对物的使用方法及其制备方法。
图1称为N-乙酰基LL-E33288 δI1的抗肿瘤抗生素的紫外光谱。
图2称为N-乙酰基LL-E33288 δI1的抗肿瘤抗生素的红外光谱。
图3称由N-乙酰基LL-E33288 δI1的抗肿瘤抗生素的质子核磁共振光谱。
图4称为N-乙酰基LL-E33288 δI1的抗肿瘤抗生素的C-13核磁共振光谱。
图5称为碘代LL-E33288假糖苷配基的抗肿瘤抗生素的紫外光谱。
图6称为碘代LL-E33288假糖苷配基的抗肿瘤抗生素的红外光谱。
图7称为碘代LL-E33288假糖苷配基的抗肿瘤抗生素的质子核磁共振光谱。
图8称为碘代LL-E33288假糖苷配基的抗肿瘤抗生素的C-13核磁共振光谱。
1986年5月28日公开的欧洲专利公报第0182152A3号描述了称为LL-E33288复合物的抗菌素和抗肿瘤剂族，并表明对其的专利。它们可用来制备二硫化物抗肿瘤剂，而二硫化物抗肿瘤剂也是本发明用作制备相应靶形式的一些起始物料。
欧洲专利公报第0182152 A3号阐述了LL-E33288复合物、它的组份，即LL-E33288 αBr1、LL-E33288 αI1、LL-E33288 αBr2、LL-E33288 αI2、LL-E33288 αBr3、LL-E33288 αI3、LL-E33288 αBr4、LL-E33288 βBr1、LL-E33288 βI1、LL-E33288 βBr2、LL-E33288 βI2、LL-E33288 γBr1、LL-E33288 γI1和LL-E33288 δI1，以及它们的制备方法，即采用Micromonospora echinospora ssp calichensis的新菌株或采用它们的天然突变体或派生的突变体通过需氧发酵生产出上述复合物及它的组份。欧洲专利公报第0182152 A3号也揭示了一些上列组份的可能结构式。这结构式列于表1中。
表1从自然界中分离得到的CH3-SSS-W的结构式(其中W是附在CH3-SSS-下面的取代基)
名称 R1R2R3R4R5R6R7XE33288α12Ar1R2′H H C2H5IE33288α13Ar1H H R4′IE33288β11Ar1R2′H R4′(CH3)2CH IE33288γ11Ar1R2′H R4′C2H5IE33288δ11Ar1R2′H R4′CH3IR33288βBr1Ar1R2′H R4′(CH3)2CH BrE33288γBr1Ar1R2′H R4′C2H5BrE33288αBr2Ar1R2′H H C2H5BrE33288αBr3Ar1H H R4′BrEsperamlcln A1CH3R2′R3′(CH3)2CH H Ar2Esperamlcln A2CH3R2′R3′(CH3)2CH Ar2HEsperamlcln A1bCH3R2′R3′CH3CH2H Ar2
在于1988年8月3日公开的欧洲专利公报第027485A2号中阐述并要求保护LL-E33288复合物族中的其它组成对于制备二硫化物衍生物和本发明抗肿瘤剂的靶形式同样是有用的。该申请阐述了LL-E33288系列中溴代-和碘代-假糖苷配基物，它们已经化学方法制得。该申请也阐述了通过硼氢化钠还原反应使C11位上的酮还原成羟基而从所有上列的抗肿瘤抗生素中得到二氢衍生物。后面物质的结构式列于表2中。
在我们同时提交的相关申请(30，553-01)中阐述并要求保护抗肿瘤抗生素LL-E33288族中的另一些组成，这些物质对于制备本发明中抗肿瘤剂另外一些靶型也是有用的。该申请阐述了用化学方法制得的LL-E33288复合物N-酰基衍生物的一些组成。它们的结构式同样列于表2中表2从表1化合物通过化学方法得到的CH3-SSS-W的结构式(其中W是附于CH3-SSS-下面的取代基)
R＝二氢或支链或非支链烷基(C1-C10)或亚烷基(C1-C10)、芳基或杂芳基、或任意地被一个或多个羟基、氨基、羧基、卤素、低级(C1-C2)烷氧基或低级(C1-C6)硫代烷氧基所取代的烷基(C1-C6)或杂芳基-烷基(C1-C6)基团。
在本发明中某些其它的抗肿瘤化合物和抗生素化合物是有用的，即1)埃斯波霉素(esperamicin)BBM-1676，一种强有力抗肿瘤抗生素的新种类。见J.Antibiotis，38，1605(1985)中M.Konishi，et，al作I物理化学数据和部分结构式。一种新的抗肿瘤抗生素复合物，见M.Kenishiet.al.，英国专利申请GB2，141，425A，1984年5月15日。
2)新的抗肿瘤抗生素，FR-90045和FR-90046I.Taxonomyoftheproducingstrain.M.Iuami，et.al.，J，Antiobiotics38，835(1985)。新的抗肿瘤抗生素FR-900405和FR-90046。Ⅱ.生产、分离、特征以及抗肿瘤活性。B，Kiyotoet.al.，J.Antibiotics，38，340(1985)。
3)PD114759和PD115028，有出众效力的新颖的抗肿瘤抗生素。Ⅰ.分离和特征。R.H.Bunge，et.al.，J，Antibiotics，37，1566(1984)。新颖的抗肿瘤抗生素PD114759和相关衍生物的生物和生化活性。D.W.Fryet.al.，InvestigationalNewDrugs，壬，3(1986)。
4)用Streptomyoessp.ATCC39363生产的新的抗生素复合物CL-1577A、CL-1577B。欧洲专利申请0，132，082，A2。
5)CL-1577D和CL-1577E抗生素抗肿瘤化合物，它们的生产及使用。美国专利4，539，203。
6)CL-1724抗生素化合物，它们的生产及使用。美国专利4，554，162。
7)从具疣的放线菌族(actinomoduraverrucosoporastrains)H964-92(ATCC39334)或AB27Y(ATCC39638)中发酵得到的新的抗肿瘤抗生素BBM-1675-A3和BBM-1675-A4。美国专利4，675，187。
8)具有抗微生物活性和抗肿瘤活性的新的N-乙酰基-埃斯波霉素A1、A2和A1b衍生物。欧洲专利第289，030。
上面所有关于BBM-1675、FR-900405、FR-900406、PD-114659、PD115028、CL-1577A、CL-1577B、CL-1577D、CL-1577E和CL-1724的信息，这些列出，仅供参考。爱斯波霉素A1、A1和A1b(BBM-1675复合物)以及它们相应的N-乙酰基衍生物的完整结构已在表1和表2中列出，上列的其它抗肿瘤抗生素的物理性质表明它们与爱斯波霉素的结构相同或极其相似，都含有一个甲基三连硫基官能团。
从上面揭示的结构中可以看出，α1、α2、α3、α4、β1、β2、γ1、δ和LL-E33288复合物的假糖苷配基组份、它们的二氢和N-酰基对应物、以及BBM-1675、FR-900405、FR-900406、PD114759、PD115028、CL-1577A、CL-1577B、CL-1577D、CL-1577E和CL-1724抗生素以及它们的N-酰基对应物在其结构上各自包含一个甲基三连硫代基团。
已经揭示使上述任一种抗生素与非取代或取代的烷基硫醇或芳基硫醇反应结果在三硫化物部分的甲基过硫化阴离子被取代形成了稳定的下面的二硫化物(反应式Ⅰ)。在1989年5月3日公开的欧洲专利第0313874A2号中揭示了适合于该转化形式的其它化合物。
根据反应式Ⅰ用含巯基的有机分子将表1和2中的化合物转化生产出用作抗生素和抗癌剂的新的化合物，在其右侧中W、R、R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R2′、R3′、R4′、R5′、Ar1、Ar2和X的定义与表1和表2中的定义相同，Sp是直链或支链的二价或三价(C1-C18)基团、二价或三价的芳基或芳杂基、二价或三价的(C1-C18)环烷基或杂环烷基、二价或三价的芳基(C1-C18)、或杂芳烷基(C1-C18)基团、二价或三价环烷基(C1-C18)或杂环烷基烷基(C1-C18)，或是二价或三价(C2-C18)不饱和烷基，其中如果Sp是三价基团，它另外可被氨基、烷氨基、芳氨基、芳杂氨基、羧基、低级烷氧基、羟基、巯基或低级烷硫基团所取代;Q是氢、卤(素)、氨基、烷氧基、二烷基氨基、芳氨基、杂芳氨基、哌啶子基、吡咯烷基、哌嗪基、羰基、硝基苯氧基羰基、羰醛基、低级氧基、羟基、硫羟基、低级烷基二羧酸基，或者Q是从下列基团中选出来的基团-CONHNH2、-NHCONHNH2、-NHCSNHNH2或-ONH2;只要Sp是亚乙基，Q不能是氢;如果CH-SSS-W是LL-33288α1-Br、α1-I、α2-Br、α2-I、α3-Br、α3-I、α4-Br、β1-Br、β1-I、β2-Br、β2-I、γ1-Br、γ1-I、δ1-I、BBM-1675、FR-900405、FR-90046、PD114759、PD115028、CL-1577A、CL-1577B、CL-1577D、CL-1577E或CL-1724且Sp是二价基团时，Q不能是氢、卤(素)、氨基、烷氧基、二烷基氨基、芳氨基、芳杂氨基、哌啶子基、吡咯烷子基、哌嗪子基或羰基。
作为本发明一个较好的实例，以名称为LL-E33288(CH-SSS-W)的抗肿瘤抗生素中制备式为Q-Sp-SS-W的二硫化物，其中
R5是CH3、C2H5或(CH3)2;X是碘原子或溴原子;R5是氢或RCO基团(其中R是氢、CH3或单取代的芳基)，Sp和Q的定义同上。
用多种含巯基的有机分子使列于表1和表2的化合物转化成各种二硫化物以得到新颖的抗肿瘤剂和抗生素。此外，从反应本身所得的产物可进一步引入新的侧链产生具有生物活性的更为新颖的化合物。
本发明的化合物除了用于抗肿瘤剂和抗生素外，它们对于在细胞水平评估抗瘤活性的新模式也是有用的。上列申请和专利阐述的天然取得的抗生素不含有充分强的发色单元所以它们在细胞内的区域不能定量表示。当使天然的三硫代甲基衍生物与含巯基分子反应时可产生对于研究DNA双链裂解及这类化合物的细胞定域有用的生化工具，含巯基分子另外还含有在电磁谱区域吸收或发射光而不被细胞发色团所遮掩的发色单元。相似地，通过该反应引入同位素标记也在本发明的范围里。因此，例如，当使E-33288C1-I与7-(2-硫代乙氨基)-4-甲基香豆素反应时，得到一个衍生物它在紫外光的照射下发出强烈的荧光，从而定位化合物处于细胞小室的区域。
