一种b区部分缺失型重组人凝血因子ⅷ的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程药物生产领域。通过对全长凝血因子VID (coagulation factor VH，F VH )的改造，得到了 B区部分缺失型的基因重组人凝血因子VH (recombinant human F VDI，rhF VID)。实验证明，通过与B区完全缺失型的rhF VID进行比较，该B区部分缺失 型产品具有结构更稳定的特性，有望被开发成为治疗甲型血友病的一种新型rhF VDI产品。
【背景技术】
[0002] 血友病（Hemophilia)，是由于血液中缺少某些凝血因子而导致患者产生严重凝 血障碍的遗传性出血性疾病。该病分为四种类型：甲型、乙型、丙型及后来发现的vWF因子 (vonwillibrandfactor)缺乏的血管性假血友病。其中甲型血友病又称凝血因子VDI缺乏 症，发病率为80%，其首选治疗药物为F VIL
[0003] (一）F VID的分子结构。
[0004] F VID mRNA长9kb，编码一条由2351个氨基酸组成的前体多肽.去除N端19个残 基的信号肽后，成熟蛋白质由2332个氨基酸组成，分子量为280kDa。F VID蛋白含有3个结 构区：
[0005] A区：由3个片段组成，在F VDI氨基末端出现2次，在羧基末端出现1次，每个A区 均含有约330个氨基酸；
[0006] B区：为含有908个氨基酸的中间片段，在凝血激活过程中无需B区的活化；
[0007] C区：2个片段，在F VDI的羧端部分出现2次，每一 C结构域含有约150个氨基酸。
[0008] 3个区的排列顺序为A1-A2-B-A3-C1-C2, F VID蛋白由两条肽链组成，A1-A2-B或 A1-A2组成重链，分子量为90~200kDa不等；A3-C1-C2组成轻链，分子量为80kDa。
[0009] (二）F VID的生产技术。
[0010] F VDI的生产技术目前有两种：血浆提纯以及基因工程方法制备。
[0011] 1.血源性凝血因子VIL
[0012] 血浆提纯的产品存在血浆制品带来的感染严重致病微生物的可能性、危险性。
[0013] 目前我国生产的均为血楽提纯的血源性F VH (plasma-derived F VH，pd F VH )，而 由于受到原料血浆供应的限制和血浆提纯技术的限制，国内F VID年产仅约6000~7000万 单位，导致国内F VDI供应持续紧张，连抢救用药都无法满足。
[0014] 2.基因重组人凝血因子VIL
[0015] 基因工程方法制备的rhF VDI从培养的真核细胞（中国仓鼠卵巢细胞）中表达，是 无菌、稳定、高纯度的生物制品，其效果与PdF VDI相同，且无血源污染的危险，目前在西方国 家应用越来越广泛。
[0016] 目前已上市的rhFW分为全长野生型以及B区缺失型两类。全长野生型产品分子 较大，分子量为280kDa，表达率低，在特异活性及使用成本等方面均不能满足人们的需要； 进一步研究发现，B区的缺失对F VDI的体内外活性均无影响，且B区缺失型rhF VDI的的分 子量为170kDa，其表达水平较全长型高5-10倍，稳定性亦显著提高，极大降低了制备难度 和成本。目前我国已进口的rh F VDI有三个产品：拜科奇一Kogenate FS(Bayer)、百因止一 Advate (Baxter公司）以及任捷一Xyntha (Wyeth)，其中Xyntha为B区完全缺失型rhF VIL
[0017] 本发明人在研究中发现，B区完全缺失型rhF VDI产品在超过100倍稀释时，会出现 活性降低，活性约损失30 %，收率只有50 %~70 %，而全长rh F VDI产品的稀释过程不存在 此问题。考虑B区可能在增强rh FW产品水溶液的稳定性方面有一定作用，我们在研究中， 经过筛选保留B区的部分氨基酸得到一种新型的B区部分缺失型rh F VIfl，结果显示，本品的 目的蛋白表达率、结构稳定性以及水溶液中稀释稳定性均有明显提高，能进一步降低制备 rhF VID的难度，提高收率，降低生产成本。
【发明内容】
[0018] 本发明涉及一种重组人凝血因子VID的制备。
[0019] 从已知高表达人F VID (hF VID )的人胎儿肝脏cDNA Lambda噬菌体文库中扩增hF VID 基因，并以此作为模板，以其特异引物进行PCR扩增获得全长的hF VDI的基因片段；通过引物 设计和PCR的方法，获得B区完全缺失的rh F VIfl目的基因和B区部分缺失的rh F VIfl目的基 因。