在本发明的具体例子中，根据反应式Ⅰ用含巯基的有机分子将表1和表2中的化合物转变成另外用作分子探针的新组合物，其中W、R、R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R2′、R3′、R4′、R5′、Ar1、Ar2和X的定义与前面表1和表2的定义相同，Sp是直链或支链二价(C1-C18)基团、二价芳基或杂芳基、二价(C3-C18)环烷基或杂环烷基、二价芳基或杂芳基烷基(C1-C18)、二价环烷基或杂环烷基烷基(C1-C18)以及二价(C2-C18)不饱和芳基;Q是未取代或取代的二苯并噁嗪、若丹明、喹诺酮、甲基香豆素、荧光素或吖啶的发荧光核，或者Q是含有3H、14C、35S或32P同位素作为其结构式一部分的取代基。
也已发现列于表1和表2化合物及反应式Ⅰ描记的化合物的甲基三连硫代单元的取代可用来引入隔离物(Sp)，明智的选择是将靶单元引入到本申请的二硫化物衍化物中。在欧洲专利公报第0313873A号(1989年5月3日公开)中揭示了将靶单元引入到其它二硫化物衍生物中。因此，参照反应式Ⅰ，式CH3S S S-W化合物可首先与式Q-SP-SH化合物反应，(其中CH3S S S-W是名称为LL-33288αBr1、αI1、αBr2、αBr2、αI3、αBr3、αBr4、βBr1、βI1、βBr2、βI2、γBr1、γBr2、δI1、碘代或溴代的假糖配基，它们的二氢对应物或N-乙酰基对应物、BBM-1675、FR-900405、FR-900406、PD114759、PD115028、CL-1577A、CL-1577B、CL-1577D、CL-1577E、CL-1724或它们的乙酰基对应物的抗肿瘤抗生素)产生一间产物
其中Sp是直链或支链的二价或三价(C1-C18)基团、二价或三价芳基或杂芳基、二价或三价的(C3-C18)环烷基或杂环烷基、二价或三价的芳烷基(C1-C18)或杂芳烷基(C1-C18)、二价或三价的环烷基烷基(C1-C18)或杂环烷基烷基(C1-C18)或是二价或三价(C2-C18)不饱和烷基，其中如果Sp是三价基团，它另外还可被氨基、烷氨基、芳氨基、杂芳基氨基、羧基、低级烷氧基、羟基、巯基或低级烷硫基所取代，如果CH3-SSS-W是作为抗肿瘤抗生素LL-E-33288，α1-Br、α1-I、α2-Br、α2-I、α3-Br、α3-I、α4-Br、β1-Br、β1-I、β2-Br、β2-I、γ1-Br、γ1-I、δ1-I、BBM-1675、FR-900405、FR-900406、PD114759、PD115028、CL-1577A、CL-1577B、CL-1577D、CL-1577E或CL-1724的母体，Sp不能是二价基团;Q是，或可被转化为，卤素、氨基、烷氨基、羧基、羧醛基、羟基、巯基、α-卤代乙酰氨基、低级烷基二羧基、-CONHNH2、-NHCONHNH2、-NHCSNHNH2、-ONH2、-CON3′
条件是Sp
并且W如上述表1和表2所示。
只要从反应式中得到的产物含有至少一个官能团，它能转变成上列专利和申请的抗肿瘤抗生素的靶形式或直接与靶单元(Tu)反应形成上列专利的抗肿瘤抗生素的靶形式，就可有如下面反应流程Ⅱ所示的应用。
反应式Ⅱ其中Q、Sp和W与前面的定义相同，Tu是单克隆抗体或多克隆抗体、它的碎片、它的化学处理对应物或基因处理对应物、或是生长因子或类固醇;Y是蛋白质的侧链氨基、羧基或巯基、从碳水化合物残留物中衍生出来的醛或是酰氨烷基硫代基;n是从1至100的一个整数;让基团Q和Y直接进行或在以后的还原反应后进行共价反应形成Z，Z是-CONH-，-CONHN-CH-、-CONHNHCH2-，-NHCONHN＝CH-、-NHCONHNHCH2、-NHCSNHN＝CH-，-NHCSNHNHCH2-，-ON＝CH-，-NH-，-NHCH2-，-N＝CH-，-CO2-，-NHCH2CO2-，-SS-，
m是0.1至15作为例子并参照上述反应式Ⅱ，当N-乙酰基E-33288 γ21(Q＝CO2H，Sp＝-CH2CH2-)的3-巯基丙酸衍生物转化成它的活化的羟基琥珀酰亚胺形式时，在pH7.0-9.5水缓冲溶液中及在4℃-40℃温度间它可与赖氨酸残基的氨基(例如，Tu＝单克隆抗体，Y＝-NH2其中n＝50-100它能从赖氨酸残基中得到)发生作用产生抗生素的靶形式，它附属在蛋白质骨架链上的无规位置上(Tu＝单克隆抗体，Z-NHCO-，Sp＝-CH2CH2-，m＝1-10)。由于高负载常被认为不利于抗体的免疫活性，所以用该方法只对一部分赖氨酸残基进行取代。用其它的羧基活化剂诸如各种碳化二亚胺或相关的酰基叠氮化物从3-巯基丙酸衍生物中也可制备相同的无规取代的免疫结合物。可替换的是，如美国专利第4，671，958号所述的，在pH4-7间的缓冲水溶液内并在4℃-40℃间的温度下使N-乙酰基LL-E33288 δ21的3-巯基丙酰肼衍生物(Q＝H2NNHCO-，Sp＝-CH2CH2-)与氧化的高碘酸盐抗体(Tu＝单克隆抗体，Y＝-CHO，n＝1-15)反应时，反应只发生在醛官能团上(从位于抗体Fc端上碳氢化合物残基雌二醇(Vic、diols)的裂解中衍生出来)产生单克隆抗体结 ，它包含取代在蛋白质骨架特定位点上的药物(Tu＝单克隆乙 ＝CH NHNCO-，Sp＝-CH2CH2-，m＝0.5-10)。为了封闭抗体上未反应的醛基团从而避免交联，以及使易水解西佛氏碱(Schiff′s)键合稳定，最好(但不是必需的)使产生的结合物首先与诸如乙酰肼或酪氨酰肼反应，然后用氰硼氢化钠或硼氢化钠还原产生该发明稳定的构成物(Tu＝单克隆抗体，Z＝-CH2NHNHCO-，Sp＝-CH2CH2-，m＝0.5-10)。其它作为药物构成物部分的醛活性基团也在我们发明内以产生反应式Ⅱ的产物。这类官能团最好(虽然不限于)只能在酸性水溶液条件下与醛反应的基团。在碱性条件下蛋白质赖氨酸的活性足够强，结果它们的胺能与反应式Ⅱ产物共同竞争单克隆抗体的醛。可替换的醛活性基团是，例如，氨基脲、硫代氨基脲和O-取代的羟基胺官能团。
列于表1和表2化合物靶形式不只限于反应式Ⅱ所概括的顺序。首先可将靶单元(Tu)修饰成含有一个巯基，然后根据下列反应式Ⅲ使它与表1和表2的化合物反应
其中Tu、Y、Q、Sp、W、n和m的意义如前，P是氢或2-(吡啶硫基)，如果Y是Tu的氨基酸残基骨架上衍生出来的巯基，结合在一起的Z-Sp是共价键。
作为例子，参照上面反应式Ⅲ，可将单克隆抗体与3-(2-二硫代吡啶基)丙酸羟基琥珀酰亚胺酯反应通过赖氨酸残基来修饰蛋白质(Tu＝单克隆抗体，Y＝NH2，n＝50-100，Q＝-CO2Su，Sp＝-CH2-CH2-，P＝2-吡啶硫基)。与譬如二硫苏糖醇还原反应后就生成一个中间产物(Tu＝单克隆抗体，Z＝-NHCO-，Sp＝-CHCH，m＝1-15)该中间产物可与表1和表2的化合物反应产生相应的免疫结合物。相似地，可将2-亚氨基巯基烷(2-iminothiolane)与单克隆抗体反应在蛋白质的表面直接引入巯基，而不需要还原步骤(Tu＝单克隆抗体，Z＝-NHCO-，Sp＝-(CH2)3-，m＝1-15)，该中间产物可与前面表1和表2的化合物反应。可替换的是，在单克隆抗体结构内部的巯基呈半胱氨酸残基二聚的形式，它可直接用来参加反应式Ⅲ的反应。这类巯基传统上通过酶消化和天然单克隆抗体还原反应的结合使之露出，但是，同样可期望使用含未成对半胱氨酸残基的单克隆抗体的遗传变化结构。
本发明靶衍生物的较好例子是下式的蛋白质一药物配对物
它是从一类称为LL-E33288(CH3SSS-W)的抗肿瘤抗生素中制得的，包括用式为Q-Sp-SH的化合物取代二硫代甲基部分(其中Sp是直链或支链的二价或三价(C2-C10)基团或是二价或三价的(C2-C5)芳烷基或杂芳烷基，其中如果Sp是三价基团，则它另外还可被氨基、杂芳氨基、羟基或巯基所取代;Q是羰基、低级烷基二羧酸、酐、-CO2Su、-CON NH2，或
产生一个通式为Q-Sp-SS-W的中间产物(其中Q、Sp和W的定义同前所述)，使Q-Sp-SS-W与式为Tu-(Y)n的分子反应(其中Tu是单克隆抗体，它对人体的肿瘤相关抗原表现出优良的反应性;Y是抗体上的侧链氨基，或是通过使抗体上的碳水化合物基团氧化而形成的醛;n是1-100的整数)产生下式化合物
其中Tu、Y、Sp、W和n的定义如前所述，Z是使基团Q和Y直接进行或经还原后进行共价反应而形成的，Z是-CONH-、-CONHN＝CH-、-CONHNHCH2-或
m是0.1-15。
许多不同的单克隆抗体(MoAbs)可用作甲基三链硫代抗癌化合物的靶。MoAbsLym1和Lym2可认出在成熟的B-淋巴细胞和其引起的淋巴癌上的不同抗原。在A.L.Epstein，et.al.“癌症研究”47830(1987)述了这些MoAbs的生产及特征。虽然已注意到MoAbB72腺癌、卵巢癌和肺癌的反应，但它主要是乳腺癌和结肠癌为目标的。该抗体已在T.L.Klug，et.al.，“Int，J.Cancer”38661(1986)中进行了揭示。1986年7月3日提交的欧洲专利申请86401482.4中阐述了MoAbCT-M-01，它主要是识别乳腺肿瘤，通过使产生CT-M-01的杂交系次级克隆生产MAC-68，它可识别乳腺癌和结肠癌。在实验部分阐述了主题化合物的中间产物以及化合物抗体配对物。但是，不能就此断言本发明仅限于前述抗体。相反，该方法适用于所有的抗体而不管它们的分类，它们的酶促派生碎片、它们的化学处理及化学稳定碎片以及它们相应的嵌合和人工的配对物。靶单元也不是仅限于单克隆抗体。其它蛋白质以及感受器在靶出口上的小分子，这些都在我们揭示的靶整体的范围里。
本发明的Q-Su-SS-W化合物是活性的抗生素。通过标准琼脂稀释法能测定它们在体外对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的抗菌活性。将含有各种浓度抗生素的Mueller-Hinton琼脂放在佩特里细菌培养皿中，培养皿中抗生素的浓度以稀释二倍依次递减。用Steer折转装置将1-5×104细菌菌落构成单位接种到琼脂的表面。在约36℃下接种约18小时后记录抑制菌株生长的化合物的最低浓度为那种菌株的最小抑制浓度(MIC)。
上述的二硫化物化合物是活性的抗肿瘤剂。
国家癌症机构(NationalCancerInstitute)已制定了特定的体外试验系统和草案以测试化合物作为抗瘤剂时的稳定性。在“CaneerChemotherapyReports”第Ⅲ部分，第3卷，No.2(1972)，Geran.etal.中已经进行报告。这些草案建立了标准化筛选试验，而这些试验在抗肿瘤剂的试验领域中通常是需要的。在这些系统中，淋巴细胞白血病P388、黑色素黑瘤B16，L1210白血病和结肠26腺癌对本发为重要。这些肿瘤作为小鼠的可移值肿瘤用于试验。总的来说，在这些草案中用被治疗过动物(T)的平均存活时间超过对照动物(C)的平均存活时间的百分增长率来显示有效的抗肿瘤活性，它表明人类白血病和固体肿瘤有相似的结果。
淋巴细胞白血病P388试验使用的动物是BDF雌性小鼠。每试验组有5或6个小鼠。在第0天腹膜内注射0.5毫升含1×10淋巴细胞白血病P388的细胞的稀腹水液体来移植肿瘤，在第1天、第5天和第9天(相应于肿瘤接种)以指示的剂量用0.5毫升体积的无菌无发热原的盐水溶液腹腔内注射试验化合物。给小鼠称重并按30天记录的规律记录存活者。计算存活时间中值及被治疗动物(T)/对照动物(C)的存活时间比率。当T/C大于或等于125时它被认为具有有效的抗肿瘤活性。结果如表3所示。
表3淋巴细胞白血病P338试验化合物剂量存活中值T/Cx100(mg/kg)(天)%LL-E33288 γ1-1 0.005 145的丙酸二硫化物0.0025125(从实施例7中得到)LL-E33288 γ1-1 0.010 135的4-硝基苯基丙酸酯二硫化物0.005185(从实施例8中得到)0.00251500.00125130LL-E33288 γ1-1 0.010 24.5 223的7-(2-巯基乙氨基)-4-0.00528.5259甲基香豆酮二硫化物0.002526.0236(从实施例9中得到)0.0012521.01910.000618.51680.000316.5150对照-11.0-LL-E33288 γ1-1 0.005 18.0 164的3-巯基丙酰肼的二硫化物0.002525.0125(从实施例10中得到)0.0012519.01730.000615.5141对照-11.0-LL-E33288 α3-1 0.040 15.0 136的3-巯基丙酰肼二硫化物0.020123(从实施例12中得到)对照-11.0-
表3(续)淋巴细胞白血病P338试验化合物剂量存活中值T/Cx100(mg/kg)(天)%N-乙酰基0.08021.0175LL-E33288 γ1-1 0.040 18.0 150的3-巯基丙酰肼二硫化物0.02015.0125(从实施例13中得到)对照-12.0-LL-E33288 α2-1 0.010 16.5 230的3-巯基丙酰肼的二硫化物0.00521.0183(从实施例14中得到)0.002518.51610.0012518.5161LL-E33288 γ1-1 0.005 28.5 190的3-巯基丁酰肼二硫化物0.002523.0153(从实施例16中得到)0.0012521.01400.000619.5130LL-E33288 q1-1 0.010 26.5 252的3-巯基丙酰肼的二硫化物0.00518.0171(从实施例17中得到)0.002517.01620.0012516.01520.000613.01240.000314.0133LL-E33288 q1-1 0.005 24.0 200的4-巯基二氢肉桂酰肼二硫化物0.002528.0233(从实施例18中得到)0.0012525.52130.000618.51540.000317.5146对照-12.0-
黑色素黑瘤B16试验动物使用BDF雌性小鼠。每组有5或6个小鼠。在10毫升冷平衡的盐溶液中使1克黑色素黑瘤B16均匀并取0.5毫升均匀的水液腹膜内移植每个试验小鼠。在第1-9天(相应于肿瘤接种而言)以指定的剂量腹膜内注射试验化合物。给小鼠称重并按60天的规律记录存活者。计算存活时间中值以及被治疗动物(T)/对照(C)动物的存活时间比率。T/C值大于或等于125时被认为具有有效的抗肿瘤活性。
用本发明的种种方法(用来生产与表1和表2化合物结合的称为
的单克隆抗体共轭物)能得到一些结构物，它们与靶细胞系保持了良好的免疫反应性，正如下列体外测定所述靶细胞将所有靶细胞保存在RPMI 1640培养基中，该培养基以5%Fetal Calf血清(FCS)、IST(Collaborative Research，Cat＃40351)、链霉素(50μg/ml)、青霉素(50国际单位/毫升)、硫酸庆大霉素(50μg/ml)和谷酰胺(0.03%)作为供给。将细胞保存在湿润的含5%CO2，37℃的孵箱内。
Ⅰ.免疫反应测定方法Ⅰ-Elisa收集合适的靶细胞并计数，使之悬浮在对测定单克隆抗体(MoAb)最佳浓度的Dulceco′s磷酸盐缓冲盐溶液中。在无菌组织培养聚苯乙烯96-坑体板的每个坑里加入0.1毫升细胞。让平板在1，000转/分下离心5分钟并弹去浮在表层的物质。让平板空气干燥过夜并可在4℃下贮存3个月。
通过在每个坑里加入200μl1%的明胶DPBS溶液，并将平板放在湿润的孵箱中在37℃下孵化1小时来封闭非特定结合位点(在相似的条件下进行所有其它的孵化)。用250μl的0.05%吐温-20DPBS溶液(洗涤溶液)将平板洗涤一次，洗涤用来自Dynatech(超级洗涤Ⅱ)的ELISA自动洗涤系统。在0.1%明胶-DPBS溶液中，将试验样品稀释成最终浓度为3μg/mlMoAb当量。从每个3μg/ml样品中另制备六个三倍系列的稀释物，并将100μl-式三份地加到适当的坑中。底下的一排坑只放100μ10.1%的明胶液作为背景。让平板孵化45分钟然后洗涤三次。将碱性磷酸酶配对的亲合纯化的山羊抗小鼠免疫球蛋白(CappelCat＃8611-0231)以1∶125的比率在0.1%的明胶溶液中稀释，并取100μl加至每个坑里。将平板孵化45分钟，然后洗涤三次。将200μl磷酸对一硝基苯酯基质溶液(见下面)加到每个坑中。室温下保持45分钟后，通过加入50μl3MNaOH来停止反应。在从Dynatech来的自动化分光光度仪(EIAAutoreader＃EL-310)上，在405mm下读出每个坑内含物的吸收值。
基质二乙醇胺缓冲液(10%)97毫升二乙醇胺800毫升水0.2克NaN3100毫克Mg Cl2·6H2O通过连续搅拌使试剂溶解并加入1MHCl直至pH达9.8。用水将总体积调整至1升并用0.2μ滤纸过滤灭菌。将缓冲液在4℃下黑暗中贮存。在使用前夕才将磷酸对-硝基苯酯溶于二乙醇胺的缓冲液中(必须在室温下)使最终浓度为1mg/ml。
光密度值的计算用下列等式计算每个样品的结合百分率(A-B)/(C-B) ×100＝结合%A＝试验样品的平均光密度B＝背景的平均光密度C＝浓度为3μg/ml来处理MoAb对照物的平均光密度在半对数图的非对数轴上划分结合%并在对数轴上划分Mo Ab浓度。从图中找出每个试验样品的BD50(即造成50%结合所需的抗体剂量)，通过下式算出免疫反应性的保留量。
(对照的Mo Ab的BD50)/(试验样品的BD50) ×100=保留的免疫反应活性％方法2-非直接放射免疫分析法(RIA)将适当量的在0.2毫升10%FCS培养基中的靶细胞分装到4毫升聚苯乙烯试管中。使试验样品稀释成在10%FCS培养基中的2μg/mlMo Ab当量浓度。在每个2μg/ml样品中仅制备5个三倍系列的稀释物，每个稀释物0.2ml一式二份加到试管内。背景样品仅含细胞和基质。在4℃下使细胞孵化1小时，然后用2%FCS培养基洗涤2次(所有RIA洗涤都用3毫升2%的FCS基质)。在每个试管内加入0.05毫升含有约500，000 CPM′S绵羊F(ab′)抗小鼠Ig G[125I](Dupont，Cat＃NEX 162-0142);使细胞在4℃下再孵化1小时，用2%FCS洗涤一次，用PBS洗涤二次。在每个试管中加入0.5毫升PBS，让细胞打旋，转移到清洁的试管中并在PackardGamma 500上计数1分钟。
除了用CPM′s取代光密度单位，C＝1μg/ml(未处理MoAb对照的平均CPM′s外，用与前述ELISA等式相同的方法测定并作图测出每个结合%值，每个样品的保留免疫反应性%如前面讨论的那样计算。
方法3-直接RIA取适当量的在1毫升10%FCS培养基中的靶细胞分装到4毫升的聚苯乙烯试管中，离心并弃去浮在上面的东西。稀释试验样品使其在10%FCS培养基中的浓度为200μg/ml Mo Ab当量。从每个200μg/ml样品中另制得五个五倍量系列的稀释物，0.05ml各稀释物两份地加入试管中。向每个试管内加入0.05毫升125I-Mo Ab(对于每个Mo Ab和每一批应分别决定其用量)。阳性对照样品中含有细胞、培养基和125I-Mo Ab。背景样品中含有非特定的细胞、培养基和125I-Mo Ab。在40℃下将细胞孵化1小时，用2%FCS培养基洗涤一次，用PBS洗涤二次，用前述相同的方法转移并计数。
用下式计算每个样品125I-Mo Ab结合抑制%(A-B)/(C-B) ×100＝125I-Mo Ab结合抑制%A＝样品的平均CPM′SB＝背景的平均CPM′SC＝阳性对照的平均CPM′S除了BD50实际上是BID50外(造成50% I-Mo Ab结合抑制所需的Mo Ab剂量)，用前面讨论的方法计算划分每个样品保留的免疫反应性。
注解1)在放射免疫分析中加入每种试剂后马上强力旋转试管。
2)在每套分析中引入相当于50%未处理的MoAb对照的内部对照样品以确证在推断免疫反应的配对物保留中每个过程是否都是定量的。
这些分析的结果列于表4表4MoAb配对物的免疫反应性用LL-E33288 αI3未修饰Mo Ab对照物的3-巯基丙酸二硫的免疫反应性%化物的酰肼产物的非特定制备配对物(实施例6)与下列物质配对Lyml78CT-M-0181N-乙酰基-LL-E33288 δI1的3-巯基丙酸二硫化物的酰肼(实施例7)与下列物质配对制备未修饰MoAb对照物的免疫反应性%Lyml82CT-M-01100B72.3100LL-E33288 αI2的-巯基丙酸二硫化物的酰肼(实施例8)与下列物质配对CT-M-0156