[0020] 以上目的基因与pMSG载体分别经限制性内切酶NheI和XhoI双酶切后进行连接， 从而获得重组质粒PMSG-BDDhFVIII。
[0021 ] 将该重组质粒与pDCHIP表达质粒共转染到CHO细胞中，经过条件培养基筛选获得 rhF VDI高表达细胞株，然后在5L细胞培养罐连续培养7天，经过离心，采用一步抗体亲和层 析、以及离子交换层析的方法最终获得纯度大于98%的目的蛋白。
[0022] 经测试，本发明的B区部分缺失型rhF VID的生物学活性同B区完全缺失型rhF VID 基本一致，并且稀释稳定性和冻融稳定性有了明显提高。
【附图说明】
[0023] 图1是B区完全缺失的rhF VID引物设计图；
[0024] 图2是B区部分缺失的rhF VID引物设计图。
【具体实施方式】
[0025] 以下实例仅是对本发明的说明，而不会对本发明产生任何限制。
[0026](一）生产细胞株的获得和培养。
[0027] I. CH0-DG44 细胞。
[0028] 中国仓鼠细胞-二氢叶酸还原酶（dhfr)缺陷性突变体DG44与二十世纪八十年代 早期使用的DXBll突变细胞系类似。该细胞的生长需要次黄嘌呤（或腺嘌呤）、甘氨酸和 胸腺嘧啶，而且与所有CHO细胞一样，它们生长也需要脯氨酸。它的优点在于不含有内源性 dhfr序列，可被dhfr基因转化，便于阳性转化子的筛选。转化了 dhfr基因的细胞株，通常 会用不含核苷酸和脱氧核苷酸的-MEM培养基筛选出dhfr阳性转化子。由于DG44是双缺 失突变体，其中不含有仓鼠的dhfr基因，因而该细胞被导入dhfr基因时不存在背景干扰。 其培养方法如下。
[0029] CH0-DG44细胞使用含有10% cFBS的a -MEM培养基（含核苷酸和脱氧核苷酸） 接种于6-孔板中培养，细胞密度达到2 X 106/孔后，再按照3 X 105/孔的细胞密度进行传 代培养。
[0030] 2. B区完全缺失型重组人凝血因子VID表达质粒构建。
[0031] 本项目采用pMSG载体作为重组人凝血因子VDI的表达载体。通过三次PCR获得 B区缺失的人凝血因子VID基因片段。采用限制性内切酶NheI和XhoI分别将B区缺失的 hF VID cDNA片段与pMSG真核表达载体进行双酶切，T4连接酶将其连接后，转化至克隆菌株 JM109中，再对经筛选的单克隆重组质粒进行目的基因测序，目的基因测序结果与理论序列 一致，完成B区缺失型pMSG-hF VID重组真核表达载体的构建。具体构建方法如下。
[0032] B区缺失的hF VID目的基因获得。
[0033] 2. I. 1引物设计。
[0034] 1)首先在全长的hF VDI cDNA两端设计两条引物primer-Ι和primer-2 ;然后分别 在重链两端设计了两条引物primer-3 (含有NheI酶切位点）和primer-4,在轻链的两端设 计了两条引物primer-5和primer-6 (含有XhoI酶切位点）；primer_4和primer-5基因设 计重叠区域。具体位置如图1所示。
[0035] 2)为了提高外源基因的表达量，在基因起始密码子前面，即引物3的序列上设置 了 Kozak 序列（GCCACC)。
[0036] 3)所用到的引物序列如下：
[0037] primer-Ι :5' -ATG CAA ATA GAG CTC TCC ACC-3'，
[0038] primer-2 :5' -TCA GTA GAG GTC CTG TGC C-3'
[0039] primer-3 :5' -CTA GCT AGC CAC CAT GCA AAT AGA GCT CTC CAC C-3'（划线部分为 NheI酶切位点，粗体部分为Kozak序列）
[0040] primer-4 :5' -GGC GTT TCA AGA CTG GTG GAT TCT GGG AGA AGC-3'
[0041] primer-5 :5' -CCA TTG AAC CAA GAA GCT TCT CCC AGA AT-3'
[0042] primer-6 :5' -CCG CTC GAG TCA GTA GAG GTC CTG TGC C-3'（划线部分为 XhoI 酶切 位点）。
[0043] 2. I. 2PCR 扩增 B 区缺失的 hF VID cDNA。
[0044] (1)第一次 PCR。
[0045] 利用Wizard势Lambda Preps DNA纯化试剂盒提取Lambda嗤菌体DNA。以提取的 Lambda嗤菌体DNA作为模板，以primer-Ι和primer-2为引物，米用PfuTufbo1? DNA聚合酶， 进行第一次PCR反应，扩增条件为