表4(续)MoAb配对物的免疫反应性碘代LL-E33288假糖苷配基的3-巯基丙酸二硫化物的酰肼(实施例9)与下列物质配对CT-M-0150LL-E33288 δI1的3-巯基丁酸二硫化物的酰肼(实施例10)与下列物质配对Lyml73LL-E33288 δ31的3-巯基异戊酸二硫化物的酰肼(实施例11)与下列物质配对制备未修饰MoAb对照物的免疫反应性%Lyml64%LL-E33288 δI1的对-巯基二羟基内桂酸二硫化物的酰肼(实施例12)与下列物质配对Lyml61%本发明的单克隆抗体配对物是活性的抗癌剂。下面所述的分析用于分析体外的细胞毒性，它显示相对于非靶细胞而言靶细胞系构成物的显著适用性，它提供了比较与化合物非靶形式的化合物靶形式的利用方法。
细胞毒性分析体外将样品稀释成与母体药物等当量浓度，即0.2或0.02μg/ml(起始浓度视待试验的细胞系及母体药物的效力而定)。从每个原始样品稀释液中另制得三份或四份五倍量的稀释液并取出0.2毫升加到消毒的15毫升聚苯乙烯试管中。在每次分析中至少包括一个由母体药物与不相关的Mo Ab组成的相似配对物以测定相关配对物的特异性。将105个在0.2毫升10%CFS培养基中的靶细胞等分加入各试管内并旋转。另外，上述试验用不相关细胞作为靶来进行以进一步确证相应配对物的特异性。收集到的Mo Ab对照物与在10%FCS培养基中收集到的Mo Ab和阳性对照样品等当量。
将细胞在37℃下孵化7分钟，然后用8毫升2%FCS培养基洗涤4次。在每个试管中加入0.1毫升10%FCS，旋转细胞，然后在无菌的96-坑聚苯乙烯细胞培养平板的每个坑内加入0.2ml。
将平板在湿润的37℃孵卵器中用5%CO2孵化2天。除去一半培养基并用含有2微居里/毫升3H胸腺嘧啶脱氧核苷(Dupont，NEN，Cat ＃ NET-027)的新鲜培养基而取代。继续孵化24小时，将细胞冷冻、解冻并用PHD细胞收集器(Cambridge Technology，Inc.)收集。在Beckman LS5800闪烁记数器的第1道上使每个样品记数1分钟。
如下计算生长抑制%(试验值的平均CPM)/(培养基对照的平均CPM) ×100＝生长%100-生长%＝抑制%在半对数图上将抑制%划在非对数轴上，将母体药物浓度划分在对数轴上。从图上找出每个试验样品的IC50(引起50%抑制的母体药物浓度)，用下式计算出细胞毒性的残留量。
(母体药物的IC50)/(试验样品的IC50) ×100=残留的细胞毒性％将体外细胞毒性分析的结果制成下表5。
表5MoAb配对物的体外细胞毒性MoAb细胞毒性用实施例6的产物 %LL-E33288 αI3与Lyml500的酰肼配对物CT-M-01300用实施例7的%N-乙酰基LL-E33288 δI1产物与Lyml400的酰肼配对物CT-M-01700MoAb细胞毒性用实施例8的%实施例8产物产物与CT-M-01-18的酰肼配对物用实施例9的%实施例9的产物产物与CT-M-01100的酰肼配对物用实施例10的%实施例10的产物产物与Lyml400的酰肼配对物用实施例11的%实施例11的产物产物与Lyml320
的酰肼配对物用实施例12的%实施例12的产物产物与Lyml560的酰肼配对物下列分析系统用来测量本发明配对物的体内活性。
在无胸腺(裸)小鼠上异种移植人体肿瘤来进行药物-单克隆抗体配对物抗肿瘤活性的体内试验。
从培养烧瓶中采集Burkitt淋巴瘤细胞(Raji)和骨髓瘤细胞(HS Sultan)并使之在试验小鼠内皮下孵化(≥80×106Raji细胞或40×106HS Sultan细胞)。让固体肿瘤、卵巢癌(CA73，Ovcar-3)、乳腺癌(MX-1)和结肠癌(L S174 T)在无胸腺小鼠内繁殖、切除，割成2mm3大小的碎片再皮下移植到试验小鼠内(每只小鼠5-8个碎片)。
移植在肿瘤植入后第2、3、4、6、7或8天起，对动物每3天腹腔内分别注射药物、单克隆抗体和药物-单克隆抗体配对物，总共作三次或五次。用FowlerultraCALII电子卡尺在植入肿瘤的4-6周内每隔7天测量肿瘤(肿瘤的长度和宽度)。从下式算出肿瘤的质量(长度(mm)×高度(mm))/2计算每试验组的控制百分率[治疗过(T)的平均mg除以对照(C)的平均(mg)×100]，作为肿瘤生长的抑制指标。T/C值≤42%，并且存活动物率≥65%被认为具有活性。
该分析结果列于表6中。
表6体内抗肿瘤试验结果剂量(mcq)肿瘤大小S/TMoAb药物(T/C)控制LL-E33288 αI32.8 0.75 1.3 6/6的3-巯基丙酸二硫化物的酰肼与Lyml配对物只有LL-E33288αI3- 0.75 365 6/6只有酰肼-0.753306/6只有MoAbLym28-686/6腹腔内注射对人体Burkitt淋巴瘤细胞系RajiTC进行治疗，治疗在肿瘤植入后7天起开始，共进行三次注射，在肿瘤植入后28天时进行测量。
表6(续)剂量(mcq)肿瘤大小S/TMoAb药物(T/C)控制%LL-E33288 αI30.3 2.0 0.02 6/6的3-巯基丙酸二硫化物酰肼与CT-M-01配对物只有LL-E33288 αI3- 2.0 - 0/6只有MoAbCT-M-0183-755/6长春新碱(阳性对照)-201.25/5对人体乳腺癌细胞系M×01腹腔内注射治疗，肿瘤植入后2天起开始共三次，在肿瘤植入后35天进行测量。
LL-E33288 δI1的N- 50 0.22 23 7/7｛[(4-甲基香豆素-7-基)-氨基]乙酰基｝半胱氨酸二硫化物的酰肼与Lyml配对物只有酰肼-0.222284/7只有MoAbLyml50-617/7混合物、酰肼加MoAb500.22567/7Lym1对人体Burkitt淋巴瘤细胞系RajiTC腹腔内注射治疗在植入肿瘤后7天起开始，共三次，在肿瘤植入后的35天测量。
表6(续)剂量(mcq)肿瘤大小S/TMoAb药物(T/C)控制%N-乙酰基LL-1251.006/6E33288 δI1的3-巯基丙酸二硫化物的酰肼与Lyml配对物只有酰肼-2.0713/6混合物，N-乙酰基1251.051/6LL-E33288 δI1加上MoAbCT-M-01N-乙酰基LL--1.0462/6E33288 δI1对人体乳腺癌系MX-1静脉注射治疗在植入肿瘤后的第2天开始，共计三次，在肿瘤植入后的42天开始测量。
表6(续)剂量(mcq)肿瘤大小S/TMoAb药物(T/C)控制%
N-乙酰基LL-371.0116/6E33288 δI1的3-巯基丙酸二硫化物的酰肼与Lyml配对物只有酰肼-1.05176/6只有N-乙酰基LL--0.52266/6E33288 δI1只有MoAbLyml37-1786/6对人体Burkitt淋巴瘤细胞系RajiTC静脉注射治疗，植入肿瘤后第7天开始共三次，肿瘤植入后第35天进行测量。
N-乙酰基LL-1272.7616/6E33288 δI1的3-巯基丙酸二硫化物的酰肼与B72.3配对物只有N-乙酰基-2.0321/6LL-E33288 δI1只有MoAbB72.3127-1256/6长春新碱(阳性对照)-20236/6对人体结肠癌细胞系LS174T静脉注射治疗，在肿瘤注入后第8天开始共三次，肿瘤植入后第21天进行测量。
表6(续)剂量(mcq)肿瘤大小S/TMoAb药物(T/C)控制%N-乙酰基LL-1122.7405/6E33288 δI1的3-巯基丙酸二硫化物的酰肼与
CT-M-01配对物只有N-乙酰基LL--2.0321/6E33288 δI1长春新碱(阳性对照)-20236/6对人体结肠癌系LS174T静脉注射治疗植入肿瘤后第8天开始，共三次，肿瘤植入后第21天进行测量。
LL-E33288 αI1的 24 1.0 0.33 2/63-巯基丙酸二硫化物的酰肼与CT-M-01配对物只有酰肼-1.0-0/6对人体乳腺癌细胞系MX-1静脉注射治疗，植入肿瘤后第2天开始，共三次，注入后第35天进行测量。
本发明将结合下列不被限制的实施例进行进一步的阐述。
实施例1LL-E33288 γI1的3-巯基丙酸二硫化物将106毫克3-巯基丙酸在1毫升乙腈中的物质加到90毫克LL-E33288 γI1在90毫升乙腈中的溶液中。旋转溶液，然后在-20℃下贮存6天。真空除去溶剂，残留物用10毫升硅胶(二氯甲烷内装柱)进行色谱层析。色柱依次用50毫升二氯甲烷、50毫升含4%甲醇的二氯甲烷中及100毫升含8%甲醇的二氯甲烷进行洗脱。将最后的洗脱剂馏分蒸干得到残留物，使之溶于辅于少量丙酮的乙酸乙酯中，向内滴加入过量己烷。收集沉淀物并干燥给出39毫克所需的产物(FABMS，M+H 1394)。
实施例2LL-E33288 γI1的对-硝基苯基3-巯基丙酸二硫化物A)3-巯基丙酸对-硝基苯酯的制备将含催化量浓硫酸在二氯甲烷中的市售的3-巯基丙酸用异丁烯处理20分钟。然后该溶液用IN碳酸氢钠萃取。在这之后用无水硫酸镁干燥二氯甲烷溶液。蒸发溶液得到一种无色流动的液体，其NMR和质谱数据表明它是S-叔丁基巯基丙酸，叔丁酯。
该酯的等分部分在用6N盐酸的二噁烷液的回流2.5小时蒸去溶剂，加入乙酸乙酯并用碳酸钠萃取该溶液。用6N盐酸处理碳酸钠萃取物直至悬浮液的pH为2.0。然后悬浮液用乙酸乙酯萃取，萃取液用无水硫酸镁干燥，蒸去溶剂得到一种无色液体，其1H NMR和质谱数据表明它是S-叔丁基巯基丙酸。
在四氢呋喃中用等摩尔的对-硝基苯酚和二环己基碳化二亚胺处理4小时使该化合物转变成对-硝基苯酯。通过过滤除去产生的二环己基脲素，蒸干滤液得油状产物，并用中性硅胶以己烷∶二氯甲烷(50∶50)溶剂系统纯化。纯净的对-硝基苯酯衍生物是淡黄色的、流动的油状物质。
下列方法可以暴露游离的硫醇。将S-叔丁基巯基丙酸对-硝基苯酯溶于三氟乙酸并加入摩尔稍过量(10%)的乙酸汞。让混合物搅拌30分钟，然后蒸去三氟乙酸并让残留物溶于二甲基甲酰胺中。用硫化氢将溶液处理15分钟，然后滤去黑色的硫化汞，减压蒸发滤液以除去99%的二甲基甲酰胺。所得的淡褐色流体状的液体经中性硅胶用己烷∶二氯甲烷(50∶50)纯化。经1H NMR所显示主要成分是含有少量叔丁基巯基衍生物。在串联的二根Perkin-Elmer Pecosphere C18柱上用37.5/62.5-47.5/52.5的乙腈梯度系统和pH为6.5(乙酸)的0.1M乙酸铵缓冲液在12分钟内进行高压液相色谱分析，结果表明产物是88% 3-巯基丙酸对-硝基苯酯和10%低极性S-叔丁基巯基丙酸对-硝基苯酯。也有少量的游离对-硝基苯酚存在。
(B)3-巯基丙酸对-硝基苯酯与LL-E33288 γI1反应将100毫克LL-E33288 γI1溶于毫升乙腈中。将25.7毫克3-巯基丙酸对-硝基苯酯在1毫升乙腈中的溶液加进去。在-20℃下让反应进行48小时。HPLC指示反应完全。让溶液蒸发至干并用声波作用使残留物溶于4-5毫升乙酸乙酯中。让混合物过滤，将滤液滴入45毫升搅拌着的己烷中，收集所得的淡黄色固体并减压干燥得到93毫克由1H NMR测定的LL-E33288 γI1的丙酸对-硝基苯酯衍生物。在FABMS测定中[M+H]离子出现在m/z＝1515。
用50%乙腈/0.1M乙酸铵水液的C18反转相HPLP的保留时间是18分钟(LL-E33288 δI1是8分钟，酯水解产物是1.5分钟)。
实施例3LL-E33288 γI1的N-羟基琥珀酰亚氨基3-巯基丙酸二硫化物在5毫克3-巯基丙酸二硫化物(欧洲专利公报中已知的LL-E33288 γI1的类似物)在0.5毫升四氢呋喃中的溶液内，先加入0.45毫克N-羟基琥珀酰亚胺在0.1ml四氢呋喃中的溶液，后再加入1.8mg三环己基碳基二亚胺在0.2ml四氢呋喃中的溶液。让反应在室温下搅拌4小时，然后用大量己烷中止反应。过滤分离固体并使之溶于乙酸乙酯中。所得的溶液用盐水洗涤三次，用硫酸镁干燥并蒸发得到5毫克所需的产物，它为棕褐色粉末不用进一步纯化。用40%乙腈/0.1M乙酸铵水溶液的反转相C18HPLC上的保留时间是15分钟。(起始物料的保留时间是6.0分钟)。
实施例4LL-E33288 γI1的3-巯基丙酰肼二硫化物在通氩气下，向回流着的5.4毫升(3eq)无水酰肼在100毫升四氢呋喃溶液中，2小时里，滴加9.2毫升(83毫摩尔)3-巯基丙酸甲酯在50毫升四氢呋喃中的溶液。再让溶液回流2小时，蒸干，然后用300毫升甲苯稀释蒸发两次。产物置在用5%乙酸乙酯/氯仿装柱的硅胶塞上并用20%甲醇/氯仿液洗脱。所得的3-巯基丙酰肼是淡桃红色油状产物，冷却时它固化但在室温下融化。
将在1毫升四氢呋喃中的6.6毫克3-巯基丙酰肼加到50毫克LL-E33288 γI1在50毫升乙腈中的溶液内。加入1当量三乙胺或1当量三乙胺和1当量乙酸。让反应在0℃下搅拌进行1小时，然后蒸去溶剂。用10-15%在氯仿中的甲醇梯度在硅胶上使残留物进行色谱层析得到26毫克所需产物。FABMS，m/z＝1408(M+H);反转相C18HPLC的保留时间＝5.0分钟(在41%乙腈/0.1M乙酸铵水溶液中)。
实施例5LL-E33288 γI1的N-｛[(4-甲基-7-香豆素基)氨基]乙酰基半胱氨酸酰肼二硫化物将1.0克(5.7毫摩尔)4-甲基-7-氨基香豆素、3.0毫升溴代乙酸乙酯(5eq)、90毫克(0.1eq)碘化钠和30毫升二甲基甲酰胺的混合物在通氩气下于80℃加热5小时。让混合物冷却，用乙醚稀释，用50%盐水洗涤三次，用硫酸镁干燥并蒸干。将粗产品溶于含1%乙酸乙酯的氯仿中并经过硅胶塞子过滤。用含有痕量氯仿的乙醚重结晶得到纯净的N-[(4-甲基-7-香豆素基)氨基]乙酸乙酯。
将10毫升1N的氢氧化钠水溶液加到1.96克(7.5毫摩尔)上述酯在15毫升甲醇及15毫升四氢呋喃的溶液中。30分钟后加入4毫升10%盐酸水溶液。蒸去有机溶剂并过滤得到结晶产物，用冷乙醇然后用醚洗涤。将该物质溶于20毫升四氢呋喃和4毫升二甲基甲酰胺中。加入二环己基羰基二咪唑(1.3克，2.2eq)并让反应搅拌进行15分钟。然后加入半胱氨酸乙酯氢氯化物(1.6克，2.5eq)和三乙胺(1.2毫升)。再过三小时后，用含有5%二氯甲烷的醚稀释反应液，用10%盐酸水液洗涤一次用盐水洗涤二次。用硫酸镁干燥后蒸去溶剂，通过使其溶于含有微量乙醇的氯仿中，然后加入过量的醚使粗产品结晶出来。过滤结晶并干燥得到纯净的N-｛[(4-甲基-7-香豆素基)氨基]乙酰基｝半胱氨酸乙酯。
在通氩气下使5毫升氯仿、20毫升甲醇和0.4毫升酰肼水合物加热回流。向内加入550毫克N-｛[(4-甲基-7-香豆素基)氨基]乙酰基｝半胱氨酸乙酯。回流9小时后让混合物冷却并滤得固体产品，用氯仿然后用乙醚洗涤。将粗产品(它含有硫醇和二硫化物)溶于含有二硫代苏糖醇和三乙胺的二甲基甲酰胺中。30分钟后用过量乙醚使产品析出并通过过滤收集。用含有二硫苏糖醇和痕量三乙胺的脱气乙腈重结晶使物质进一步纯化得到纯净的N-｛[(4-甲基-7-香豆素基)氨基]乙酰基｝半胱氨酸酰肼。
在0℃下将在1.2毫升二甲基甲酰胺中的4毫克N-｛[(4-甲基-7-香豆素基)氨基]乙酰基｝半胱氨酸酰肼加到12毫克LL-E33288 γI1在12毫升乙腈的溶液中。搅拌过夜后再加入0.6毫升二甲基甲酰胺中的2毫克N-｛[(4-甲基-7-香豆素基)氨基]乙酰基｝半胱氨酸酰肼。让反应在0℃下搅拌3天并过滤。蒸去乙腈，所得的二甲基甲酰胺用过量1∶1己烷/醚稀释。过滤分离产物，用15-20%梯度的甲醇氯仿溶液通过硅胶色谱层析进一步纯化得到3毫克所需的产品。用45%乙腈/0.1M乙酸铵水溶液的反转相C18HPLC上的保留时间为3.5分钟(在同样系统中LL-E33288 δI1是15.5分钟)。
实施例6LL-E33288 αI3的3-巯基丙酰肼二硫化物。
在-15℃下将在1毫升乙腈中的6.6毫克3-巯基丙酰肼加到10毫克LL-E33288 αI3在9毫升乙腈的溶液中。加入1当量三乙胺或1当量三乙胺和1当量乙酸。让反应在0℃下进行1小时，然后蒸去溶剂。残留物用10-15%梯度的甲醇氯仿液通过硅胶色谱层析纯化给出所需的产物。
FABMS。m/g-1251(M+H);在45%乙腈/0.1M乙酸铵的系统中，反转相C18HPLC上的保留时间是2.1分钟(在相同系统中LL-E33288 αI55.7分钟)。
实施例7N-乙酰基LL-E33288 γI1的3-巯基丙酰肼在-15℃时，将在85微升乙腈中的1.5eq3-巯基丙酰肼加到10毫克N-乙酰基LL-E33288 γI1在10毫升乙腈中。加入1当量三乙胺。让反应在0℃下进行2小时并蒸去溶剂。残留物用10-15%在氯仿中的甲醇梯度在硅胶上色谱层析纯化得到所需的产品。FABMS，m/z＝1450(M+H);用50%乙腈/0.05M磷酸二氢铵在C18反转相HPLC上的保留时间是2.5分钟(在同样的系统中N-乙酰基LL-E33288 γI1的保留时间是6.6分钟)。
实施例8LL-E33288 αI2的3-巯基丙酰肼二硫化物在-15℃下将在1毫升乙腈中的1.5eq 3-巯基丙酰肼加到10毫克LL-E33288 αI2在10毫升乙腈中去。加入1当量三乙胺。让反应在0℃下搅拌进行，然后蒸去溶剂。用5-15%在氯仿中的甲醇梯度在硅胶上色谱层析使残留物纯化得到所需的产品。FABMS，m/z＝1248(M+H);用58%乙腈/0.05M磷酸二氢铵水溶液在C18反转相HPLC上的保留时间是2.6分钟(LL-E33288 αI2在相同系统中的保留时间是7.5分钟)。
实施例9碘代LL-E33288假糖苷配基的3-巯基丙酰肼二硫化物在-15℃下将在1毫升乙腈中的1.5eq3-巯基丙酰肼加到10毫克碘代LL-E33288假糖苷配基在9毫升乙腈中。加入1当量三乙胺作为催化剂。让反应在0℃下搅拌进行1小时，然后蒸去溶剂。用残留物用10-15%在氯仿中的甲醇梯度在硅胶上色谱层析得到所需的产物。FABMS，m/z＝1091(M+H);用50%乙腈/0.05M磷酸二氢铵水溶液在C18反转相HPLC上的保留时间是2.8分钟。(在同样系统中碘代LL-E33288假糖苷配基是7.9分钟)。
实施例10LL-E33288 γI1的3-巯基丁酰肼二硫化物将18毫升(0.26摩尔)硫代乙酸加到17.2克(0.2摩尔)巴豆酸中。在通氩气下将该混合物回流加热6小时。在吸气器真空下除去过量的硫代乙酸，使所得的油溶于100毫升含200μl浓硫酸的无水乙醇中。让该反应物回流10小时，然后在抽气器真空下减少体积。加入己烷，依次用二份饱和的碳酸氢钠和一份水洗涤所得的溶液。然后用硫酸镁干燥该溶液、过滤并减少体积而成油状产物。将该粗产物溶于含于12毫升肼的250毫升甲醇中，将所得的混合物在通氩气下回流10小时。减少反应混合物的体积，然后用Kugelrohr快速蒸馏并用氯仿-己烷的混合物结晶得到3-巯基丁酰肼。
在-15℃下将在1毫升乙腈中的1.5eq3-巯基丙酰肼加到5毫克LL-E33288 γI1在5毫升乙腈中去。加入1当量三乙胺。让反应在0℃下搅拌进行1小时，然后蒸去溶剂。用10-15%在氯仿中的甲醇梯度使残留物进行色谱层析得到所需的产物。FABMS，m/e＝1422(M+H);用43%乙腈/0.05M磷酸二氢铵水溶液在C18反转相HPLC上的保留时间是3.5分钟。(在相同系统中LL-E33288 γI1的保留时间是13.4分钟)。
实施例11LL-E33288 γI1的3-巯基异戊酰肼二硫化物将9毫升(0.13摩尔)硫代乙酸加到10克(0.1摩尔)3，3二甲基丙烯酸中。将该混合物在通氩气下回流加热6小时。在抽气器真空下除去过量的硫代乙酸，将所得的油状产物溶于含有200微升浓硫酸的100毫升无水乙醇中。在加入16毫升肼前让反应回流34小时。在通氩气下让所得的混合物回流24小时。让反应混合物减少体积然后溶于盐水和饱和碳酸氢钠的混合物中。用一定体积的氯仿数次萃取产物。用硫酸镁干燥合并的氯仿层、过滤并减少体积得到油状产物。该油状产物经快速色谱层析用甲醇-氯仿梯度纯化，然后用氯仿-己烷结晶得到3-巯基异戊酰肼。
在-15℃下将在100微升乙腈中的1.5eq 3-巯基异戊酰肼加到15毫克LL-E33288 γI1在5毫升乙腈中去。加入1当量三乙胺作为催化剂。让反应在室温下搅拌进行3小时，然后蒸去溶剂。用10-15%在氯仿中的甲醇梯度在硅胶上色谱层析残留物得到所需的产物。FABMS，m/z＝1436(M+H);用43%乙腈/0.05M磷酸二氢铵水溶液在C18反转相HPLC的保留时间是3.9分钟(在同样系统中LL-E33288 γI1的保留时间是13.4分钟)。
实施例12LL-E33288 γI1的对-巯基二氢肉桂酰肼二硫化物将含有一滴浓硫酸的15毫升甲醇加到500毫克对-巯基二氢肉桂酸中。让反应回流进行5小时，然后冷却至室温。加入肼(1.5毫升)并在通氩气下让所得混合物回流2小时，然后在室温下搅拌10小时。将200毫克的二硫代苏糖醇加入以还原尚存的二硫化物并让反应混合物冷至-15℃。滤得所得的结晶，用醚和甲醇的混合物洗涤，然后在真空炉上干燥150°/5微米/10小时)得到对-巯基二氢肉桂酰肼。
在-15℃下将在1毫升乙腈中的1.5eq对-巯基二氢肉桂酰肼加到25毫克LL-E33288 γI1在25毫升乙腈中的物质中。残留物在硅胶上用10-15%在氯仿中甲醇梯度进行色谱层析得到所需的产品。FABMS，m/z＝1484(M+H);用43%乙腈/0.05M磷酸二氢铵水溶液在C18反转相HPLC上的保留时间是5.4分钟(在相同系统中LL-E33288 γI1的保留时间是13.4分钟)。
实施例13N-乙酰基LL-E33288 γI1的3-巯基异戊酰肼二硫化物在-15℃下将在6.2毫升中的3eq 3-巯基异戊酰肼加到20毫升N-乙酰基LL-E33288 γI1在15毫升乙腈中的物质内。加入1当量三乙胺。让反应在室温下搅拌进行2小时，然后蒸去溶剂。残留物用10-15%在氯仿中的甲醇梯度在硅胶上色谱层析得到所需的产品。用50%乙腈/0.05M磷酸二氢铵水液在C18反转相HPLC上的保留时间是2.5分钟9(在相同系统中N-乙酰基LL-E33288 γI1的保留时间是6.6分钟)。
实施例14N-乙酰基LL-E33288 γI1的3-巯基丁酰肼二硫化物在-15℃下将在5毫升乙腈中的3eq 3-巯基丁酰肼加到10毫克N-乙酰基LL-E33288 γI1在7.5毫升乙腈中的物质内。加入1当量三乙胺。让反应在室温下搅拌进行10小时，然后蒸去溶剂。残留物用10-15%在氯仿中的甲醇梯度在硅胶上色谱层析得到所需的产物。用43%乙腈/0.05M磷酸二氢铵水溶液在C18反转相HPLC上的保留时间是7.3分钟(在同样系统中N-乙酰基LL-E33288 γI1的保留时间是5.6分钟)。
实施例15N-乙酰基LL-E33288 γI1的对-巯基二氢肉桂酰肼二硫化物在-15℃下将在2.0毫升乙腈中的3.0eq对-巯基二氢肉桂酰肼二硫化物加到10毫克N-乙酰基LL-E33288 γI1在7.5毫升乙腈中的物质内。加入1当量三乙胺。让反应在室温下搅拌进行2小时，然后蒸去溶剂。残留物在硅胶上用10-15%在氯仿中的甲醇梯度进行色谱层析得到所需的产物。用43%乙腈/0.05M磷酸二氢铵在C18反转相HPLC上的保留时间是7.3分钟(在同样系统中N-乙酰基LL-E33288 γI1的保留时间是5.6分钟)。
实施例16与蛋白质的非特定配对物在弱碱性条件下将实施例3所述的羟基琥珀酰胺酯共价结合到抗体上。下面是制备列于表7中的抗体配对物的一般过程。抗体在磷酸缓冲液中的浓度为3-5毫克/毫升，该缓冲液含有0.1M氯化钠，pH为7.5，加入5-20倍摩尔过量的实施例3产物，在室温下搅拌反应1-4小时。蛋白质配对物经色谱分离脱盐，聚集蛋白质通过硅胶过滤HPLC而与单体物质分开。将单体部分合并起来并浓缩。
表7用实施例3产品制得的非特定配对物MoAb药物负载M/MLyml5.2B72.36.0B72.36.9实施例17制备特定位点配对值在T.J.Mckearn，etal.美国专利第4，671，958号中阐述了将药物的酰肼衍生物结合到氧化抗体上的一般方法。该方法经如下所述特定修饰已用来制备与实施例4-15的产物结合的抗体配对物。表7中综述了这些反应的产物及其特征。
(A)抗体氧化将浓度为5-10毫克/毫升抗体放在200倍体积的50mM乙酸钠缓冲液中渗析过夜，该缓冲液的pH为5.5它含有0.1M氯化钠(缓冲液A)。渗析后，用15mM-200mM过碘酸在0.2M乙酸钠中的溶液使MoAb氧化。氧化反应在黑暗中4℃下搅拌进行45分钟，在此之后使氧化的MoAb在≥5容积SephadexG-25柱上脱盐。通过使氧化抗体与对-硝基苯肼反应并比较在280mm蛋白质的吸收以及在395mm处对-硝基苯肼的吸收来分析抗体的氧化程度。
(B)药物酰肼配对物使氧化的MoAb与10-200倍量摩尔过量的药物酰肼反应。将酰肼溶于二甲基甲酰胺中并加入MoAb的水溶液。为了避免MoAb析出，二甲基甲酰胺的最后体积不要超过总反应体积的10%。让反应在室温下搅拌进行3小时，为了防止未反应的醛交联及相应的聚集，在加入药物酰肼3小时加入100倍摩尔过量的阻断剂和乙酰肼。为了稳定在醛和药物酰肼(腙)之间的Schiff′s碱的键合，通常加入10mM氰基硼氢化钠，并让反应多进行小时(总的配对时间4小时)使产物还原成烷基肼。配对物经色谱层析脱盐并在pH6.5磷酸缓冲液中完全渗析(最少时间为48小时)以供贮存和试验。
通过凝胶过滤HPLC来分析配对物中聚集物的存在，通过反转相HPLC来分析配对物中游离药物的存在。用抗体和药物两者的衰变消光系数来确定配对物中药物的摩尔浓度从而使药物负载能从光谱学上得到测定。
表7从实施例4的产物中制得的酰肼配对物MoAb制备药物负载M/M
CTM-01＃13.1＃22.3＃32.9MAC-68＃11.7＃23.1＃32.4从实施例5产物中制得的酰肼配对物Lym1＃10.15＃20.76＃33.2表7(续)从实施例6产物中制得的酰肼配对物MoAb制备药物负载(M/M)Lym13.0CT-M-01＃12.4＃22.9从实施例7产物中制得的酰肼配对物Lym12.8Lym21.4B72.3＃12.1＃22.4CT-M-01＃11.6＃23.6
＃32.5＃42.4从实施例9产物中制得的酰肼配对物CT-M-014.8从实施例9产物中制得的酰肼配对物CT-M-013.0从实施例10产物中制得的酰肼配对物Lym13.7从实施例11产物中制得的酰肼配对物MoAb制备药物负载M/MLym16.2从实施例12产物中制得的酰肼配对物Lym13.5实施例18LL-E33288 γI1的对-巯基二氢肉桂酰肼二硫化物将含有一滴浓硫酸的15毫升甲醇加到500毫克(2.75毫摩尔)对-巯基二氢肉桂酸中。让该反应物回流5小时，然后冷却至室温。加入肼(1.5毫升)，在通氩气下使所得的混合物回流2小时，然后在室温下搅拌10小时。加入200毫克的二硫代苏糖醇以还原任何尚存的二硫化物，将反应混合物冷却至-15℃。过滤得到所得的晶体，用醚和甲醇的混合物洗涤，然后在真空炉中(50°/5微米/10小时)干燥得到对-巯基二氢肉桂酰肼。
在-15℃下将在1毫升乙腈中的1.5eq对-巯基二氢肉桂酰肼加到25毫克LL-E33288 CI1在25毫升乙腈中的物质内。让反应在0℃下搅拌反应10小时，然后蒸去溶剂。残留物用10-15%在氯仿中甲醇梯度在硅胶上色谱层析得到所需的产品。FABMS，m/z＝1484(M+H);用43%乙腈/0.05M磷酸二氢铵水液在C18反转相HPLC上的保留时间是5.4分钟(在同样的系统中LL-E33288 γI1的保留时间是13.4分钟)。
权利要求
1.一种式为Q-Sp-SS-W的取代二硫化物，其特征在于它是从式CH3SSS-W化合物制得。这种二硫化物分别称为LL-E33288α1-Br、α-I、α2-Br、α2-I、α3-Br、α3-I、α4-Br、β1-Br、β1-I、β2-Br、β2-I、γ1-Br、γ1-I、d1-I、碘代或溴代假糖苷配基、它们的二氢或N-乙酰基对应物、BBM-1675、FR-900405、FR-900406、PD114759、PD115028、CL-1577A、CL-1577B、CL-1577D、CL-1577E、CL-1724或它们的N-乙酰基对应物，其中
R5是CH3、C2H5或(CH3)2CH；R8是OH，R9是H，或者R8和R9结合在一起成羰基；X是碘原子或溴原子；R5是氢或RCO的基团[其中R是氢或支链或非支链的烷基(C1-C10)或烯基(C1-C10)、芳基或杂芳基，或是芳基-烷基(C1-C5)或杂芳基-烷基(C1-C5)，所有这些都可任意被一个或多个羟基、氨基、羧基、卤(素)、硝基、低级(C1-C3)烷氧基或低级(C1-C5)硫代烷氧基所取代]；Sp是直链或支链的二价或三价(C1-C18)基团，二价或三价芳基或卤代芳基，二价或三价(C3-C18)环烷基或杂环烷基，二价或三价芳基-或杂芳基-烷基(C1-C18)基团，二价或三价环烷基-或杂环烷基-烷基(C1-C18)或是二价或三价(C2-C18)不饱和烷基，其中如果Sp是三价基团，它另外还可被氨基、烷氨基、芳氨基、杂芳氨基、羧基、低级烷氧基、羟基、硫羟基或低级烷基硫代基团所取代；Q是氢、卤素、氨基、烷氨基、二烷氨基、芳氨基、杂芳基氨基、哌啶子基、吡咯烷子基、哌嗪子基、羧基、硝基苯氧基羰基、羧醛基、低级烷氧基、羟基、硫羟基、低级烷基二羧基、-CONHNH2、-NHCONH2、-CSNHNH2或-ONH2；如果Sp是亚乙基，Q不可是氢，当CH3-SSS-W是LL-E33288α1-Br、α1-I、α2-Br、α2-I、α3-Br、α3-1、α4-Br、β1-Br、β1-1、β2-Br、β2-I、γ1-Br、γ1-1、δ1-I、BBM-1675、FR-900405、FR-900406、PD114759、PR115028、CL-1577A。CL-1577B、CL-1577D、CL-1577E或CL-1724且Sp是二价键时，Q不可是氢、卤(素)、氨基、烷氨基、二烷基氨基、芳基氨基、杂芳基氨基、哌啶子基、吡咯烷子基、哌嗪子基或羧基。
2.根据权利要求1所述的式Q-Sp-S S-W(从式CH3S S S-W的化合物中制得)的取代二硫化物，其特征在于其中
R5是CH3、C2H5或(CH3)2CH;X是碘原子或溴原子;R5是氢或是RCO基团(其中R是氢、CH3或单取代的芳基);Sp和Q的定义同上。
3.一种式
的载体药物配对物，其特征在于它是从式CH3-S S S-W的化合物制得，其中CH3-S S S-W是名称为LL-E33288 αBr1、αI1、αBr2、αI2、αBr3、αI3、αBr4、βBr1、βI1、βBr2、βI2、γBr1、γI1、δI1、碘代或溴代假糖苷配基、它们的二氢或N-乙酰基对应物、BBM-1675、FR-900405、FR-900406、PD114759、PD115028、CL-1577A、CL-1577B、CL-1577D、CL-1577E、CL-1724或它们的N-乙酰基对应物的抗肿瘤抗生素，其中W的定义如前所述，它包括使CH3S S S-W与通式Q-Sp-SH的化合物反应，其中Sp是直链或支链的二价或三价(C1-C18)基团，二价或三价芳基或杂芳基，二价或三价(C3-C18)环烷基或杂环烷基，二价或三价芳基-或杂芳基-烷基(C1-C18)，二价或三价环烷基或杂环烷基-烷基(C1-C18)或是二价或三价(C2-C18)不饱和烷基，其中如果Sp是三价基团，它另外还可被氨基、烷氨基、芳氨基、杂芳基氨基、羧基、低级烷氧基、羟基、硫羟基或低级烷硫基，如果CH3-S S S-W是母体抗肿瘤抗生素LL-E33288 α1-Br、α1-1、α2-Br、α2-1、α3-Br、α3-1、α4-Br、β1-Br、β1-1、β2-Br、β2-1、γ1-Br、γ1-1、δ1-1、BBM-1675、FR-900405、FR-900406、PD114759、PP115028、CL-1577A、CL-1577B、CL-1577D、CL1577E或CL-1724本身，Sp不能是二价;Q是，或可被随之转变成卤素、氨基、烷氨基、羧基、羧醛基、羟基、硫羟基、α-卤代乙酰氧基、低级烷基二羧基、-CONHNH2、、-NHCONHNH2、、-NHCSNHNH2、-ONH2、-CON3、
产生了一种式为Q-Sp-SS-W的中间产物，其中Q、Sp和W的定义与前相同，使Q-Sp-SS-W与式为Tu(Y)n的分子反应，(其中载体Tu定义为单克隆或多克隆抗体、它的碎片、它的化学处理或基因处理的对应物，或是生长因子或类固醇;Y是蛋白质的侧链氨基、羧基或硫羟基，从糖蛋白糖类残基中衍生出来的醛基或是酰氨基烷硫基团;n是从1～100的整数)产生了下式化合物
其中Tu、Y、Sp、W和n的定义同前，Z是基团Q和Y直接进行或在连续还原后进行共价反应而形成的，Z是-CONH-、-CONHNHCH-、-NHCONHN＝CH2-、-NHCONHNH＝CH-、-NHCONHNHCH2-、、-NHCSNHN＝CH-、、-NHCSNHNHCH2-、-ON＝CH-、-NH-、-NHCH2-、-N＝CH-、-CO2-、-NHCH2CO2-、-SS-、
m是0.1～15。
4.根据权利要求3所述的式为
的蛋白质-药物配对物，其特征在于它是从名称为LL-E33288(CH3SSS-W)一类的抗肿瘤抗生素中制得的，它包括用式Q-Sp-SH化合物取代二硫代甲基部分，(其中Sp是直链或支链的二价或三价(C2-C10)基团或是二价或三价芳基-或杂芳基-烷基(C2-C5)，其中如果Sp是三价基团，它可另外被氨基、杂芳基氨基、羟基或硫羟基所取代;Q是，或可被随之转化为羧基、低级烷基二羧基酐、-CONHNH2或
产生一个通式Q-Sp-SS-W的中间产物，(其中Q、Sp和W的定义同前)，使Q-Sp-W与式Tu-(Y)n的分子反应，(其中Tu是对人体肿瘤抗原反应敏感的单克隆抗体，Y是抗体上的侧链氨基，或是通过使抗体的糖基氧化成的醛基，n是1～100的整数)产生下式化合物
其中Tu、Y、Sp、W和n的定义与前面的相同，Z是基团Q和Y直接共价反应或在连续还原后进行共价反应而形成的，Z是-CONH-、-CONHN＝CH-、-CONHNHCH2-或是
m是0.1～15。
5.制备式Q-Sp-SS-W的取代二硫化合物的方法，其特征在于它是从式为CH3-SSS-W的化合物制得。该二硫化物分别称为LL-E33288 α1-Br、α1-I、α2-I、α3-Br、α3-I、α4-Br、β1-Br、β1-I、β2-Br、β2-I、γ1-Br、γ1-I、δ1-I、碘代或溴代假糖苷配基、它们的二氢或N-乙酰基对应物、BBM-1675，FR-900405，FR-900406，PD114759、PD115028、CL-1577A。CL-1577B、CL-1577D、CL-1577E、CL-1724或它们的N-乙酰基对应物，其中
R5是CH3、C2H5或(CH3)2CH;R8是OH，R9是H，或者R8和R9一起是羰基;X是碘原子或溴原子;R5是氢或是基团RCO(其中R是氢或支链或非支链的烷基(C1-C10)或烯基(C1-C10)、芳基或杂芳基、或是芳基-烷基(C1-C5)或杂芳基、烷基(C1-C5)，所有这些可任意被一个或多个羟基、氨基、羧基、卤素、硝基、低级(C1-C3)烷氧基、或低级(C1-C5)硫代烷氧基所取代;Sp是直链或支链的二价或三价(C1-C18)基团，二价或三价芳基或杂芳基，二价或三价(C3-C18)环烷基或杂环烷基，二价或三价芳基-或杂芳基-烷基(C1-C18)，二价或三价环烷基-或杂环烷基-烷基(C1-C18)或是二价或三价的(C2-C18)不饱和烷基，其中如果Sp是三价基团，它另外还可被氨基、烷氨基、芳氨基、杂芳基氨基、羧基、低级烷氧基、羟基、硫羟基或低级烷硫基所取代;Q是氢、卤素、氨基、烷氨基、二烷基氨基、芳氨基、杂芳基氨基、哌啶子基、吡咯烷子基、哌嗪子基、羧基、硝基苯氧基羰基、羧醛基、低级烷氧基、羟基、硫羟基、低级烷基二羧基、-CONHNH2、-NHCONHNH2、-CSNHNH2、-NHCSNHNH2或-ONH2;如果Sp是亚乙基，则Q不可为氢;如果CH3-SSS-W是LL-E33288 α1-Br、α1-I、α2-Br、α2-I、α3-Br、α3-I、α4-Br、β1-Br、β1-I、β2-Br、β2-I、γ1-Br、γ1-I、δ1-I、BBM-1675、FR-900405、FR-900406、PD114759、PD115028、CL-1577A、CL-1577B、CL-1577D、CL-1577E或CL-1724，且Sp是二价时，Q不可为氢、卤素、氨基、烷氨基、二烷基氨基、芳氨基、芳杂氨基、哌啶子基、吡咯烷子基、哌嗪子基或羧基;该方法包括在乙腈和四氢呋喃的混合物或在乙腈和二甲基甲酰胺的混合物中，在-20℃～+40℃温度下，最好在1当量的叔胺碱或者在1当量叔胺碱和1当量有机羧酸混合物的存在下，使从上面得到的一种甲基三硫化物抗肿瘤抗生素与适当取代的硫醇反应1小时至6天。
6.制备式CH3-SSS-W化合物的靶衍生物的方法
(其中CH3-SSS-W是抗肿瘤抗生素LL-E33288 αBr1、αI1、αBr2、αI2、αBr3、αI3、αBr4、βBr1、βI1、βBr2、βI2、γI1、δI1、碘代或溴代假糖苷配基、它们的二氢或N-乙酰基对应物、BBM-1675、FR-900405、FR-900406、PD114759、PD115028、CL-1577A、CL-1577B、CL-1577D、CL-1577E、CL-1724或它们的N-乙酰基对应物)，其特征在于它包括在乙腈中在1当量三乙胺或1当量三乙胺和1当量乙酸存在下在-10℃～-30℃温度下使CH3-SSS-W与或Q-Sp-SH反应1～48小时，其中Sp是直链或支链的二价或三价(C1-C18)基团，二价或三价芳基或芳杂基，二价或三价(C3-C18)环烷基或杂环烷基，二价或三价芳基-或杂芳基-烷基(C1-C18)，二价或三价环烷基-或杂环烷基-烷基(C1-C18)或者二价或三价(C2-C18)不饱和烷基，其中如果Sp是三价基团，它另外可被氨基、烷氨基、芳氨基、芳杂氨基、羧基、低级烷氧基、羟基、硫羟基或低级烷基硫代基所取代，如果当CH3-SSS-W是抗肿瘤抗生素LL-E33288 α1-Br、α1-I、α2-Br、α3-I、α3-Br、α3-I、α4-Br、β1-Br、β1-I、β2-Br、β2-I、γ1-Br、γ1-I、δ1-I、BBM-1675、FR-900405、FR-900406、PD114759、PD115028、CL-1577A、CL-1577B、CL-1577D、CL-1577E或CL-1724母体时，则Sp不可是二价;Q是卤素、氨基、烷氨基、羧基、羧醛基、羟基、低级烷基二羧基醛基、-CONHNH2、-NHCONHNH2、NHCSNHNH2、-ONH2或
将式为Q-Sp-SS-W的中间产物分离出来，(其中Q、Sp和W的定义同前)，然后在pH6.5～9的缓冲水溶液中在4～40℃下直接反应或在水溶性碳化二亚胺存在下使式Q-Sp-SS-W(其中Sp和W的定义同前，Q是卤素、氨基、烷氨基、羧基、羧醛基、羟基或低级烷基二羧醛基)与式Tu-(Y)n的分子反应(其中Tu是单克隆或多克隆抗体、它的碎片、它的化学处理或基因处理对应物或生长因子或类固醇，Y是侧链的氨基或羧基官能团;n是1～100)，产生化合物
其中Tu、Sp、W、n和Y的定义同前，m是1～15，Z是由基团Q和Y共价反应而形成的，它是-CONH-、-NH-、
-N＝CH-或是-CO-;或者在诸如碳化二亚胺的羧基活化剂存在下使式Q-Sp-SS-W(Sp和W的定义同前，Q是羧酸)化合物与N-羟基琥珀酰亚胺、2，3，5，6-四氟苯酚、五氟苯酚或4-硝基苯酚反应产生式Q-Sp-SS-W的化合物(其中Sp和W的定义同前，Q是
并在pH6.5～9之间的缓冲水溶液中在4℃～40℃间的温度下与Tu-(Y)n的分子(其中Tu和n的定义同前，Y是侧链氨基)进行反应产生式为
的化合物，其中Tu、Sp、Y和n的定义同前，m是1～15，Z是在Q和Y间共价反应而形成的并定义为-CONH-;或者，使式Q-Sp-SS-W的化合物(其中Sp和W的定义同前，Q是-CONHNH)与硝酸在乙腈水溶液中反应产生式Q-Sp-SS-W的化合物，(其中Sp和W的定义同前，Q是-CON3)，使之与式Tu-(Y)n反应(其中Tu、Y和n的定义同前)产生下式化合物
其中Tu、Z、Sp、W、m、Y和n的定义同前;-或者，使式Q-Sp-SS-W的化合物(其中Sp和W的定义同前，Q是羟基)与α-卤代乙酸酐反应产生一个Q是α-卤代乙酰氧基的化合物，在pH4.5和7之间的缓冲水溶液条件下在4～40℃之间温度下使α-卤代乙酰氧基-Sp-SS-W或式为Q-Sp-SS-W(其中Sp和W定义同前，Q则如下式所示
化合物与一摩尔式Tu-(Y)n反应(其中Tu的定义同前、Y是蛋白质的侧链硫醇或是在Tu的胺上引入的酰氨基烷硫基，它是通过先用诸如3-(2-二硫代吡啶基)丙酸羟基琥珀酰亚胺酯试剂然后用诸如二硫苏糖醇还原而引入的;或是用2-亚氨基巯基烷(2-imunothlane)在Tu的胺上引入一个酰氨基烷基硫基。n是1～10)产生下式化合物
其中Tu、Sp、W和n的定义同前，Z是基团Q和Y共价反应而形成
n是0.1～10;或者，在pH4.0和6.5之间的缓冲水溶液中在4℃～40℃温度下使式Q-Sp-SS-W化合物(其中Sp和W的定义同前，Q是-NH、-CONHNH、-NHCONHNH、-NHCSNHNH或-ONH)与式为Tu-(Y)n的分子(其中Tu的定义同前，Y是在碱土过磺酸盐存在下使Tu上糖类残基氧化而成的醛基，n是1～20)产生下式化合物
(其中Tu、Sp、W、Y和n的定义同前，Z是Q和Y共价反应而形成的，它是-ON＝CH-、-N＝CH-、-CONHN＝CH、-NHCONHN＝CH-或-NHCSNHN＝CH-、m是0.1～15);或者在pH4.0和6.5之间的缓冲水溶液中在4℃～40℃下马上用乙酰肼或酪氨酸肼处理下式化合物Tu-Z-Sp-SS-W)m(Y)n-m(其中Tu、Z、Sp、W、Y、n和m的定义同上)产生下式化合物Tu-(Z-Sp-SS-W)m(Y)n-m(其中Tu、Z、Sp、W、n和m的定义同上，Y是-CH NHCOCH3或
以及在pH为4.9～6.5的缓冲水溶液中，在4～40℃温度下，使该化合物与氰基硼氢化钠或硼氢化钠反应产生下式化合物其中Tu、Sp、W、m和n的定义同上，Z是-NH-CH2-、-CONHNHCH2-、-NHCONHNHCH2-或-NHCSNHNHCH2-，Y是-CH2NHNHCOCH3或者
7.一种治疗恒温动物细菌感染的方法，其特征在于它包括给所述的动物使用式为Q-Sp-SS-W的二硫化取代类似物的有效抗菌剂量，这种二硫化取代类似物从式为CH3-SSS-W化合物制备，分别称为LL-E33288 α1-Br、α1-I、α2-Br、α2-I、α3-Br、α3-I、α4-Br、β1-Br、β1-I、β2-Br、β2-I、γ1-Br、γ2-I、δ1-I、溴代假糖苷配基、它们的二氢或N-乙酰基对应物、BBM-1675、FR-900405、FR-900406、PD114759、PD115028、CL-1577A、CL-1577B、CL-1577D、CL-1577E、CL-1724或它们的N-乙酰基对应物，其中，
R5是CH3、C2H5或(CH3)2CH;R8是OH，R9是H或者R8和R9一起是羰基;X是碘或溴原子;R5是氢或基团RCO(其中R是氢或支链或非支链烷基(C1-C10)或烯基(C1-C10)、芳基或杂芳基或是芳基-烷基(C1-C5)或杂芳基-烷基(C1-C5)，这些都可任意被一个或多个羟基、氨基、羧基、卤素、硝基、低级(C1-C5)烷氧基或低级(C1-C5)硫代烷氧基所取代;Sp是直链或支链二价或三价(C1-C18)基团，二价或三价芳基或杂芳基，二价或三价(C3-C18)环烷基或杂环烷基，二价或三价芳基-或芳杂基-烷基(C1-C18)，二价或三价环烷基-或杂环烷基-烷基(C1-C18)或是二价或三价(C2-C18)不饱和烷基，其中，如果Sp是三价基团，它另外可被氨基、烷氨基、芳氨基、芳杂氨基、羧基、低级烷氧基、羟基、硫羟基或低级烷基硫代基团所取代;Q是氢、卤素、氨基、烷氨基、二烷基氨基、芳氨基、杂芳氨基、哌啶子基、吡咯烷子基，哌嗪子基、羧基、硝基、硝基苯氧基羰基、羧醛基、低级烷氧基、羟基、硫羟基、低级烷基二羧基、-CONHNH2、-NHCONHNH2、-CSNHNH2、-NHCSNHNH2或-ONH2;如果Sp是亚乙基时，Q不可是氢，当CH-SSS-W是E33288 α1-Br、α1-I、α2-Br、α2-I、α3-Br、α3-I、α4-Br、β1-Br、β1-I、β2-Br、β2-I、γ1-Br、γ1-I、δ1-I、BBM-1675、FR-900405、FR-900406、PD114759、PD115028、CL-1577A、CL-1577B、CL-1577D、CL-1577E或CL-1724且Sp是二价时，Q不能是氢、卤(素)、氨基、烷氨基、二烷基氨基、芳氨基、杂芳氨基、哌啶子基、吡咯烷子基、哌嗪子基或羧基。
8.一种在哺乳动物中抑制肿瘤生长的方法，它包括给所述的哺乳动物使用式为Q-Sp-SS-W的二硫化取代物的抗肿瘤有效量该二硫代取代物从式为CH-SSS-W从化合物制得，并分别称为LL-E33288 α1-Br、α1-I、α2-Br、α2-I、α3-Br、α3-I、α4-Br、β1-Br、β1-I、β2-Br、β2-I、γ1-Br、γ1-I、δ1-I、碘代或溴代假糖苷配基、它们的二氢或N-乙酰基对应物。BBM-16757。FR-900405、FR-900406、PD114759、PD115028、CL-1577A、CL-1577B、CL-1577D、CL-1577E、CL-1724或它们的N-乙酰基对应物，其中
R5是CH3，C2H5或(CH3)2CH;R8是OH，R9是H或者R8和R9一起是羰基;X是碘或溴原子;R5是氢或基团RCO(其中R是氢或支链或非支链烷基(C1-C10)或烯基(C1-C10)、芳基或杂芳基或是芳基-烷基(C1-C1)或杂芳基-烷基(C1-C5)，这些都可任意被一个或多个羟基、氨基、羧基、卤素、硝基、低级(C1-C3)烷氧基或低级(C1-C5)硫代烷氧基所取代，Sp是直链或支链二价或三价(C3-C18)基团，二价或三价芳基或杂芳基，二价或三价(C3-C18)环烷基或杂环烷基，二价或三价芳基-或杂芳基-烷基(C1-C18)，二价或三价环烷基-或杂环烷基-烷基(C1-C18)或是二价或三价(C2-C18)不饱和烷基、其中，如果Sp是三价基团它另外可被氨基、烷氨基、芳氨基、杂芳氨基、羧基、低级烷氧基、羟基、硫羟基或低级烷基硫基团所取代;Q是氢、卤素、氨基、烷氨苯、二烷基氨基、芳氨基、杂芳氨基、哌啶子基、吡咯烷子基、哌嗪子基、羧基、硝基苯氧基羰基、羧醛基、低级烷氧基、羟基、硫羟基、低级烷基二羰基、-CONHNH2、-NHCONHNH2、-CSNHNH2、-NHCSNHNH2或-ONH2;如果Sp是亚乙基时，Q不可是氢、当CH3-SSS-W是LL-E33288 α1-Br、α1-I、α2-Br、α2-I、α3-Br、α3-I、α4-Br、β1-Br、β1-I、β2-Br、β2-I、γ1-Br、γ1-I、δ1-I、BBM-1675、FR-900405、FR-900406、PD114709、PD115028、CL-1577A、CL-1577B、CL-1577D、CL-1577E或CL-1724且Sp是二价时，Q不能是氢、卤(素)、氨基、烷氨基、二烷基氨基、芳氨基、杂芳氨基、哌啶子基、吡咯烷子基、哌嗪子基或羧基。
9.一种在哺乳动物中抑制肿瘤生长的方法，其特征在于它包括给哺乳动物使用式为
产物的抗肿瘤剂量，它是从式CH3-SSS-W的化合物中制得，其中CH3-SSS-W是名称为LL-E33288 αBr1、αI1、αBr2、αI2、αBr3、αI3、αBr4、βBr1、βI1、βBr2、βI2、γBr1、γI1、δI1、碘代或溴代假糖苷配基、它们的二氢或N-乙酰基对应物，BBM-1675、FR-900405、FR-900406、PD114759、PD115028、CL-1577A、CL-1577B、CL-1577D、CL-1577E、CL-1724或它们的N-乙酰基对应物的抗肿瘤抗生素，它包括使CH3-SSS-W与通式Q-Sp-SH的化合物反应，(其中Sp是直链或支链的二价或三价(C1-C18)基团，二价或三价芳基或杂芳基，二价或三价(C3-C18)环烷基或杂环烷基，二价或三价芳基-或杂芳基-烷基(C1-C18)，二价或三价环烷基或杂环烷基-烷基(C1-C18)或是二价或三价(C2-C18)不饱和烷基，其中如果Sp是三价基团，它另外还可被氨基、烷氨基、芳氨基、杂芳基氨基、羧基、低级烷氧基、羟基、硫羟基或低级烷硫基，如果CH3-SSS-W是抗肿瘤抗生素LL-E33288 α1-Br、α1-I、α2-Br、α2-I、α3-Br、α3-I、α4-Br、β1-Br、β1-I、β2-Br、β2-I、γ1-Br、γ1-I、δ1-I、BBM-1675、FR-900405、FR-900406、PD114759、PD115028、CL-1577A、CL-1577B、CL-1577D、CL-1724的母体，Sp不能是二价;Q是，或可被随之转变成卤素、氨基、烷氨基、羧基、羧醛基、羟基、硫羟基、α-卤代乙酰氧基、低级烷基二羧基、-CONHNH2、-NHCONHNH2、-NHCSNHNH2、-ONH2、-CON3
产生了一种式为Q-Sp-SS-W的中间产物，其中Q、Sp和W的定义与前相同。使Q-Sp-SS-W与式为Tu-(Y)m的分子反应，(其中Tu定义为单克隆或多克隆抗体、它的碎片，它的化学处理或基因处理的对应物，或是生长因子或类固醇;Y是蛋白质的侧链氨基、羧基或硫羟基，从糖蛋白糖类残基中衍生出来的醛基或是酰氨基烷基硫代基团;n是从1～100的整数)产生了下式化合物
其中Tu、Y、Sp、W和n的定义同前，Z是基团Q和Y直接进行或在还原后进行共价反应的而形式的，Z是-CONH-、-CONHN＝CH-、-CONHNHCH2-、NHCONHN＝CH-、-NHCONHNHCH2-、-NHCSNHN＝CH-、-NHCSNHNHCH2-、-OH＝CN、-NH-、-NHCH2-、-N-CH-、-CO2-、-NHCH2CO2-、-SS-、
m是0.1～15、
10.体内抗原位点处传递化合物的方法，包括给哺乳动物使用式
的蛋白质-药物配对物的有效抗肿瘤剂量，它是从称为N-乙酰基LL-E33288 δI1(CH3SSS-W)的抗肿瘤抗生素中制得，N-乙酰基LL-E33288 δI1(CH3SSS-W)具有a)图1所示的紫外光谱;b)图2所示的红外光谱;c)图3所示的质子核磁共振光谱;以及d)图4所示的C-13核磁共振光谱;或从称为碘代LL-E33288假糖苷配基的抗肿瘤抗生素中制得，磺代LL-E33288假糖苷配基(CH3SSS-W)具有a)图5所示的紫外光谱;b)图6所示的红外光谱;c)图7所示的质子核磁共振光谱;以及d)图8所示的碳-13核磁共振光谱;包括用式为Q-Sp-S的化合物取代二硫代甲基部分(其中Sp是直链或支链的二价或三价(C2-C5)基团或是二价或三价芳基-或杂芳基-烷基(C2-C5)，其中如果Sp是三价基团，它可另外被氨基、杂芳氨基、羟基或硫醇基所取代;Q是，或可被接下去转化成羧基、低级烷基二羧酸酐、-CHNHNH2或
产生通式为Q-Sp-SS-W的中间产物(其中Q、Sp和W的定义如前所述)使Q-Sp-SS-W与式为Tu-(Y)n的分子反应，(其中Tu是对人体肿瘤抗原反应敏感的单克隆抗体，Y是抗体的侧链氨基，或是将抗体的糖基团氧化而成的醛基，n是1～100的整数)产生了下式化合物
其中Tu、Y、Sp、W和n的定义同前，Z是将基团Q和Y直接共价反应或还原反应后共价反应而形成的，Z是-CHNH-、-CONHN＝CH、-CONHNHCH2-或
m是0.1～15。
全文摘要
本发明阐述了抗肿瘤剂和抗生素的二硫化物类似物，它们称为LL-E33288复合物；以及一种从二硫化物类似物中形成的载体-药物配对物和从配对物中形成的载体-药物的靶形式的方法。
文档编号C07H15/20GK1046333SQ9010210
公开日1990年10月24日 申请日期1990年4月14日 优先权日1989年4月14日
发明者乔治·A·伊莱斯苔德, 威廉·詹姆斯·麦克加仑, 马丁·莱昂·萨西弗, 菲利普·R·汉曼, 洛伊·M·西门, 詹尼斯·厄普斯拉克斯 申请人:美国氰胺公司